CN105343120A - Amo-103在制备治疗心律失常药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了AMO-103在制备治疗心律失常中促进hERG表达的药物组合物中的应用；以及一种治疗心律失常的药物组合物，其特征在于含有AMO-103。

Description

AMO-103在制备治疗心律失常药物中的应用

技术领域

本发明涉及AMO-103在制备治疗心律失常药物中的应用，更具体地说，本发明涉及AMO-103在制备治疗心律失常中促进hERG表达的药物中的应用。

背景技术

长QT综合征(longQTsyndrome，LQTS)指具有心电图上QT间期延长、T波异常、易产生室性心律失常，尤其是尖端扭转型室性心动过速(TDP)、晕厥和猝死的一组综合征。迄今为止已发现的致病基因有20个。其中HERG基因突变降低了心肌复极外向电流I_k1，使心室肌复极延迟，QT间期延长。hERG突变导致遗传性长QT占总突变的45％，为第二常见突变基因。hERG基因突变参与遗传性2型长QT发病的病理生理过程。hERG基因位于7号染色体上，在心脏中表达编码快速激活延迟整流钾通道的α亚单位，在动作电位3期复极化过程中起重要作用。目前已经发现300多个hERG突变位点可致遗传性长QT综合征。大多数HERG基因突变引起HERG蛋白在细胞内的转运障碍，使之无法在膜上表达或表达缺陷，导致I_k1离子流减低。此外，获得性长QT综合征可以被诸多药物如III类抗心律失常药所诱发，临床上更常见。

hERG蛋白是抗心律失常药物的重要作用靶点，同时也是致室性心律失常的重要位点。因此更好的理解hERG相关LQTS的发病机制将有助于针对LQTS病人寻找新的治疗方向。

miRNA由长约21～25个核苷酸的单链RNA分子构成，属于非编码RNA家族。miRNA与特定信使RNA(mRNA)结合，调节特定mRNA的蛋白质翻译过程，从而调控基因表达。多数miRNA以沉默复合体(RNAinducedsilencingcomplex，RISC)的形式与靶mRNA特异性结合，通过降解mRNA或者抑制mRNA的翻译使靶基因沉默，在真核生物的很多基因的转录后调控过程中发挥重要作用。其靶基因参与体内众多生物过程，如细胞增生、分化、发育、凋亡等。近些年研究表明miRNAs在很多心脏疾病发病过程中表达改变，这其中包括心律失常。miRNAs水平的改变可导致相应离子通道功能紊乱从而引起离子通道疾病。例如已有研究证明miR-1可作用于缝隙连接通道蛋白及内向整流钾通道的α亚单位从而降低心脏功能及引起缺血性心律失常。而过表达miR-17-5p可抑制很多内质网应激相关分子伴侣的表达从而引起hERG转运障碍。因此miRNA在临床上可用作诊断标记物及治疗靶标。运用与相应miRNA互补的寡核苷酸序列AMOs可抑制相应miRNA的功能。研究发现在数种病理条件下心律失常的发生与miRNA-1表达上调有关，而AMO-1可抑制miRNA-1对心脏的毒害作用，使其作为缺血性心律失常潜在的治疗手段成为可能。

发明内容

现在没有药物在治疗心律失常中用于促进hERG表达。hERG基因在心脏中表达编码快速激活延迟整流钾通道的α亚单位，在动作电位3期复极化过程中起重要作用。本发明人利用生物信息学网站-RegRNA网站(http://regrna.mbc.nctu.edu.tw)，输入已确定的靶基因hERG，根据相应的比分值，并经blast比对，预测出6个与hERG相关的miRNA：选定miR-103，并依据其核苷酸序列制成反义核苷酸AMO-103。在进行干预实验时，发现AMO-103能够在阻止心律失常时促进hERG的表达，从而完成了本发明。

微小miRNA是一类长度为22nt左右的高度保守的内源性小分子非编码RNA，通过与靶基因的结合，对靶基因进行切割或翻译抑制。已报道30％基因受miRNA调控。目前的研究表明miRNA表达异常可以通过影响离子通道的表达，近而导致离子通道病的发生。miRNA介导的基因调控是转录后一个重要的调控过程。但是明确miRNA的靶基因以及它们的功能一直是miRNA研究领域的主要任务。有报道miR-212可以下调Kir2.1表达，明显改变I_k1的密度。研究已证明hERG基因编码快速激活延迟整流钾通道，在心脏的复极化过程中起着重要作用，hERG基因功能的改变可以QT间期的延长，导致心律失常。miR-103作为microRNA家族中重要的一员，不仅在子宫内膜癌、卵巢癌、白血病、胰腺癌、膀胱癌等多种肿瘤中发挥调控作用，且在糖脂代谢、无脑畸形的发病等方面有着潜在的作用。然而miRNAs与hERG基因功能改变是否相关至今尚不清楚。这篇文章从miRNA水平研究LQT2发病机制，从新的角度认识LQT2的病理生理过程。

我们的研究表明miR-103负性调控hERG基因的表达。首先利用生物信息学预测好hERG相关的6个miRNAs。其次，双萤光素酶报告基因显示miR-103与hERG3′-UTR或者编码区有结合位点，而miR-147和miR-185无结合位点。实验中过表达hERG的蛋白及mRNA水平降低。蛋白降解可能是因为mRNA降解或者抑制其翻译所致。多数miRNA与目的mRNA不能完全结合导致，作用的结果是抑制目的蛋白的合成，而不是降解把目标。我们的试验中miRNA导致hERG蛋白降解和mRNA降低的水平相一致，可能是高度匹配的结果。AMO-103纠正了miR-103对hERG表达的抑制作用。最终激光共聚焦实验与qRT-PCR及Westernblot、膜片钳实验结果相一致。因此表明miR-103可以作用于hERG。如外，对应的AMOs减弱或纠正miRNAs对hERG的抑制作用表明我们可以通过干扰技术来影响miRNAs对hERG基因的作用。

hERG基因编码的通道蛋白在内质网内合成，初步折叠加工后转运致高尔基体进行进一步加工，成熟后转移至细胞膜发挥作用。hERG蛋白在内质网和高尔基体内要进行两步糖基化过程，任意一合成环节出现异常均会影响膜蛋白合。我们实验表明miR-103可以抑制hERG通道蛋白表达，导致QT间期延长。

文献报道有很多分子包括蛋白激酶C、磷脂酰肌醇等可以上调hERG通道蛋白功能，蛋白激酶A及蛋白激酶B介导的磷酸化可减低hERG电流幅度。HEK293T细胞系里激活蛋白激酶C途径直接抑制了hERG电流。研究已证明抑制表皮生长因子受体激酶后，hERG电流幅度也会减小。然而，这些调控机制仍然缺乏特异性，其同时可改变其它离子通道的门控或者动力学特征。最近有研究证明KCNH2基因转录本上游一个TG重复的多态性位点负性调控hERG的转录，并且导致QT间期延长。鉴于hERG在心脏离子通道活动过程中起着非常重要的作用，对KCNH2基因有关电生理层面更深入的研究仍然十分必要。

LQT2综合征的发病机制可能试剂数种miRNA的调控，我们证实了miR-103就是其中一种。传统的治疗手段对LQT2的疗效有限，而基因治疗早已成为医学界的期待。我们之前的研究表明E637K电流及恢复其动力学特征可以被siRNA纠正。因此AMO-103可以作为遗传性或者获得性LQT2的新的特异性治疗方案。我们后续的实验将在动物心室肌细胞中验证这些miR-103对hERG的调控作用。

具体实施方式

材料与方法

1.1实验仪器与试剂

1.1.1主要实验仪器

表1实验仪器名称和生产厂家

1.1.2实验药品和试剂

表2实验药品名称和生产厂家

实验方法

1.1.3

实时荧光定量PCR

用Trizol试剂从已转染的U2OS细胞中提取总RNA。将RNA随后用无菌的Rnase-free处理，hERG基因mRNA的水平使用Taqman探针评估与qRT-PCR检测。引物和探针是来自ABI公司cat.#4331182(编号：Hs04234270-gl)。反转录条件设定为初始步骤在95℃10分钟，随后在95℃15秒40个循环，并在60℃下维持1分钟。实时PCR反应独立重复进行三次。结果用2-ΔΔCT相对定量方法分析。

Westernblot

提取hERG蛋白的步骤免疫印迹分析按先前描述的。简而言之，首先转染pcDNA-hERG到U2OS细胞中。所表达的hERG细胞进一步转染各自的miRNA或miRNA加上相应的AMOs。转染48小时后收获细胞。将等量的蛋白灌注在已制备好的7.5％SDS聚丙烯酰胺凝胶上，然后转移到硝酸纤维素膜上。膜封闭用5％的脱脂奶粉，接着用兔多克隆抗hERG的抗体在4℃下孵育过夜。在TBST中将膜洗涤三次，然后在室温下用山羊抗兔IgG孵育1小时。印迹处理用SuperSignalWestPico化学发光底物(PierceBiotechnology公司，美国)，并使用Syngene公司的成像系统。

实验表明，我们采用生物信息学预测反向筛选联合双荧光素酶报告基因、qRT-PCR、Westernblot、激光共聚焦及膜片钳技术筛选出了miR-103可以抑制hERG通道蛋白的表达，而AMO-103可以解救miR-103对hERG的影响。我们的实验对从miRNA的水平来认识hERG蛋白的调控机制及用基因治疗的方法在LQTs临床应用上提供了有力的依据。但是这些对实验结果的推测在动物模型、前期临床及临床中进一步验证。

Claims (8)

1.AMO-103在制备防止心律失常中促进hERG表达的药物组合物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其中所述AMO-103为miR-103的反义寡核苷酸序列。

3.如权利要求1或2所述的应用，其中所述心律失常选自窦性心律失常，异位心律，心脏传导阻滞，房室间传导异常，LQT2中的一种或多种。

4.如权利要求1或2所述的应用，其中所述心律失常可引起心源性猝死。

5.一种治疗心律失常的药物组合物，其特征在于含有AMO-103。

6.如权利要求5所述的药物组合物，其中所述AMO-103是miR-103的反义寡核苷酸序列。

7.如权利要求5或6所述的药物组合物，其中所述心律失常选自窦性心律失常，异位心律，心脏传导阻滞，房室间传导异常，LQT2中的一种或多种。

8.如权利要求5或6所述的药物组合物，其中所述心律失常可引起心源性猝死。