CN105280463A - 具有提高的分辨率的计算扫描显微术 - Google Patents

Abstract

一种使用扫描类型显微镜积累标本的图像的方法，其中考虑在标本内的给定点p_i，所述方法包括下面的步骤：-在第一探查期中，采用第一射束配置B₁以关联的第一点扩散函数F₁照射点p_i，由此所述射束配置不同于所述测量参数；-在至少第二探查期中，采用第二射束配置B₂以关联的第二点扩散函数F₂照射点p_i，由此：？？F₂在点p_i所在的公共交叠区O_i中部分地与F₁交叠；？？F₁和F₂具有在O_i之外的各自的非交叠区F₁’和F₂’，-在所述计算机处理设备中使用源分离算法在与所述非交叠区F₁’和F₂’分开地考虑的所述交叠区O_i中执行图像重构。

Description

具有提高的分辨率的计算扫描显微术

技术领域

本发明涉及一种使用扫描类型显微镜积累标本的图像的方法，所述方法包括下面的步骤：

-通过照明器引导来自源的辐射的射束以照射标本的表面S；

-响应于所述照射而使用检测器检测从标本发出的辐射的通量；

-使所述射束相对于所述表面沿扫描路径行进；

-对于所述扫描路径中的一组样本点中的每个样本点，作为所选择的测量参数P的值P_n的函数记录检测器的输出D_n，因此编译测量集合M={(D_n,P_n)}，其中n是整数序列的成员；

-使用计算机处理设备自动地对测量集合M进行去卷积并且在空间上解析测量集合M以产生标本的重构图像。

本发明还涉及一种能够在其中执行这种方法的扫描类型显微镜。

背景技术

带电粒子显微术是公知的并且日益重要的用于对微观物体成像的技术，特别地，具有电子显微术的形式。在历史上，电子显微镜的基本种类已经历演进成为许多公知的设备种类，诸如，透射电子显微镜(TEM)、扫描电子显微镜(SEM)和扫描透射电子显微镜(STEM)，并且还演进成为各种子种类，诸如，所谓的“双射束”工具(例如，FIB-SEM)，所述“双射束”工具另外采用“机加工”聚焦离子束(FIB)，允许诸如例如离子束铣削或离子束诱导沉积(IBID)之类的支持性活动。更具体地讲：

-在SEM中，由扫描电子束执行的对标本的照射促成以例如二次电子、反向散射电子、X射线和光致发光(红外、可见和/或紫外光子)的形式从标本发出“辅助”辐射；发出的辐射的这个通量中的一个或多个分量随后被检测到并且用于图像积累目的。

-在TEM中，用于照射标本的电子束被选择为具有足够高的能量以穿透标本(为此，与SEM标本的情况相比，该标本将会通常更薄)；从标本发出的透射电子的通量能够随后被用于创建图像。当在扫描模式下操作这种TEM(因此变为STEM)时，将会在照射电子束的扫描运动期间积累所讨论的图像。

能够例如从下面的维基百科链接搜集关于这里说明的一些主题的更多信息：

http://en.wikipedia.org/wiki/Electron_microscope

http://en.wikipedia.org/wiki/Scanning_electron_microscope

http://en.wikipedia.org/wiki/Transmission_electron_microscopy

http://en.wikipedia.org/wiki/Scanning_transmission_electron_microscopy。

作为使用电子作为照射射束的替代方案，还能够使用其它种类的带电粒子执行带电粒子显微术。在这个方面，短语“带电粒子”应该被宽广地解释为包括例如电子、正离子(例如，Ga或He离子)、负离子、质子和正电子。关于基于离子的显微术，能够例如从诸如下面的源搜集一些另外的信息：

http://en.wikipedia.org/wiki/Scanning_Helium_Ion_Microscope

-W.H.Escovitz,T.R.FoxandR.Levi-Setti,ScanningTransmissionIonMicroscopewithaFieldIonSource,Proc.Nat.Acad.Sci.USA72(5),pp1826-1828(1975)。

应该注意的是，除了成像之外，带电粒子显微镜(CPM)还可具有其它功能，诸如执行光谱分析、检查衍射图、执行(局部)表面改性(例如，铣削、蚀刻、沉积)等。

除了使用带电粒子作为照射射束之外，也可使用光子束执行扫描显微术。这种技术的例子是所谓的共焦显微术，其中由点光子源产生的扫描照射刺激从标本局部发出荧光辐射。检测器能够被用于收集荧光辐射的这个通量(的一部分)并且基于其积累图像。能够例如从下面的维基百科链接搜集关于这个主题的更多信息：

http://en.wikipedia.org/wiki/Confocal_microscopy。

在所有情况下，扫描类型显微镜将会包括至少下面的部件：

-在CPM的情况下的辐射源(诸如，肖特基源或离子枪)或在光学显微镜的情况下的激光器或灯。

-照明器，用于操纵来自源的“原始”辐射射束并且对其执行某些操作，诸如聚焦、像差减轻、修剪(利用孔隙)、滤波等。它通常将会包括一个或多个(带电粒子)透镜，并且也可包括其它类型的(粒子)光学部件。根据需要，照明器能够被提供有偏转器系统，该偏转器系统能够被调用以使它的输出射束跨正在研究的标本执行扫描运动。

-标本支架，能够在该标本支架上支撑和定位(例如，倾斜、旋转)正在研究的标本。根据需要，这个支架能够移动以相对于标本执行射束的预期扫描运动。通常，这种标本支架将会被连接到定位系统(诸如，机械台)。

-检测器，根据正在检测的辐射，检测器可在本质上是一体的或复合/分布式的，并且能够采用许多不同形式。例子包括可例如结合例如闪烁器膜使用的光电倍增器(包括固态光电倍增器、SSPM)、光电二极管、CMOS检测器、CCD检测器、光伏电池等。

本申请的受让人(美国俄勒冈州希尔巴罗的FEI公司)近年来已广泛地开发了如以上开头段落中所阐述的方法。特别地，下面的重要公开值得提及：

(i)US8,232,523/EP2383768B1，其中P是(到来的)辐射射束的性质（诸如射束能量、射束会聚角或射束焦深）并且使用统计盲源分离(BSS)算法执行M的空间解析(去卷积)。

(ii)US8,581,189/EP2557586B1，其中P也是(到来的)辐射射束的性质（诸如射束能量、射束会聚角或射束焦深）并且使用例如基于贝叶斯统计方案的广义三维重构技术执行M的去卷积。

(iii)US8,586,921/EP2557587A2，其中P是(发出的)辐射通量的性质（具体地讲，(例如，发射的二次电子的)发射角）并且再一次使用广义体积重构算法执行M的去卷积。

(iv)US8,704,176/EP2648208A2，其中P也是(发出的)辐射通量的性质（具体地讲，发射的电子的能量）并且再一次使用三维重构数学实现M的去卷积。

在对M进行去卷积时，技术人员能够例如在空间上将它解析为结果集合R={(V_k,L_k)}，其中空间变量V表示在相对于表面S的关联的离散深度水平L_k的值V_k，k是整数序列的成员，并且空间变量V代表作为标本的主体中的位置的函数的标本的物理性质，例如，对比度、强度、密度变化、原子量、染色浓度、电子产量/X射线产量等，所有这些物理性质由标本的(材料)的物理特性直接或间接确定，并且基于这些物理性质，可构造诸如例如图像、映射图或光谱之类的实体。以这种方式，技术人员将来自标本的固有退化信号转换成参考深度的图像堆叠。解决这个去卷积问题的通常方法是(例如)：

-定义点扩散函数(PSF)，对于n的每个值，PSF具有核心值K_n，核心值K_n代表由检测器针对测量参数值P_n感知到的标本主体中的所述(到来的)辐射射束的状态。

-定义成像量，对于n的每个值，成像量具有值Q_n，值Q_n是K_n和V的多维卷积，从而Q_n=K_n*V；

-对于n的每个值，以计算方式确定D_n和Q_n之间的最小散度minD(D_n║K_n*V)，其中技术人员在对值K_n应用约束的同时对V进行求解。

对于本领域技术人员而言将会清楚的是，虽然这种去卷积可以参考深度，但它通常不限于深度。因为广义PSF将会具有侧向扩散，所以去卷积产生标本的全体积图像，但(根据需要)允许在逐层基础上(沿深度方向的“计算切片”)呈现这种图像。

上述技术已在计算电子显微术中产生了变革，允许以过去从未有过的方式执行详细的SEM断层扫描术。尽管以上给出的例子具体地涉及在照射射束中使用带电粒子(诸如，电子)，但所涉及的基本原理也能够被用在照射射束包括光子的扫描类型光学显微镜中。

虽然技术(诸如，以上阐述的那些技术)产生令人满意的结果，但本发明人已进行广泛工作以便更进一步改进这些技术。这个努力的结果是本申请的主题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在以上开头段落中阐述的类型的改进的方法。特别地，本发明的目的在于：这种方法应该提供比由这一种类的方法目前提供的成像分辨率大的成像分辨率。

在如开头段落中所阐述的方法中实现这些和其它目的，其特征在于，考虑在标本内的给定点p_i，所述方法包括下面的步骤：

-在第一探查期中，采用第一射束配置B₁以关联的第一点扩散函数F₁照射点p_i，由此所述射束配置不同于所述测量参数；

-在至少第二探查期中，采用第二射束配置B₂以关联的第二点扩散函数F₂照射点p_i，由此：

?F₂在点p_i所在的公共交叠区O_i中部分地与F₁交叠；

?F₁和F₂在O_i之外具有各自的非交叠区F₁’和F₂’，

-在所述计算机处理设备中使用源分离算法在与所述非交叠区F₁’和F₂’分开地考虑的所述交叠区O_i中执行图像重构。

能够在数学考虑因素方面阐述本发明的要点(参见以下的实施例)，但也能够基于简化的物理说明来解释本发明的要点。基本上，本发明方案确保：位于交叠区O_i中的标本的点p_i将会经受PSF(PSF用于描述射束和标本之间的物理相互作用)的函数形式f_PSF的(至少)两个不同区域/部分/方面。以这种方式，本发明的技术使点p_i(和区O_i的其余部分)被例如：

-在第一探查期期间的f_PSF的“较深区域”和在第二探查期期间的f_PSF的“较浅区域”；或

-在第一探查期期间的f_PSF的“左侧部分”和在第二探查期期间的f_PSF的“右侧部分”，

等“探查”。本发明的去卷积过程因此利用这样的事实：按照与立体视觉允许比单视觉（monovision）更准确地定位物体或者从多个点的范围确定允许比仅从一个点的范围确定更准确地定位(三角测量)物体的方式稍微类似的方式，交叠区O_i已被f_PSF的这些(至少)两个不同区域/部分探查。通过以下面的方式中的一个或多个方式考虑本发明，技术人员能够替代地理解本发明：

-由于交叠区O_i按照定义小于对它做出贡献的个体PSF，所以本发明的方案提供比“原始”现有技术方法(诸如，以上阐述的现有技术方法)更细标度的空间分辨率。本发明可因此被视为产生超级分辨率成像结果。

-本发明集中于与非公共分量隔离的交叠PSF的公共分量，因此从空间解析过程切除“无用物”。

-由于在多个探查期中检查交叠区O_i，所以信噪比不可避免地提高。

-由f_PSF的不同区域/部分执行的对O_i的每次探查都能够被视为用于建立描述O_i的一组联立方程的另一成员的方式；技术人员获得的联立方程越多，解空间变得越明确。

适合用于本发明的源分离(SS)技术的例子包括例如：

-独立分量分析(ICA)，ICA是允许多元信号被分离成加性子分量的技术；

-主分量分析(PCA)；

-非负矩阵因式分解(NNMF)，

等，这些例子可特别地适合于在特定情况下的应用。对于关于这种技术的一些通常信息，参见例如下面的参考文献：

-http://en.wikipedia.org/wiki/Independent_component_analysis

-上述专利US8,232,523/EP2383768B1。

-[1]P.ComonandC.Jutten,HandbookofBlindSourceSeparation:IndependentComponentAnalysisandApplications,AcademicPress(2010)。

-[2]A.Hyv?rinenandE.Oja,IndependentComponentAnalysis:AlgorithmsandApplications,NeuralNetworks,13(4-5):411–430(2000)。

-[3]H.Lantéri,M.Roche,C.Aime,“Penalizedmaximumlikelihoodimagerestorationwithpositivityconstraints:multiplicativealgorithms,InverseProblems,”vol.18,pp.1397-1419(2002)。

-[4]I.T.Jolliffe,PrincipalComponentAnalysis,Series:SpringerSeriesinStatisticsXXIX,2nded.,Springer,NY(2002)。

在这个叙述和以下的进一步说明的背景下，应该记住下面的点：

(a)可根据需要在点p_i由另外的探查期补充上述第一和第二探查期，因此导致积累部分交叠的PSF的一般集合F={F₁,F₂,F₃,…,F_j,…}。

(b)能够在沿着(以下的)扫描路径的(连续)点的整个链条p={p_i}处重复在给定点p_i的本发明的过程。关联的交叠区O_i随后将会有效地“合并”到例如具有标本中的特定(次表面)层/体积的形式的更大地域O={O_i}中(例如，参见图1B和2B)。如以上所解释的，能够随后在O的外面实现“标准”空间分辨率，但本发明允许在O内实现增加的空间分辨率。

(c)关于前一项，技术人员具有例如执行下述操作的自由：

(I)在点p_i部署全集F，并且然后在p中的每个随后的点重复这个过程(“在p中在每个步骤之前全部F”)；或

(II)在p中的每个点部署PSFF_j，并且然后针对F中的每个随后的PSF重复这个过程(“在F中在每个步骤之前全部p”)。

(d)在点p_i的各种探查期可原则上逐次地或同时执行，由此：

-在前者的情况(逐次探查)下，首先由具有射束配置B₁的第一射束照射点p_i，并且其后由具有射束配置B₂的第二射束照射点p_i，等等。

-在后者的情况(同时探查)下，在(共存的)互相不同的射束配置的范围，多个射束被用于同时照射点p_i。

本领域技术人员将会容易地理解这些点。

应该明确地注意的是，本发明在本质上根本不同于在以上的专利文件(i)-(iv)中阐述的发明。在文件(i)-(iv)中，作为从标本内的一系列(连续)深度层获得(卷积)成像信息的方式改变测量参数P，即参数P的调整被视为用于越来越深地探查到标本中的工具。另一方面，在本发明中，参数P的变化有效地是用于在标本内的给定位置修改“高阶”(交叠)PSF部分(O_i)的尺寸/形状的工具，以便能够在小于在所述位置的探查射束的覆盖区的区域中执行超级分辨率图像重构。探查射束的侧向扫描运动能够被用于将所述位置扩展到层(该层能够是表面或次表面)中，但按照它的最基本形式，本发明并不本征地贯穿标本的全部不同深度产生主体/体积成像(但通过在(堆叠的)逐层基础上使用扩展的发明能够最终获得这种深度解析信息)。

在本发明的特定实施例中，下面的特定方面适用：

-所述表面被定义为平行于笛卡尔坐标系XYZ的XY平面延伸

-所述射束配置被选择为射束进入标本中的点的Z位置；

-在所述第一和第二探查期之间，物理切片过程被用于从初始表面S₁去除一层厚度L的材料，由此露出新表面S₂；

-点扩散函数F₂和F₁沿所述Z方向相对于彼此移动达一定量L。

这个实施例的机制能够被解释如下(参见图1A)：

-考虑标本中的p_i位于S₁下方的Z距离L+z处，其中z是某个正增量。

-在第一探查期中，到来的辐射射束B₁将会撞击S₁并且产生PSFF₁，PSFF₁从S₁向下延伸到标本中；点p_i将会随后位于到这个PSFF₁中的Z距离L+z处。

-物理切片过程(诸如，离子铣削、切片机切割、蚀刻等)现在被用于从旧表面S₁去除厚度L的层，由此露出新生表面S₂。

-在第二探查期中，到来的辐射射束B₂将会撞击S₂并且产生PSFF₂，PSFF₂从S₂向下延伸到标本中；点p_i将会随后位于到这个PSFF₂中的Z距离z处。PSFF₁和F₂表示部分交叠区O_i。射束B₁和B₂具有公共传播轴b₁₂，公共传播轴b₁₂平行于Z方向延伸。

-PSFF₁和F₂能够具有(近似)相同的函数形式f_PSF(例如，卵形，该卵形在射束的撞击点处以窄颈开始，随着射束前进到标本中而变宽(侧向扩散)，并且然后随着增加的衰耗而再一次逐渐变细)，但包含p_i的交叠区O_i将会经受每个PSFF₁和F₂的不同Z区域。这个事实允许SS算法(诸如，ICA)被用于在区O_i内执行检测器信号去卷积，从而在这个区中导致增加的空间分辨率(与现有技术相比)。

-如以上的项目(b)中所阐述的，这个效果不必仅局限于点p_i所在的区O_i；替代地，如果在第一和第二探查期期间执行侧向扫描，则区O_i将会仅是位于S₂下方的合并地域(例如，层/体积)O的一个分量，本发明能够针对其实现提高的空间分辨率。在这个方面，参见例如图1B。

-如果期望，能够在另外的迭代中重复以上阐述的过程，由此射束敢于逐渐地越来越深地进入标本中，因此创建能够在其中获得提高的空间分辨率的次表面地域/层O的堆叠。这种方案例如被图示在图1C中。

-技术人员将会理解，在当前情况下，不能采用以上的方案(I)，因为在探查期之间存在不可逆的破坏性步骤(层去除)；替代地，可采用方案(II)。在这种背景下，应该注意的是：

?通过改变测量参数¹P并且记录伴随的检测器输出，能够针对PSFF₁(在p中的每个点p_i)获得整个测量集合¹M。

?类似地，通过改变测量参数²P并且记录伴随的检测器输出，能够针对PSFF₂(在p中的每个点p_i)获得整个测量集合²M，其中²P和¹P可以相同或不同。

?这些测量集合¹M、²M中的每一个分别允许产生标本的(一部分的)空间解析图像；然而，使用本发明的构思，可针对上述交叠地域O获得更高分辨率图像。

应该注意的是，以上的现有技术(i)-(iv)讨论物理切片和断层扫描术的组合使用，但这仅为了增加这种断层扫描术到标本中的可实现范围；在现有技术中不存关于沿Z方向使用交叠的PSF或应用SS算法以在关心的（一个或多个）交叠区/地域中实现提高的空间分辨率的教导。

在本发明的替代实施例中，下面的特定方面适用：

-所述射束配置被选择为射束相对于表面S的角度(最通常在三维中考虑)；

-在所述第一和第二探查期之间，调整射束的所述角度。

-点扩散函数F₂和F₁相对于彼此成角度。

这个实施例的机制能够例如被解释如下(参见图2A)。

-定义相对于表面S的倾斜角T(偏转/俯仰)。

-在第一探查期中，到来的辐射射束B₁以倾斜角T₁撞击S并且产生PSFF₁，PSFF₁沿着传播轴b₁延伸到标本中并且与次表面点p_i交叉。如果T₁≠90°，则这种撞击/延伸将会是倾斜的(否则，它将会是法向的/垂直的)。

-在第二探查期中，到来的辐射射束B₂以不同倾斜角T₂撞击S，产生PSFF₂，PSFF₂以不同斜率沿着传播轴b₂延伸到标本中并且再一次与点p_i交叉。

-由于T₂≠T₁，所以点p_i将会经历沿着PSFF₁和F₂的各自的传播轴b₁、b₂量度的PSFF₁和F₂的不同区域/方面。这个事实允许SS算法(诸如，ICA)被用于在区O_i内执行检测器信号去卷积，从而在这个区中导致增加的空间分辨率(与现有技术相比)。

-再一次，如以上的项目(b)中所阐述的，这个效果不必仅局限于p_i所在的区O_i；替代地，如果在第一和第二探查期期间执行侧向扫描，则区O_i将会仅是位于S下方的合并地域(例如，层/体积)O的一个分量，本发明能够针对其实现提高的空间分辨率。在这个方面，参见例如图2B。

应该注意的是，除了量度在垂直平面(包含Z轴)中的偏转/俯仰的倾斜角T之外，还可定义方位角A，方位角A量度在水平平面(平行于XY平面)中的轨道角（orbitalangle）/摇摆。在图2A中示出的情况下，射束B₁和B₂具有不同方位角(分别为A₁和A₂)——特别地，射束B₁和B₂完全彼此相对，在它们的方位角之间存在180°的差异；然而，情况不一定是这样，并且射束B₁和B₂能够利用相同方位角同样有效地接近点p_i。此外，射束B₁和B₂还能够利用相同倾斜角但利用不同方位角接近点p_i。这些点也在以下的实施例1中受到关注。

应该注意不要把前面段落的“可变射束角度”实施例与已知的并且非常不同的技术(诸如，所谓的“微旋转”)相混淆。微旋转的技术能够被视为所谓的共焦成像的角度版本，共焦成像在本质上是线性的。在共焦成像中，焦平面通过标本以(递增的)步调线性移动，而在微旋转中，样本通过焦平面以角度方式旋转；在两种情况下，都意图通过标本的扩展体积“扫描”焦平面(以线性方式或以角度方式)。相比之下，在前面段落的本发明的实施例中，射束倾斜的目的是：为了定义将要在其中发生超级分辨率图像重构的有限区域的目的，而创建不同PSF之间的(可调整尺寸/形状/位置的)局部交叠区。

在本发明的另一实施例中，下面的特定方面适用：

-所述射束配置被选择为所述射束中粒子的种类；

-关于尺寸和形状中的至少一个，点扩散函数F₂和F₁互相不同。

这个实施例的机制能够被解释如下(参见图3A)。

-考虑如这里所使用的术语“种类”以表示诸如以下各项的特性：带电或不带电、电荷的符号、相对较重或较轻、相对较长或较短的波长等。在这种背景下，诸如电子、质子、相对较轻的离子(例如，He离子)、相对较重的离子(例如，Ga离子)、光子、软或硬X射线等之类的粒子被视为不同种类的粒子。

-这种不同种类的粒子将会通常表示与给定标本的不同相互作用，在伴随的PSF的形状和/或尺寸方面具有关联的差异。

-在第一探查期中，到来的辐射射束B₁包括第一种类的粒子。当这个射束B₁撞击S时，它产生例如PSFF₁，PSFF₁延伸到标本中相对较深的水平但具有相对较小的侧向扩散。这个PSFF₁与点p_i交叉。

-在第二探查期中，到来的辐射射束B₂包括第二种类的粒子。当这个射束B₂撞击S时，它产生例如PSFF₂，PSFF₂延伸到标本中相对较浅的水平但与射束B₁的情况相比具有更大的侧向扩散。这个PSFF₂也与点p_i交叉。

-由于PSFF₂和F₁在尺寸和/或形状方面不同，所以点p_i将会经历PSFF₂和F₁中的每一个的不同区域/部分/方面。这个事实允许SS算法被用于在区O_i内执行检测器信号去卷积，从而在这个区中导致增加的空间分辨率(与现有技术相比)。

-再一次，如以上的项目(b)中所阐述，这个效果不必仅局限于点p_i所在的区O_i；替代地，如果在第一和第二探查期期间执行侧向扫描，则区O_i将会仅是位于S下方的合并地域(例如，层/体积)O的一个分量，本发明能够针对其实现提高的空间分辨率。在这个方面，参见例如图3B。

如果期望，能够采用上述实施例的各种组合/混合，所有这些组合/混合落在本发明的范围内。例如：

-在已发生图2B中描述的情况之后，物理切片过程能够被用于从标本去除一层厚度L的材料，由此露出新表面(参照图1A)；随后能够在这个新露出的表面上重复图2B中示出的情况。例如，类似陈述适用于图3B中描述的情况。

-图1A和3A的射束可根据需要被倾斜地射入到标本中而非沿法向方向射入到标本中。

等等。

附图说明

现在将基于示例性实施例和所附的示意图更详细地说明本发明，其中：

图1呈现根据本发明的特定实施例的正被成像的标本的剖视图。

图2呈现根据本发明的另一实施例的正被成像的标本的剖视图。

图3呈现根据本发明的再另一实施例的正被成像的标本的剖视图。

图4呈现根据本发明的扫描类型显微镜的实施例的剖视图。

图5描述关于本发明的示例性实施例的实验设置和图像。

图6描述关于本发明的另一示例性实施例的图像。

在附图中，使用对应参考标号指示相关的对应部分。

具体实施方式

实施例1

图2A呈现根据本发明的给定实施例的正被成像的标本的剖视图。如上面已经提及的，这个图图示下面的情况：

-第一到来的辐射射束B₁，以倾斜角T₁撞击标本表面S并且产生PSFF₁，PSFF₁沿着传播轴b₁延伸到标本中并且与次表面点p_i交叉。

-第二到来的辐射射束B₂，以不同倾斜角T₂撞击S，产生PSFF₂，PSFF₂以不同斜率沿着传播轴b₂延伸到标本中并且再一次与点p_i交叉。

-由于T₂≠T₁，所以点p_i经历沿着PSFF₁和F₂的各自的传播轴b₁、b₂量度的PSFF₁和F₂的不同区域/方面。这个事实允许SS算法被用于在区O_i内执行检测器信号去卷积，从而在这个区中导致增加的空间分辨率。现在将更详细地对此进行解释。

当扫描标本的表面S时，技术人员收集针对每个扫描位置的检测器输出，因此形成“图像”D。在这里讨论的重构方案中，技术人员使用以相对于参考框架(XYZ)的各自‘方位’(摇摆)和‘倾斜’(俯仰、偏转)角度(A,T)取向的扫描射束获取图像，参考框架(XYZ)的Z轴与标本的表面S(XY平面)正交(在图2中未描述方位角A)。这些图像在这里被标记为D_A,T。为了简单，下面将会将其本身限制于这样的情况：其中方位角分离180°(相反的方向)。在各自倾斜角T₁和T₂(特殊情况是T₁=T和T₂=T)获取(顺序地或同时地)两个图像，并且这两个图像分别被标记为和。对于，从被PSFF₁覆盖的体积的群集获得在被访问的扫描位置的检测信号的群集。在的情况下，成像过程使用PSFF₂。能够通过将倾斜图像之一(例如，)相对于另一图像“移动”某个数量的“像素”来实现获得来自标本中的一组较小地延伸的体积的更清晰的图像。这种移动的量将会确定两个PSFF₁和F₂的交叉体积的次表面位置，该交叉体积在图2A中被标记为O_i。当不存在X移动时，所述交叉体积O_i紧接地位于表面S下方。例如，能够使用统计源分离技术(诸如，独立分量分析(ICA))实现提取仅来自于交叉体积O_i的群集(针对所有扫描位置)的信号。

为了进一步解释，技术人员能够定义：

?F₁'=F₁\O_i作为不包括交叉区域O_i的由PSFF₁覆盖的体积；和

?F₂'=F₂\O_i作为不包括交叉区域O_i的由PSFF₂覆盖的体积。

与F₁'、F₂'和O_i对应的三个体积是非交叠的，并且技术人员能够定义与这些虚拟PSF(体积)对应的三个“虚拟图像”、和。这种虚拟图像将会具有比原始图像低的统计相关性。

在线性成像模型的情况下，技术人员获得：

(1)

(2)。

在射束参数(诸如，电流/粒子通量或加速电压)针对两个扫描(探查期)相同的情况下，这个模型适用。如果射束之一具有不同“强度”(即，较大或较小重要性/影响/“重力”)，则给予交叉区域的相对权重α将会从值1.0开始改变，从而导致更一般的表达式：

(3)

(4)

或以矩阵形式：

(5)

其中：

和(6)。

将要在这里解决的问题包括从“观测到”的图像和恢复虚拟图像、和。如前面所解释的，主要重点将会在于，应该对应于更清晰的图像。能够(例如)利用正则化方法使用ICA技术实现解决在方程(5)中阐述的通常不适定分解/因式分解问题。该通常的问题用公式表示如下：

找到满足下式的对

(7)。

其中准则是模型和观测结果之间的统计相似性量度。例如，的典型选择是针对具有高斯噪声的信号的最小二乘量度或针对泊松噪声的Kullback-Leibler散度。也能够使用其它散度：参见例如上面参考的US8,581,189(以上的项(ii))，第5栏第33行-第6栏第33行。

为了更好的收敛，并且为了限制解空间，正则化项能够被添加到(7)，从而产生：

(8)

正则化项代表现有知识约束，并且可取决于分解变量以及取决于从仿真和测量出现的其它参数θ。例如，技术人员能够使用：

-针对扫描射束与特定种类的材料(诸如，例如嵌入有塑料的重粒子染色样本)的相互作用的分析模型的参数；

-限制重构结构的几何形状和对比度的参数：例如，突触囊泡平均为球形并且具有大约39.5nm的直径，

等等。

技术人员能够看出，在问题(7)和(8)中，相对于W的优化归结为相对于α的优化。最终，如前所述，要恢复的最重要的分量是，是与较小“交叉体积”对应的图像。

交替最小二乘(ALS)算法

下面是在最小二乘量度的情况下求解(7)的例子。在这种情况下，技术人员求解：

(9)。

通常使用非负性条件正则化(9)，如正(9)中由约束所指示的。能够通过相对于W和D'交替两个最小化步骤来解决这个问题。在第一步骤中，技术人员相对于W计算导数并且将它设置为零：

(10)

技术人员从(10)获得：

(11)

相对于D'对最小二乘准则求微分并且设置为零导致：

(12)。

在ALS算法中，两个步骤(11)和(12)交替，直至实现合适的收敛准则。例如，通过将负值设置为零或者通过采用所谓的活动集技术（activesettechnique），来施加前述非负性约束，如(例如)在以上的参考文献[1]和[2]中所述的。

具有Kullback-Leibler散度的ICA(EMML)

在这种情况下，技术人员使下面的所谓广义Kullback-Leibler(KL)散度最小化：

(13)

其中x是跨越图像坐标空间的变量。在这种公式中，通常使用期望最大化最大可能性(EMML)算法(例如，参见以上的参考文献[3])来实现不同图像分量和权重矩阵的恢复。这个算法建立在下面的两个迭代上：

(14)

(15)

其中索引i、j和k被用于表示不同矩阵的元素，并且其中左手侧的量是在迭代t+1计算的值，并且右手侧的量是在迭代t获得的值。

已在以上的一般描述中讨论了图2B，并且这里不需要进一步说明。

实施例2

图1A呈现根据本发明的另一实施例的正被成像的标本的剖视图。如上面已经提及的，这个图示意性地描述下面的情况：

-第一到来的辐射射束B₁，撞击(原始)标本表面S₁并且产生PSFF₁，PSFF₁从S₁向下延伸到标本中；点p_i位于到这个PSFF₁中的Z距离L+z处。

-第二到来的辐射射束B₂，撞击(新露出的)标本表面S₂并且产生PSFF₂，PSFF₂从S₂向下延伸到标本中；点p_i位于到这个PSFF₂中的Z距离z处。通过使用物理切片过程(诸如，离子铣削、切片机切割、蚀刻等)从旧表面S₁去除厚度L的层，由此露出新生表面S₂，来创建这个新表面S₂。

-PSFF₁和F₂表示部分交叠区O_i。射束B₁和B₂具有公共传播轴b₁₂，公共传播轴b₁₂平行于Z方向延伸。包含p_i的交叠区O_i将会经受每个PSF的不同Z区域。这个事实允许(例如)ICA被用于在区O_i内执行检测器信号去卷积，从而在这个区中导致增加的空间分辨率。现在将更详细地对此进行解释。

在从在不同表面的多个成像期进行重构的情况下，技术人员能够遵循与以上的实施例1中相同的推理并且定义三个PSF：F₁'=F₁\O_i，F₂'=F₂\O_i，和O_i。从图1A技术人员能够看出，在这种情况下，“虚拟图像”、和对应于从上到下堆叠的体积。这些“虚拟”体积中的每一个将会具有比两个原始体积小的厚度，并且因此应该对应于具有较少体积效应的更清晰的图像。如果技术人员将在表面S₁和S₂获得的图像分别定义为和，则技术人员能够获得观测图像和“虚拟”图像之间的关系如下：

(16)

(17)

如果技术人员计及在这两个期之间引入不同“强度”缩放α的成像条件的改变，则技术人员获得：

(18)

(19)

这导致矩阵表示：

(20)

其中并且如(6)中一样定义W和D'。

使用与如上所述的ICA技术相同的ICA技术，技术人员能够恢复与从上到下的三个层对应的三个图像。

已在以上的一般描述中讨论了图1B和1C，并且这里不需要进一步说明。

实施例3

将上述重构技术扩展至超过两个扫描(探查期)将会完全在技术人员的范围内。对于实施例1的多倾斜角情况，例如，不同PSF应该在这种情况下在同一公共(“枢转”)区域中交叉。成像过程的线性将会总是导致由类似于(5)和(20)的方程的系统代表的分解。能够使用相同的计算方法对这种系统进行求解。

实施例4

图3A呈现根据本发明的再另一实施例的正被成像的标本的剖视图。如上面已经提及的，这个图示意性地描述下面的情况：

-第一到来的辐射射束B₁，包括第一种类的粒子。当这个射束B₁撞击S时，它产生PSFF₁，PSFF₁延伸到标本中相对较深的水平，但具有相对较小的侧向扩散。这个PSFF₁与点p_i交叉。

-第二到来的辐射射束B₂，包括第二种类的粒子。当这个射束B₂撞击S时，它产生PSFF₂，PSFF₂延伸到标本中相对较浅的水平，但与射束B₁的情况相比具有更大的侧向扩散。这个PSFF₂也与点p_i交叉。

-由于PSFF₂和F₁在尺寸和/或形状方面不同，所以点p_i将会经历PSFF₂和F₁中的每一个的不同区域/部分/方面。这个事实允许(例如)ICA被用于在区O_i内执行检测器信号去卷积，从而在这个区中导致增加的空间分辨率。

在这种情况下，重构数学大体上类似于在以上的实施例1和2中阐述的一般框架。这种特定情况是这样的情况：在该情况中，因为PSFF₁和F₂之间的(典型)不相似性，以上在方程(3)和(18)中引入的相对加权因子α能够起到重要作用。

已在以上的一般描述中讨论了图3B，并且这里不需要进一步说明。

实施例5

图4是根据本发明的扫描类型显微镜的实施例的高度示意性的描述；更具体地讲，它示出带电粒子显微镜400的实施例，在这种情况下，带电粒子显微镜400是SEM。显微镜400包括粒子光学镜筒402，粒子光学镜筒402产生输入带电粒子的射束404(在这种情况下，是电子束)。粒子光学镜筒402被安装在真空室406上，真空室406包括用于支撑标本410的标本支架/台408。使用真空泵(未描述)抽空真空室406。借助于电压源422，标本支架408或至少标本410可根据需要偏置(浮置)到相对于地的电势。

粒子光学镜筒402包括：电子源412(诸如，肖特基枪)；透镜414、416，用于将电子束404聚焦到标本410上；和偏转单元418(用于执行射束404的射束操纵/扫描)。设备400还包括：控制器/计算机处理设备424，用于控制尤其偏转单元418、透镜414、416和检测器100、420并且在显示单元426上显示从检测器100、420搜集的信息。在当前情况下，物品414、416和418可被视为包括以上提及的照明器。

从能够被用于响应于由输入射束404执行的照射而检查从标本410发出的不同类型的输出辐射通量的各种可能的检测器类型选择检测器420、100。在这里描述的设备中，已做出下面的检测器选择：

-检测器100是分段电子检测器。这种检测器能够例如被用于研究从标本410出现的输出电子(二次或反向散射电子)的通量的角度相关性。

-检测器420是用于检测从标本410发出的输出电子的通量(的至少一部分)的硼掺杂固态检测器。

如这里所呈现的，两个检测器100和420都被用于检查电子；然而，这纯粹是设计/实现方式选择，并且，如果期望，附加于电子或者作为电子的替代，技术人员也能够选择检测从标本410发出的其它类型的输出辐射通量(例如，X射线、阴极发光)。

通过在标本410上扫描输入射束404，从标本410发出输出辐射，输出辐射包括例如X射线、红外/可见/紫外光、二次电子和或反向散射(BS)电子的通量。因为这种输出辐射是位置敏感的(由于所述扫描运动)，所以从检测器100、420获得的信息也将会是位置相关的。这个事实允许检测器420的输出被用于产生(例如)标本410(的一部分)的BS电子图像，该图像基本上是作为标本410上的扫描路径位置的函数的检测器420的输出的映射图。

来自检测器100、420的信号由控制器424处理，并且显示在显示单元426上。这种处理可包括诸如组合、集成、相减、假着色、边缘增强之类的操作和技术人员已知的其它处理。另外，自动化识别过程(例如，用于粒子分析)可被包括在这种处理中。

应该注意的是，这种设置的许多改进和替代将会对于技术人员而言是已知的，包括但不限于：

-使用双射束，例如，用于成像的电子束404和用于对标本410进行机加工(或在一些情况下，对标本410成像)的离子束；

-在标本410处使用受控环境，例如，保持几mbar的压强(如所谓的环境SEM中所使用的)或通过允许气体(诸如，蚀刻或前体气体)进入，

等等。

在本发明的特定背景下，控制器424（和/或专用分离处理单元(未示出)）能够被调用以关于标本410内的给定点p_i执行下面的动作：

-在第一探查期中，采用第一射束配置B₁以关联的第一点扩散函数F₁照射点p_i，由此所述射束配置不同于所述测量参数；

-在至少第二探查期中，采用第二射束配置B₂以关联的第二点扩散函数F₂照射点p_i，由此：

?F₂在点p_i所在的公共交叠区O_i中部分地与F₁交叠；

?F₁和F₂具有在O_i之外的各自的非交叠区F₁’和F₂’，

-在所述计算机处理设备中使用源分离算法以在与所述非交叠区F₁’和F₂’分开地考虑的所述交叠区O_i中执行图像重构。

虽然图4中示出的扫描类型显微镜是SEM，但在本发明的背景下，它能够同样有效地是例如STEM、FIB-SEM或共焦显微镜。

实施例6

图5描述关于本发明的示例性实施例的实验设置和图像，现在将更详细地对其进行解释。

图5A示出用于照射标本的表面S的射束几何形状。这个图如下描述五个不同入射射束配置[由此，符号“(A,T)”指示分别从X(平行于Z观看)并且相对于XY平面顺时针测量的“(方位角,倾斜角)”]：

-射束B₁：法向入射。

-射束B₂：在(A,T)=(180°,60°)成角度入射。

-射束B₃：在(A,T)=(270°,60°)成角度入射。

-射束B₄：在(A,T)=(0°,60°)成角度入射。

-射束B₅：在(A,T)=(90°,60°)成角度入射。

图5B和5C示出利用下面的工具设置并且根据图5A中示出的设置成像的老鼠脑组织的标本的SEM图像：

-加速电压：2kV。

-射束电流：大约400pA。

-描述的视场：1.5μmx1.1μm。

-分辨率：4nm/像素。

-检测到的通量种类：反向散射电子。

图5B示出通过仅考虑射束B₁而获得的图像。

图5C示出根据本发明通过组合所有五个射束并且执行基于ICA的图像重构而获得的图像(例如，参见以上的实施例1)。

立即清楚的是，图5C(本发明)中的细节/分辨率远优于图5B(现有技术)的细节/分辨率。

实施例7

图6描述关于本发明的另一示例性实施例的图像。在这种情况下，标本包括利用下面的工具设置成像的兔子肺组织：

-加速电压：2kV。

-射束电流：大约400pA。

-描述的视场：1.05μmx0.98μm。

-分辨率：4nm/像素。

-检测到的通量种类：反向散射电子。

图6A示出使用现有技术成像技术的标本的传统FIB-SEM图像。

图6B示出使用“照射-切片-照射”方案(诸如，例如在以上的实施例2/图1A中阐述的方案)根据本发明通过执行基于ICA的图像重构而获得的图像(采用的工具的FIB功能被用于在照射运行之间对标本执行离子铣削，以去除厚度L=大约4nm的层)。

再一次，清楚的是，图6B中的图像(本发明)比图6A的图像(现有技术)清晰。

Claims (9)

1.一种使用扫描类型显微镜积累标本的图像的方法，包括下面的步骤：

-通过照明器引导来自源的辐射射束以照射标本的表面S；

-响应于所述照射使用检测器检测从标本发出的辐射通量；

-使所述射束相对于所述表面沿扫描路径行进；

-对于所述扫描路径中的一组样本点中的每个样本点，记录检测器的输出D_n作为选择的测量参数P的值P_n的函数，因此编译测量集合M={(D_n,P_n)}，其中n是整数序列的成员；

-使用计算机处理设备自动地对测量集合M进行去卷积并且在空间上解析测量集合M以产生标本的重构图像，

其特征在于，考虑在标本内的给定点p_i处，所述方法包括下面的步骤：

-在第一探查期中，采用第一射束配置B₁以关联的第一点扩散函数F₁照射点p_i，由此所述射束配置不同于所述测量参数；

-在至少第二探查期中，采用第二射束配置B₂以关联的第二点扩散函数F₂照射点p_i，由此：

?F₂在点p_i所在的公共交叠区O_i中部分地与F₁交叠；

?F₁和F₂具有在O_i之外的各自的非交叠区F₁’和F₂’，

-在所述计算机处理设备中使用源分离算法在与所述非交叠区F₁’和F₂’分开地考虑的所述交叠区O_i中执行图像重构。

2.如权利要求1所述的方法，其中

-所述表面被定义为平行于笛卡尔坐标系XYZ的XY平面延伸；

-所述射束配置被选择为射束进入标本中的点的Z位置；

-在所述第一和第二探查期之间，物理切片过程被用于从初始表面S₁去除一层厚度L的材料，由此露出新表面S₂；

-点扩散函数F₂和F₁沿所述Z方向相对于彼此移动一定量L。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中：

-所述射束配置被选择为射束相对于表面S的角度；

-在所述第一和第二探查期之间，调整射束的所述角度；

-点扩散函数F₂和F₁相对于彼此成角度。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中：

-所述射束配置被选择为所述射束中的粒子的种类；

-关于尺寸和形状中的至少一个，点扩散函数F₂和F₁互相不同。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中从包括下面各项的组选择所述测量参数：

-所述射束中粒子的平均着陆能量；

-所述射束中带电粒子的平均电流；

-所述通量中粒子的发射角度；

-所述通量中粒子的发射能量，

及其组合。

6.如任一前面权利要求所述的方法，其中从标本发出的辐射的所述通量包括从包括反向散射电子、二次电子、X射线、红外光、可见光、紫外光及其组合的组中选择的至少一个种类。

7.如任一前面权利要求所述的方法，其中通过在假设经受泊松噪声和高斯噪声中的至少一个的情况下使检测模型和测量集合M之间的统计散度最小化同时对所述模型应用约束来执行测量集合M的所述去卷积和空间解析。

8.如任一前面权利要求所述的方法，其中从包括独立分量分析、主分量分析、非负矩阵因式分解及其组合和混合的组中选择所述源分离算法。

9.一种扫描类型显微镜，包括：

-标本支架，用于支撑标本；

-源，用于产生辐射射束；

-照明器，用于引导所述射束以便照射所述标本；

-检测器，用于响应于所述照射检测从标本发出的辐射通量；

-扫描装置，用于使所述射束相对于标本的表面穿越扫描路径；

-控制器，用于：

　　?对于所述扫描路径中的一组样本点中的每个样本点，记录检测器的输出D_n作为选择的测量参数P的值P_n的函数，因此编译测量集合M={(D_n,P_n)}，其中n是整数序列的成员；

　　?自动地对测量集合M进行去卷积并且在空间上解析测量集合M以产生标本的重构图像，

其特征在于，关于在标本内的给定点p_i，所述控制器能够被调用以执行下面的步骤：

-在第一探查期中，采用第一射束配置B₁以关联的第一点扩散函数F₁照射点p_i，由此所述射束配置不同于所述测量参数；

-在至少第二探查期中，采用第二射束配置B₂以关联的第二点扩散函数F₂照射点p_i，由此：

　　?F₂在点p_i所在的公共交叠区O_i中部分地与F₁交叠；

　　?F₁和F₂具有在O_i之外的各自的非交叠区F₁’和F₂’，

-使用源分离算法在与所述非交叠区F₁’和F₂’分开地考虑的所述交叠区O_i中执行图像重构。