CN105267203A

CN105267203A - 一种1-脱氧-d-木酮糖5-磷酸还原异构化酶抑制剂

Info

Publication number: CN105267203A
Application number: CN201510641068.2A
Authority: CN
Inventors: 高文运; 惠先; 李恒; 张旦旦; 吴倩倩
Original assignee: Northwest University
Current assignee: Northwest University
Priority date: 2015-09-30
Filing date: 2015-09-30
Publication date: 2016-01-27
Anticipated expiration: 2035-09-30
Also published as: CN105267203B

Abstract

本发明提出一种新类型的1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构化酶(IspC)抑制剂，主要有：茶黄素(TF)、茶黄素3,3’-双没食子酸酯(TF3,3’G)、茶黄素-3-没食子酸酯(TF3G)、茶黄素-3’-没食子酸酯(TF3’G)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、没食子酸(G)、没食子儿茶素(GC)、表没食子儿茶素(EGC)、及表儿茶素没食子酸酯(ECG)等，其中TF3,3’G、TF3G、TF3’G、GCG抑制活性非常显著；在上述部分化合物的苯丙酸及其类似物的衍生物中，茶黄素(TF)的咖啡酸衍生物对IspC的抑制活性也非常显著。

Description

一种1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构化酶抑制剂

技术领域

本发明涉及酶抑制剂领域，具体涉及一种新类型的1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构化酶(IspC)的抑制剂。

背景技术

萜类化合物存在于几乎所有的生命形式中，它们在生物体中发挥着重要的作用，如长醇焦磷酸酯(dolicholdiphosphates)对细胞壁及糖蛋白生物合成的调节作用；醌类化合物(如质体醌和辅酶Q)可作为电子转移及氧化还原反应的载体；类胡萝卜素及叶绿素的侧链参与光合作用；甾体可帮助构成细胞膜(如胆固醇)；雌激素参与细胞间信号传递过程并可控制个体的生长发育；甜椒醇(capsidiol)等可作为抗菌素及植物抗毒素用于物种间相互防御；赤霉素、脱落酸可作为植物激素；维生素A的存在可促进视网膜的正常功能，缺乏则导致夜盲症；维生素D能促进钙、磷在肠内的吸收，维持血钙血磷的平衡，促进骨质的钙化等。同时，植物中所含的其它一些萜类化合物通常作为植保素，在调节植物与环境的关系上发挥重要的生态功能。许多萜类化合物还具有很好的生物活性，是天然药物的主要有效成分，如目前广泛使用的抗疟药物青蒿素、抗心血管疾病的银杏内酯及具有很强抗癌活性的化合物紫杉醇等。

长期以来，生物体内的萜类化合物被认为是由辅酶A经甲羟戊酸而合成，并认为甲羟戊酸是萜类化合物生物合成的唯一前体，故该生物合成途径被称为甲羟戊酸途径。但到上世纪九十年代初，人们发现萜类化合物的生物合成除甲羟戊酸途径外，还存在一条非甲羟戊酸途径，2-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸(MEP)是这一新途径中的两个重要中间体，故称为MEP途径。

最新研究证明，动物(包括人类)主要通过经典的甲羟戊酸途径来合成其所需的萜类化合物，而包括人类的致病菌在内的大多数微生物则是利用MEP途径来合成其所必需的萜类化合物。这种人类和其主要致病微生物分别采用完全不同的生物途径来合成维持它们生命活动所必需的萜类化合物的事实，为人们提供了一个利用MEP途径中的酶为靶标进行新型抗感染药物筛选的强有力的方法，而使用该方法进行抗感染药物筛选的最大优点在于筛选的过程不需考虑待筛查化合物的选择性。因此，这条新发现的MEP途径在新类型抗感染药物的发现方面将具有非常广阔的应用前景，尤其是在当前病原微生物对现存的各种抗感染药物的耐受性日益提高的情况下。目前，对该生物合成途径中的酶及它们的作用机理的研究已成为一个热点，尤其是对1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构化酶(IspD)的研究更加广泛和深入。

1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构化酶(IspC)为萜类化合物MEP生物合成途径中的第二个酶。它主要参与催化1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸转化为2-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸这步还原异构化反应。该酶是MEP生物合成途径中的一个关键限速酶，抑制该酶能使微生物体内MEP萜类生物合成途径受到显著影响，进而抑制微生物的生长。

已发现的IspC抑制剂主要有膦胺霉素及其结构类似物FR900098(结构式如下)，它们已被证实能够抑制疟原虫体内萜类化合物的生物合成，从而影响疟原虫正常生长。目前，膦胺霉素已经作为抗疟药物进入三期临床试验阶段。国内外很多制药企业也已将该化合物作为原料药销售，如国内的湖北民生药业有限公司，湖北众诚医药化工有限公司，及加拿大TorontoResearchChemicalsInc.公司，美国MedicalIsotopes公司，英国MOLEKULA公司，德国ServiceChemicalInc.公司等等。

R＝H,膦胺霉素；R＝Me,FR900098.

同时，很多以膦胺霉素及FR900098为先导化合物的研究正在深入展开，以期找到更好的IspC抑制剂。但是由于该类化合物具有磷酸基团和羟肟酸基团，导致它们的极性大、水溶性强，而这两个基团又是该类化合物具有生物活性的结构基础，这就使得此类化合物的缺点如口服生物利用度低、半衰期短等很难被克服。所以，寻找新的结构类型的IspC抑制剂仍然具有重要的意义。

发现内容

本发明提出一种新类型的1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构化酶(IspC)的抑制剂，它们主要是特定的几种茶多酚及茶黄素类化合物及它们的衍生物(以下统称为多酚化合物)，与膦胺霉素及FR900098相比，该类化合物极性较小，水溶性适中，能够有效地克服现有IspC抑制剂口服吸收差、生物利用度低等缺点。

本发明的方案如下：

一种1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构化酶(IspC)抑制剂，有效成分为以下化合物中的任意一种或任意配比组合：茶黄素(TF)、茶黄素3,3’-双没食子酸酯(TF3,3’G)、茶黄素-3-没食子酸酯(TF3G)、茶黄素-3’-没食子酸酯(TF3’G)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、没食子酸(G)、没食子儿茶素(GC)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)，以及TF3G、TF3’G、TF、EGC和GC的苯丙酸及其类似物的衍生物。

还进一步对其中所述TF3G、TF3’G、TF、EGC和GC的苯丙酸及其类似物的衍生物作了优选：

其中R为苯丙酰基、咖啡酰基、阿魏酰基或肉桂酰基等。

从另一方面来说，本发明确立了以上提到的任意一种化合物在制备IspC抑制剂方面的用途。本发明也因之确立了以上提到的任意一种化合物在制备抗疟药物方面的用途。

本发明较之于现有技术具有以下显著进步：

本发明确立了茶黄素(TF)、茶黄素3,3’-双没食子酸酯(TF3,3’G)、茶黄素-3-没食子酸酯(TF3G)、茶黄素-3’-没食子酸酯(TF3’G)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、没食子酸(G)、没食子儿茶素(GC)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)及它们的衍生物I-V都具有较好的抑制IspC活性。

其中，茶黄素(TF)、茶黄素-3-没食子酸酯(TF3G)、茶黄素-3’-没食子酸酯(TF3’G)、茶黄素3,3’-双没食子酸酯(TF3,3’G)、没食子儿茶素-3-没食子酸酯(GCG)及茶黄素的咖啡酸衍生物茶黄素-3-咖啡酸酯(TF3C)，茶黄素-3’-咖啡酸酯(TF3’C)，茶黄素-3,3’-双咖啡酸酯(TF3,3’C)，茶黄素-3-没食子-3’-咖啡酸酯(TF3G3’C)，茶黄素-3-咖啡酰-3’-没食子酸酯(TF3C3’G)对IspC酶均有抑制活性，其中TF3G，TF3’G和TF3,3’G及咖啡酸衍生物TF3C3’G和TF3G3’C抑制活性强，尤其是TF3’G和TF3,3’G表现出很强的IspC抑制活性，它们的IC₅₀分别为：48.8μM和39.1μM。

它们是一类具有新的结构特点的IspC抑制剂。

具体实施方式：

本发明是基于下列理论和实验方法来实现的：

1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸(DXP)在二价镁离子参与下，由还原态的辅酶NADPH提供氢被1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构化酶(IspC)催化还原异构化为2-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸(MEP)。通过检测反应中DXP消耗量的多少可以判断IspC的活性。当加入待筛选的化合物后，如果IspC活性受到抑制，则反映在反应底物DXP消耗量会减少。反应式如下：

对反应底物DXP的定量检测利用柱前衍生HPLC-UV方法实现。但由于该化合物中没有有效的生色团，因此需对其进行衍生，即在其结构中引入生色团。具体过程如下：DXP在碱性磷酸酶(CIAP)作用下水解其磷酸基团生成1-脱氧-D-木酮糖(DX)，然后DX在酸性条件下与2,4-二硝基苯肼反应生成苯腙类化合物，该化合物在360nm处紫外吸收强烈，最后利用HPLC法完成定量测定。衍生反应如下所示：

茶多酚及茶黄素类化合物及它们的衍生物是一类具有广泛生理活性的化合物，国内外许多试剂公司都有售，它们中很多化合物具有很好的抗炎、抗氧化、抗菌、抑制肥胖、抑制糖尿病等药效。

发明人通过大量研究分析，对多种茶多酚及茶黄素类化合物及它们的衍生物I-V进行了1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构化酶(IspC)抑制活性检测，以测定这些化合物及任意配比组合对该酶的抑制活性，并确立这些化合物在制备抗疟疾药物方面的用途。

经过反复测定最终发现茶黄素(TF)、茶黄素3,3’-双没食子酸酯(TF3,3’G)、茶黄素-3-没食子酸酯(TF3G)、茶黄素-3’-没食子酸酯(TF3’G)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、没食子酸(G)、没食子儿茶素(GC)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)及衍生物茶黄素-3-咖啡酰-3’-没食子酸酯(TF3C3’G)、茶黄素-3-没食子-3’-咖啡酸酯(TF3G3’C)、茶黄素-3-咖啡酸酯(TF3C)、茶黄素-3’-咖啡酸酯(TF3’C)、茶黄素-3,3’-双咖啡酸酯(TF3,3’C)都具有较好的抑制IspC活性。这些活性较好的化合物的结构式如下式所示：

衍生物(其中R为咖啡酰基)包括：

一、多酚化合物对IspC抑制活性测定

1、多酚化合物储备液配制：

分别精密称取10mg不同的所列化合物，用1mL10％的二甲基亚砜(DMSO)水溶液溶解制得不同多酚化合物储备液。

2、多酚化合物IspC抑制活性测定：

(1)阴性对照试验

试验组：分别向1.5mL离心管中依次加入：Tris-HCl(终浓度：50mM，pH7.5)，Mg²⁺(5mM)，10％DMSO水溶液(1％)，IspC(10μg/mL)，NADPH(0.1mM)，DXP(0.2mM)，加去离子水补充至终体积为100μL，37℃水浴中反应30min后，在开水中煮3min灭活IspC。

参比组：分别向1.5mL离心管中依次加入：Tris-HCl(终浓度：50mM，pH7.5)，Mg²⁺(5mM)，10％DMSO水溶液(1％)，NADPH(0.1mM)，DXP(0.2mM)，加去离子水补充至终体积为100μL，37℃水浴中反应30min后，在开水中煮3min灭活IspC。

(2)抑制活性测定试验

试验组：分别向1.5mL离心管中依次加入：Tris-HCl(终浓度：50mM，pH7.5)，Mg²⁺(5mM)，待测多酚化合物(1mg/mL，DMSO终浓度为1％)，IspC(10μg/mL)，NADPH(0.1mM)，DXP(0.2mM)，加去离子水补充至终体积为100μL，37℃水浴中反应30min后，在开水中煮3min灭活IspC。

参比组：分别向1.5mL离心管中依次加入：Tris-HCl(终浓度：50mM，pH7.5)，Mg²⁺(5mM)，待测多酚化合物(1mg/mL，DMSO终浓度为1％)，NADPH(0.1mM)，DXP(0.2mM)，加去离子水补充至终体积为100μL，37℃水浴中反应30min后，在开水中煮3min灭活IspC。

(3)DXP的水解：

上述煮沸过的各反应液冰浴10分钟后分别加入10uL的碱性磷酸酶缓冲液(500mMTris-HCl，pH9.0)和5U的碱性磷酸酶(CIAP)，在37℃水浴中反应1h，将各反应体系中的DXP水解成DX。

(4)DX的成腙实验

衍生化试剂的配置：称取2,4-二硝基苯肼(2,4-DNPH)96mg，加入4mL30％的高氯酸溶解，即得。

DX衍生化实验：取水解后的反应液，加入20μL的衍生化试剂，混匀，然后用甲醇补足体积至400μL，在37℃水浴中反应45min。

二、DX的检测及抑制率的计算

1、DX浓度的测定

取衍生后的反应液，用0.22um的微孔滤膜过滤，用HPLC检测体系中DX的含量(检测波长360nm；柱温30℃；进样量30μL；流速0.7mL/min；流动相用甲醇-水梯度洗脱(0-7min40％-60％的甲醇；7-17min60％-80％的甲醇；17-20min80％-40％的甲醇；20-23min40％的甲醇))，用外标一点法，根据液相色谱峰面积计算出DX的浓度。

2、抑制率的计算：

在实验中，由于DX是通过DXP水解得到，1mol的DXP用碱性磷酸酶水解后得到1mol的DX，所以体系中DXP的浓度就等于液相测得的DX浓度。然后根据阴性对照试验和抑制活性反应实验DXP浓度计算各多酚化合物IspC抑制率。计算公式如下：

三、多酚化合物IspC抑制结果

通过测定，多酚化合物的IspC抑制结果见表1

表1所列多酚化合物及衍生物IspC酶抑制率

进一步测定了茶黄素(TF)，茶黄素3,3’-双没食子酸酯(TF3,3’G)，茶黄素-3-没食子酸酯(TF3G)，茶黄素-3’-没食子酸酯(TF3’G)，没食子酸儿茶素-3-没食子酸酯(GCG)及表没食子酸儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)及茶黄素的咖啡酸衍生物茶黄素-3-咖啡酸酯(TF3C)，茶黄素-3’-咖啡酸酯(TF3’C)，茶黄素-3,3’-双咖啡酸酯(TF3,3’C)，茶黄素-3-没食子-3’-咖啡酸酯(TF3G3’C)，茶黄素-3-咖啡酰-3’-没食子酸酯(TF3C3’G)抑制IspC的半抑制浓度IC₅₀，结果见表2.

表2所列多酚化合物及衍生物抑制IspC的半抑制浓度IC₅₀

以上测定结果表明，茶黄素(TF)，茶黄素3,3’-双没食子酸酯(TF3,3’G)，茶黄素-3-没食子酸酯(TF3G)，茶黄素-3’-没食子酸酯(TF3’G)，没食子酸儿茶素-3-没食子酸酯(GCG)及茶黄素的咖啡酸衍生物茶黄素-3-咖啡酸酯(TF3C)，茶黄素-3’-咖啡酸酯(TF3’C)，茶黄素-3,3’-双咖啡酸酯(TF3,3’C)，茶黄素-3-没食子-3’-咖啡酸酯(TF3G3’C)，茶黄素-3-咖啡酰-3’-没食子酸酯(TF3C3’G)对IspC酶均有抑制活性，其中TF3G，TF3’G和TF3,3’G及咖啡酸衍生物TF3C3’G和TF3G3’C抑制活性强，尤其是TF3’G和TF3,3’G表现出很强的IspC抑制活性。

Claims

1.一种1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构化酶(IspC)抑制剂，其特征在于，有效成分为以下化合物中的任意一种或任意配比组合：

茶黄素(TF)、茶黄素3,3’-双没食子酸酯(TF3,3’G)、茶黄素-3-没食子酸酯(TF3G)、茶黄素-3’-没食子酸酯(TF3’G)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、没食子酸(G)、没食子儿茶素(GC)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)，以及TF3G、TF3’G、TF、EGC和GC的苯丙酸及其类似物的衍生物；

其中，前十种化合物的结构式分别如下：

2.根据权利要求1所述的1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构化酶(IspC)抑制剂，其特征在于，所述TF3G、TF3’G、TF、EGC和GC的苯丙酸及其类似物的衍生物结构式分别如下：

其中R为苯丙酰基、咖啡酰基、阿魏酰基或肉桂酰基。

3.权利要求1或2中所记载的任意一种化合物在制备IspC抑制剂方面的用途。

4.权利要求1或2中所记载的任意一种化合物在制备抗疟药物方面的用途。