CN105255797B - 一种自生固氮菌mbc7及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种自生固氮菌(弗氏柠檬酸杆菌Citrobacter freundii)MBC7，其保藏号为CGMCC No.10823，保藏日期为2015年5月19日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。该菌株在干旱、大温差、盐碱灾害和强烈的紫外线辐射下依然能够生存繁殖并具有固氮活性。其制成的菌剂能够施用于干旱、大温差、盐碱灾害和高紫外线辐射的生态系统，并且能够增加这些生态系统的氮素积累，可以起到改良土壤环境的作用，提高微生物和植物的生理活性，增加净初级生产力。

Description

一种自生固氮菌MBC7及其应用

技术领域

本发明属于生物固氮领域，具体涉及一种自生固氮菌MBC7及其应用。

背景技术

荒漠生态系统占全球面积的41％(Delgado-Baquerizo，et al.，2013)，其净初级生产力约占陆地生态系统生产力的20％(Whittaker，1975)。在荒漠生态系统当中，土壤氮素养分的匮乏严重地限制了系统净初级生产力(Asner，et al.，2003，Crutsinger，et al.，2013，Reich，et al.，2006)。而且荒漠化还在进一步发展，导致了土地退化，氮素养分流失严重。

自然环境中的氮素输入方式主要为生物固氮。固氮作用增加土壤可利用氮含量，为微生物和植物补充氮素促进其生长和代谢，以增加生态系统的初级生产力，并且对于生态系统的氮素循环也有着至关重要的作用。生物固氮主要有共生固氮和自生固氮。由于荒漠地区环境条件恶劣，植被稀少，因此可以进行共生固氮的豆科植物也十分稀少，自生固氮是荒漠生态系统最主要的氮素输入方式。因此，自生固氮对于荒漠化防治工作和荒漠生态系统的恢复有重大意义。

为了帮助荒漠化防治工作，对于荒漠土壤自生固氮菌的研究和应用迫在眉睫。目前对于固氮细菌的报道仍以共生固氮菌剂为主，对于自生固氮菌的报道非常少。而且这些少量已知的自生固氮细菌对环境温度和湿度等环境条件均有要求，抗逆性较差，多应用于农田或者堆肥当中，不适于环境条件恶劣的荒漠生态系统。

因此有必要提供一种抗逆性强、适用于荒漠生态系统的具有自生固氮能力的固氮菌株。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适用于干旱、温差大、盐碱灾害和高紫外线强度并且可以自生固氮的菌株，以增加土壤固氮活性和有效氮含量。

为达到以上目的，本发明提供了一种自生固氮菌(弗氏柠檬酸杆菌Citrobacterfreundii)MBC7，其保藏号为CGMCC No.10823，保藏日期为2015年5月19日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

上述菌株为Citrobacter freundii。菌株Citrobacter freundii(菌种名)-MBC7(菌株名)，是将荒漠地区的表层土壤用无菌装置采集低温条件在带回实验室，经过分离、纯培养，革兰氏染色、固氮活性检测和16srDNA测序所得。

形态特性：格兰仕阴性杆菌、无芽孢和荚膜。

培养特性：该菌株在SFC增菌液中成君君混浊生长，在WS平板上成中等大小，透明，边缘整齐的扁平菌落。阿须贝培养基上于28℃-30℃培养3-7天后，生长良好，边缘整齐的扁平菌落。

生理特性：被检测菌株呈现氧化酶阴性、动力反应样性，尿素酶样性，能发酵分解葡萄糖，乳糖，产酸产气，三糖铁琼脂斜面37℃24h未见H₂S产生,置48小时后斜面下层有H₂S产生。在SMAC平皿上其菌落为光滑、湿润、凸起、无色半透明。能还原硝酸盐为亚硝酸盐,山梨醇迟缓发酵,枸橼酸盐利用试验阳性。

功能特性：通过斜面阿须贝培养基培养，用乙炔还原法测定，该菌株表现出了固氮活性。

本发明还提供了含有所述自生固氮菌MBC7的菌剂。所述菌剂可以为液体菌剂，也可以为固体菌剂。

可选的，所述菌剂中还含有菌体吸附材料，所述菌体吸附材料选自草炭、珍珠岩、蛭石粉和微粉碳酸钙中的至少一种。

可选的，在所述菌剂中，自生固氮菌MBC7的含量为2.1×10⁸-2.9×10⁸cfu/g。

优选的，在所述菌剂中，自生固氮菌MBC7的含量为2.9×10⁸cfu/g。

可选的，所述菌剂的pH值为6.8-7.2。

本发明还提供了所述菌剂的制备方法，包括以下步骤：

将所述自生固氮菌MBC7接种于一级斜面培养基中，在28-30℃培养3-5天，获得一级菌株；将所述一级菌株接种于二级液体培养基中，在28-30℃条件下震荡培养2-3天，获得二级菌株；将所述二级菌株接种于三级固体培养基中，在28-30℃条件下培养在1-2天后获得三级菌株；将所述三级菌株与草炭按照(2.1×10⁸-2.9×10⁸)cfu/g的配比混匀匀后获得菌剂，优选为2.9×10⁸cfu/g；

其中，所述一级斜面培养基的配方为：KH₂PO₄ 0.2g/L，MgSO₄ 0.2g/L，NaCl 0.2g，CaCO₃ 5.0g，甘露醇10.0g，CaSO₄ 0.1g，pH 7.0，琼脂20g，蒸馏水1000mL；

二级液体培养基的配方为：KH₂PO₄ 0.2g/L，MgSO₄ 0.2g/L，NaCl 0.2g，CaCO₃5.0g，甘露醇10.0g，CaSO₄ 0.1g，pH 7.0，蒸馏水1000mL；

三级固体培养基的配方为：甘露醇10.0g，酵母粉1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，K₂HPO₄0.5g，NaCl 0.1g，CaCl₂ 0.05g，Rh微量元素液4.0mL，H₂O 1000mL，琼脂20g，pH 6.8-7.0。

本发明还提供了所述自生固氮菌MBC7或所述的自生固氮菌剂在土壤改良中的应用。

可选的，所述应用包括将所述菌剂和砂土按质量比1:9-11混合均匀后施用于土壤表面。

可选的，所述菌剂的用量为420-560g菌剂/亩。

发明提供了一种自生固氮细菌，通过乙炔还原法直接测得其固氮活性为25.77nmol/μL·h。该菌株是从宁夏地区的荒漠生态系统环境提取的。该地区气候干旱；全年以及昼夜温差大(冯薇,2014)；土壤盐碱灾害严重，紫外线非常强烈，尤其夏季紫外线强度高达到200-533μW/cm²(蒲爱萍,et al.,2005)，辐射指数在8级左右。而一般情况下在辐射强度在70-130μW/cm²的紫外线下，辐射时间从15s到30min不等，杀菌率可达99％以上(李香云,et al.,2006,张凤才and袁而森,1988,张福云and况凡,2005)。普通灭菌条件的紫外线强度和照射时均明显低于宁夏夏季的紫外线强度。该菌株在干旱、大温差盐碱灾害和强烈的紫外线辐射下依然能够生存繁殖并具有固氮活性，尤其该细菌对紫外线的高度抗性是一般细菌所不具备的，在全球气候变化臭氧空洞增加紫外线辐射日益强烈的今天来说，更加具有生态学意义和广阔的应用价值。其制成的菌剂能够施用于干旱、高紫外线辐射的生态系统，并且能够增加这些生态系统的氮素积累，可以起到改良土壤环境的作用，提高微生物和植物的生理活性，增加净初级生产力。实验表明，将该菌剂接种在宁夏西南缘无固氮活性的裸沙表面一年之后，其表层可以检测到固氮活性，为243.62n mol C₂H₂m^-2h^-1，并且有效氮也增加了由3.16mg kg^-1增加到了11.5mg kg^-1。简单说，该菌株制成的菌剂有制作简单、低成本、抗干旱、高紫外线抗性和固氮等优点。

保藏信息：保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心ChinaGeneral Microbiological Culture Collection Center(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)；保藏日期是2015年05月19日；该保藏中心登记入册编号为CGMCC No.10823；该保藏中心建议的分类命名是弗氏柠檬酸杆菌Citrobacter freundii；菌株编号为MBC7。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1

该菌株是从宁夏地区的荒漠生态系统表层提取的。该地区气候干旱；全年和昼夜温差大(冯薇,2014)；紫外线非常强烈，尤其夏季紫外线强度高达到200-533μW/cm²(蒲爱萍,et al.,2005)，辐射指数在8级左右。而一般情况下在辐射强度在70-130μW/cm²的紫外线下，辐射时间从15s到30min不等，杀菌率可达99％以上(李香云,et al.,2006,张凤才and袁而森,1988,张福云and况凡,2005)。普通灭菌条件的紫外线强度和照射时均明显低于宁夏夏季野外的紫外线强度，因而该菌株具有对紫外线具有高度抗性。

称取表层土壤样品10g并放入带有玻璃珠的100mL的无菌水中静置20min，在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min，即成土壤悬液。用无菌移液管分别吸取5.0mL上述土壤悬液加入45mL无菌水中稀释，用无菌移液管将菌悬液加至固体阿须贝培养基上，于28℃的条件下培养。以平板划线法纯化菌株。本发明所用的阿须贝培养基的配方为：KH₂PO₄ 0.2g/L，MgSO₄ 0.2g/L，NaCl 0.2g，CaCO₃ 5.0g，甘露醇10.0g，CaSO₄ 0.1g，pH 7.0，琼脂20g，蒸馏水1000mL。

将筛选出来细菌进行格兰氏染色，然后在显微镜(OLYMPUS BX51)下观测细菌形态并拍照。

然后用移液枪将培养基中的纯化菌落50μL接种到斜面阿须贝固体培养基上，放在培养箱里(30℃)培养三天，然后用乙炔还原法测定固氮酶活性。预实验结果表明加入20％的C₂H₂时，样品所表现的固氮活性最高，所以本实验中C₂H₂量占培养容器体积的20％。为了使实验能够和今后同类实验比较，将样品在光照培养箱中培养以保证精确的环境条件。为了使结果更加接近真实值，培养条件模拟研究区夏季的环境条件。培养时间为24h，前16h有光照，同时温度为25℃，后8小时无光照，同时温度为15℃。培养完毕后从锥形瓶中抽取50μL样气，注人已走稳基线的气相色谱仪(日立163型气象色谱仪)中测定乙烯生成量。用乙烯生成量(nmol C₂H₄/m^-2h^-1)描述该固氮菌株的固氮活性，为25.77n mol/μL·h。

将表现出然后用16S rDNA序列识别的方法对分离出的具有固氮活性的细菌进行鉴定，过程如下：用苯酚和氯仿提取细菌DNA，用异丙醇溶解，于4℃保存。然后以1.0μl(10pmol/μl)27f和1.0μl(10pmol/μl)1496r作为引物，1.5μl细菌DNA为模板，加入0.3μL(2.5mmol/L each)dNTPs和18.7μl ddH₂O，配成25μl反应体系。将此进行PCR反应，30个循环，变性、退火和延伸温度分别是94℃、52℃和72℃，该反应在ABI－2720仪器上完成。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，样品于-20℃保存。将PCR产物送至华大基因公司测序，将所测序列与NCBI数据库中已报导的模式细菌序列进行相似性比较，本文认为序列相似度大于98％的菌株与模式细菌同种。

实施例2

将自生固氮菌MBC7接种于一级斜面培养基中，在30℃培养4天，获得一级菌株；将一级菌株接种于二级液体培养基中，在30℃条件下震荡培养3天，获得二级菌株；将二级菌株接种于三级固体培养基中，在30℃条件下培养在2天后获得三级菌株；将三级菌株与草炭接触混匀后获得菌剂；使得菌剂中自生固氮菌MBC7的含量为2.9×10⁸cfu/g，菌剂的pH值为7.0。

其中，所述一级斜面培养基的配方为：KH₂PO₄ 0.2g/L，MgSO₄ 0.2g/L，NaCl 0.2g，CaCO₃ 5.0g，甘露醇10.0g，CaSO₄ 0.1g，pH 7.0，琼脂20g，蒸馏水1000mL；

二级液体培养基的配方为：KH₂PO₄ 0.2g/L，MgSO₄ 0.2g/L，NaCl 0.2g，CaCO₃5.0g，甘露醇10.0g，CaSO₄ 0.1g，pH 7.0，蒸馏水1000mL；

三级固体培养基的配方为：甘露醇10.0g，酵母粉1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，K₂HPO₄0.5g，NaCl 0.1g，CaCl₂ 0.05g，Rh微量元素液4.0mL，H₂O 1000mL，琼脂20g，pH 6.8-7.0。

所述Rh微量元素液：H₃BO₃ 5.0g，Na₃MoO₄ 5.0g，H₂O 1000mL。

实施例3

将实施例2中制备的菌剂与砂土按照质量比1:10混匀后获得混合物，再将该混合物洒在毛乌素沙地南缘土壤表层，菌剂的用量为用量约为500g菌剂/亩。

将该菌剂接种在毛乌素沙地南缘无固氮活性的裸沙表面一年之后，其表层可以检测到固氮活性，为243.62n mol C₂H₂m^-2h^-1，并且土壤有效氮也由3.16mg kg^-1增加到了11.5mg kg^-1。

毛乌素沙地自然环境条件十分恶劣，主要灾害天气有干旱、紫外线过强、大风、沙暴、干热风、霜冻、冰雹等，不利于动植物和微生物的生存和繁育。毛乌素沙地属于典型中温带大陆性气候，其气候控制因子主要为西北环流，尤其是长时间控制的北方大陆气团，因此昼夜温差较大，且平均气温较低，约为6-7℃；该地区气候干旱，平均降水量大约为280mm，年潜在蒸发量为2100-2500mm，无霜期为128d，绝对无霜期为100d；风沙灾害严重，主风向为西北风，年平均风速约为2.8m s^-1，最大风速可达15-18m s^-1，当年11月至次年4月多出现大风天，大风日数是45.8d，最多可达52d，年平均沙暴日数为20.6d；土壤盐碱程度很高，pH为8.7-9.2；紫外线非常强烈，尤其夏季紫外线强度高达到200-533μW/cm²，辐射指数在8级左右。该菌株的发现和其菌剂的接种效果说明了对于干旱、温差大、风沙、盐碱灾害和强紫外线辐射具有优良的耐受能力，可以有效地增加土壤的氮素输入能力，增加了土壤有效氮含量。尤其，在紫外线辐射强度为70-130μW/cm²时，辐射时间从15s到30min不等，杀菌率通常可达99％以上。上述普通灭菌条件的紫外线强度和照射时均明显低于毛乌素沙地南缘夏季野外的紫外线强度和时间，说明了该菌株以及菌剂比之一般的绝大多数细菌具有特殊的高紫外线抗性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (11)

1.一种自生固氮菌弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)MBC7，其保藏号为CGMCCNo.10823，保藏日期为2015年5月19日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.含有权利要求1所述自生固氮菌MBC7的菌剂。

3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂中还含有菌体吸附材料，所述菌体吸附材料选自草炭、珍珠岩、蛭石粉和微粉碳酸钙中的至少一种。

4.根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于，所述菌体吸附材料为草炭。

5.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于，在所述菌剂中，自生固氮菌MBC7的含量为2.1×10⁸-2.9×10⁸cfu/g。

6.根据权利要求5所述的菌剂，其特征在于，在所述菌剂中，自生固氮菌MBC7的含量为2.9×10⁸cfu/g。

7.根据权利要求2-6中任意一项所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂的pH值为6.8-7.2。

8.权利要求2-7中任意一项所述的菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将所述自生固氮菌MBC7接种于一级斜面培养基中，在28-30℃培养3-5天，获得一级菌株；将所述一级菌株接种于二级液体培养基中，在28-30℃条件下震荡培养2-3天，获得二级菌株；将所述二级菌株接种于三级固体培养基中，在28-30℃条件下培养在1-2天后获得三级菌株；将所述三级菌株与菌体吸附材料按照菌剂中自生固氮菌MBC7的含量为2.1×10⁸-2.9×10⁸cfu/g的配比混匀后获得菌剂；

其中，所述一级斜面培养基的配方为：KH₂PO₄ 0.2g/L，MgSO₄ 0.2g/L，NaCl 0.2g，CaCO₃5.0g，甘露醇10.0g，CaSO₄ 0.1g，pH7.0，琼脂20g，蒸馏水1000mL；

二级液体培养基的配方为：KH₂PO₄ 0.2g/L，MgSO₄ 0.2g/L，NaCl 0.2g，CaCO₃ 5.0g，甘露醇10.0g，CaSO₄ 0.1g，pH7.0，蒸馏水1000mL；

三级固体培养基的配方为：甘露醇10.0g，酵母粉1.0g，MgSO₄〃7H₂O 0.2g，K₂HPO₄ 0.5g，NaCl 0.1g，CaCl₂ 0.05g，Rh微量元素液4.0mL，琼脂20g，H₂O 1000mL，pH6.8-7.0。

9.权利要求1所述的自生固氮菌MBC7或权利要求2-7中任意一项所述的菌剂在土壤改良中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，包括将所述菌剂和砂土按质量比1：9-11混合均匀后施用于土壤表面。

11.根据权利要求9或10所述的应用，其特征在于，所述菌剂的用量为420-560g菌剂/亩。