CN105248932B - 降低蛋鸡肠炎沙门氏菌增殖和入侵的微量元素预混料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种降低蛋鸡肠炎沙门氏菌增殖和入侵的预混料，按照质量百分比由以下组分构成：富马酸亚铁，乳酸亚铁，蛋氨酸螯合锌，丙酸锌，蛋氨酸螯合锰，硫酸铜，乙酸钴，亚硒酸钠预混剂，碘化钾预混剂，硫酸镁，碳酸钙。本发明还公开了一种降低蛋鸡肠炎沙门氏菌增殖和入侵的预混料的制备方法，该添加剂预混料不但可以提供蛋鸡所需的微量元素营养成分，更能降低普通鸡群蛋鸡沙门氏菌阳性率；降低沙门氏菌阳性鸡蛋的比例20～30％，且缩短蛋鸡排泄物携带沙门氏菌病程7～14天。

Description

降低蛋鸡肠炎沙门氏菌增殖和入侵的微量元素预混料及其制 备方法
技术领域
本发明属于于动物饲料技术领域，具体涉及一种降低蛋鸡肠炎沙门氏菌增殖和入侵的微量元素预混料，本发明还提供一种降低蛋鸡肠炎沙门氏菌增殖和入侵的微量元素预混料的制备方法。
背景技术
沙门氏菌(Salmonella Enteritidis phage type 4)是危害蛋鸡生产的主要病原菌之一。蛋鸡沙门氏菌感染不仅导致肠道炎症反应、腹泻和生产性能下降，而且由携带沙门氏菌蛋鸡及其产品引起的食品安全问题已经成为一个人类公共卫生方面关注的热点。目前，蛋鸡生产上主要应用抗生素和疫苗来预防和治疗沙门氏菌感染，但由于抗生素药物使菌株易产生抗药性、疫苗的生产跟不上沙门氏菌血清型的变化，肉鸡沙门氏菌病的防控已成为全球性的难题。
铁、铜、锰和锌是动物必需的营养素，作为机体多种酶的辅基或辅因子广泛参与体内的一系列代谢活动，包括基因的转录、翻译，细胞增殖、分化及细胞内信号传导等方面的调节，在机体的免疫机能、内分泌调节、蛋白质和核酸代谢等等过程中发挥重要作用。同时，铁、锌和锰也是微生物尤其是病原沙门氏菌繁殖必需的营养物质。因此，这为通过铜、铁、锰和锌的营养调控来蛋鸡沙门氏菌的增殖与入侵奠定了理论基础。
铁在动物体沙门氏菌感染过程中具有重要的调节作用。沙门氏菌引起肠粘膜上皮组织产生炎症反应，产生大量的自由基，导致组织氧化损伤，这可能与上皮组织细胞中铁的含量增加有关(Millar等，2000)。利用大鼠沙门氏菌结肠炎模型的研究发现，肠道铁离子缺乏能够改善组织损伤的严重程度(Bergeron等，2003)，而口服铁离子反而加重了肠道上皮组织的炎症反应和组织损伤(Seril等，2002)。沙门氏菌肠炎还能引起动物贫血或血红蛋白含量降低，70％的沙门氏菌肠炎病人机体也呈现铁缺乏症状(Wilson等，2004)。沙门氏菌肠炎引起的铁缺乏必将通过铁参与的酶影响机体的多个代谢过程，降低机体的抗病能力。另外，铁水平影响病原菌诱导上皮细胞和单核巨噬细胞产生细胞因子、趋化因子。体外研究发现，高铁降低了人结肠癌细胞产生转化生长因子(TGF-β1)和单核细胞趋化蛋白(MCP-1)，而感染沙门氏菌后增加了TGF-β1、MCP-1和肿瘤坏死因子(TNF-α)的表达量(Fosteria等，2001)。铁缺乏的大鼠，肠粘膜上皮组织中IL-1的含量明显降低(Byrd和Horwitz，1989)。贫血婴儿注射LPS后，其单核巨噬细胞分泌的TNF-α显著升高。高水平铁增加大鼠肺泡巨噬细胞IL-1和TNF-α的分泌(Peppercorn，1993)。因此，铁可能通过影响肠道上皮细胞的免疫识别和免疫调节及吞噬细胞清除病原菌能力调节肠道抵抗沙门氏菌感染。
铜与动物的免疫功能有着密切的关系。铜参与机体免疫功能调节，缺铜可引起免疫功能下降。鼠伤寒沙门氏菌的感染试验发现，铜缺乏大鼠比对照组死亡率高，存活时间短；这可能是缺铜鼠的网状内皮系统对感染的反应降低所致(Tocco-Bradley等，1985)。比较两种小鼠对急性和迟发性过敏应答的效应，发现缺铜不影响小鼠对急性过敏的应答，却能明显延迟小鼠对臭氧的迟发接触过敏的应答。大肠埃希氏菌内毒素攻击和感染对鸡血清、肝、脾和法氏囊中铜含量动力学变化的影响实验表明，在感染和内毒素攻击期间，血清、肝、脾和法氏囊中铜的含量均明显增加；这证明铜参与机体的免疫调节。大鼠实验性缺铜时，白细胞总数下降，中性粒细胞数减少，白细胞吞噬能力尤其是吞噬之后的杀伤能力下降，血清中补体总浓度降低。铜缺乏也使T细胞减少，淋巴细胞对抗原反应的能力减退。铜缺乏小鼠白细胞介素的水平仅为正常鼠的40％～50％，并发现在患各种感染时，血清铜升高，刺激并增加肝脏合成和释放铜蓝蛋白，有利于抵抗微生物的侵袭。而血铜升高主要与中性粒细胞及巨噬细胞被激活时分泌的一种白细胞内源性物质有关，该物质随血液到达相关靶细胞，并发挥重要的免疫调节及杀菌功能。
锰通过各种酶或辅酶参与动物体内脂肪、蛋白质和碳水化合物的代谢。Smialowicz等(1985)研究表明，通过肌肉注射MnCl2，可增加小鼠巨噬细胞的吞噬能力，提高脾脏巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬能力。饲粮中添加锰增加了小鼠巨噬细胞和自然杀伤性细胞的吞噬能力，降低了细胞内活性氧(ROS)和NO的浓度(Son等，2007)。锰离子能增加LPS诱导人和小鼠免疫细胞(中性粒细胞、巨噬细胞和单核细胞)产生的IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-γ(Rishi等，2010；Mokgobu等2012；2015)。近年来在神经生物学上的研究也发现，Mn2+能提高神经胶质细胞的先天性免疫，增加其IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α的表达与释放，促进炎症反应(Spranger等，1998；Liu等，2006；Zhang等，2010；Dodd和Filipov，2011)。在家禽上的研究发现，饲喂添加锰增加了肉鸡对绵羊红细胞的抗体滴度显著增加，且提高了对嗜碱性致敏性植物凝集素的细胞免疫能力(Gajula等，2011)。低剂量的锰离子能促进肉鸡脾脏淋巴细胞热应激蛋白的表达，促进细胞免疫；但高剂量的锰对脾脏淋巴细胞有毒性效应(Zhu等，2013)。但Liu等(2012)发现，高剂量(600～1800mg/kg饲粮)的锰降低了蛋公鸡脾脏、胸腺和法氏囊的IL-1β和IL-2基因表达及血液中水平。
锌对免疫系统的发育以及正常免疫功能的维持具有十分重要的作用(成廷水等，2004；黄艳玲等，2008)。锌缺乏减少CD4+/CD8+T细胞的比例，减少IL-2的激活，导致Th1与Th2免疫辅助T细胞的免疫功能不平衡，形成Th1介导的免疫通路的缺失(Beck等，1997；Prasad等，1998)。已有研究表明，锌具有“营养免疫作用”(Thomas等，2010)。鼠在感染葡萄球菌或沙门氏菌或注射鼠伤寒沙门氏菌时，引起体内锌稳衡代谢改变、体内和细胞内锌的重分配，表现出血清和粒细胞质中的Zn含量显著下降，而在肝、脾等组织锌富集，这种改变有益于宿主的免疫应激和抗感染，一方面抑制血液中依赖于锌的细菌的生长，另一方面促进肝脏中蛋白(或酶)的合成以及脾脏中淋巴细胞的增殖以便宿主对应激和病原感染作出及时有益的反应。因此，供给适宜的锌水平可以发挥锌抗沙门氏菌的作用。邵玉新等(2012)报道感染鼠伤寒沙门氏菌降低肉仔鸡盲肠微生物多样性及均匀度,导致生产性能降低；日粮中添加锌一定程度上阻止沙门氏菌在肠道的定植、有利于稳定肉仔鸡肠道微生物区系，改善肉仔鸡生产性能。张炳坤等(2012)报道，日粮中添加锌有利于改善鼠伤寒沙门氏菌感染导致的肉仔鸡肠黏膜屏障功能障碍，并且此作用可能与促进回肠黏膜claudin-1和occludin mRNA表达相关。
现有的沙门氏菌防控中利用抗生素药物使菌株易产生抗药性、疫苗的生产跟不上沙门氏菌血清型的变化。
发明内容
本发明的目的是提供一种降低蛋鸡肠炎沙门氏菌增殖和入侵的预混料，解决现在沙门氏菌防控中利用抗生素药物使菌株易产生抗药性、疫苗的生产跟不上沙门氏菌血清型的变化的问题，本发明通过营养手段来提高动物免疫力，调控营养物质在宿主和病原菌间的分配，抑制肠炎沙门氏菌增殖和入侵。
本发明所采用的技术方案是，一种降低蛋鸡肠炎沙门氏菌增殖和入侵的预混料，按照质量百分比由以下组分构成：富马酸亚铁2％-4％，乳酸亚铁2％-4％，蛋氨酸螯合锌3％-7％，丙酸锌3％-7％，蛋氨酸螯合锰8％-12％，硫酸铜1％-2％，乙酸钴0.1％-0.3％，亚硒酸钠预混剂0.5％-1.5％，碘化钾预混剂3％-5％，硫酸镁18％-22％，碳酸钙45％-50％，以上质量总量为100％。
进一步地，该预混料按照质量百分比由以下组分构成：富马酸亚铁3％，乳酸亚铁3％，蛋氨酸螯合锌5％，丙酸锌5％，蛋氨酸螯合锰10％，硫酸铜1.5％，乙酸钴0.2％，亚硒酸钠预混剂1％，碘化钾预混剂4％，硫酸镁20％，碳酸钙47.3％。
进一步地，亚硒酸钠预混剂的硒的质量含量为0.45％；碘化钾预混剂的碘质量含量为1％。
本发明所采用的第二技术方案是，一种降低蛋鸡肠炎沙门氏菌增殖和入侵的预混料的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、称量：按照质量百分比称量以下组分：富马酸亚铁2％-4％，乳酸亚铁2％-4％，蛋氨酸螯合锌3％-7％，丙酸锌3％-7％，蛋氨酸螯合锰8％-12％，硫酸铜1％-2％，乙酸钴0.1％-0.3％，亚硒酸钠预混剂0.5％-1.5％，碘化钾预混剂3％-5％，硫酸镁18％-22％，碳酸钙45％-50％，以上质量总量为100％；
步骤2、将以上各组分在常温、干燥条件下充分混合；
步骤3、将混合好的预混料产品密封保存。
进一步地，步骤2中的混合时间不超过30分钟，混合均匀度达到90％以上。
进一步地，预混料产品在真空状态下密封保存。
本发明的有益效果是：本发明根据不同微量元素及来源的理化特性、营养特性、感染应激条件下的特异功效等进行合理组合，筛选出能有效降低蛋鸡肠道沙门氏菌增殖和入侵的微量元素预混剂配方。
本发明筛选出了微量元素铁、铜、锰、锌、钴等的来源和水平，根据其功能的互补性与叠加性原理组成一种微量元素添加剂预混料配方。该添加剂预混料不但可以提供蛋鸡所需的微量元素营养成分，更能降低普通鸡群蛋鸡沙门氏菌阳性率；提高蛋鸡的抗沙门氏菌的免疫功能，降低灌服沙门氏菌蛋鸡肠道沙门氏菌的增殖及入侵蛋鸡肝脏和脾脏沙门氏菌的数量，降低沙门氏菌阳性鸡蛋的比例20～30％，且缩短蛋鸡排泄物携带沙门氏菌病程7～14天。
本发明通过营养手段提高动物免疫力、控制动物疫病发生，降低肠炎沙门氏菌在动物肠道的增殖速度、抑制其通过胃肠道进入蛋鸡组织器官，降低蛋鸡和鸡蛋沙门氏菌阳性率，缩短蛋鸡携带沙门氏菌病程。
附图说明
图1是本发明预混料对灌服沙门氏菌蛋鸡脾脏沙门氏菌数量的影响，其中，标有不同小写字母表示差异显著；
图2是本发明预混料对灌服沙门氏菌蛋鸡肝脏沙门氏菌数量的影响，其中，标有不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；
图3是本发明预混料对灌服沙门氏菌蛋鸡盲肠食糜中沙门氏菌数量的影响，其中，标有不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明提供一种降低蛋鸡肠炎沙门氏菌增殖和入侵的预混料，按照质量百分比由以下组分构成：富马酸亚铁2％-4％，乳酸亚铁2％-4％，蛋氨酸螯合锌3％-7％，丙酸锌3％-7％，蛋氨酸螯合锰8％-12％，硫酸铜1％-2％，乙酸钴0.1％-0.3％，亚硒酸钠预混剂0.5％-1.5％，碘化钾预混剂3％-5％，硫酸镁18％-22％，碳酸钙45％-50％，以上质量总量为100％。
进一步地，该预混料按照质量百分比由以下组分构成：富马酸亚铁3％，乳酸亚铁3％，蛋氨酸螯合锌5％，丙酸锌5％，蛋氨酸螯合锰10％，硫酸铜1.5％，乙酸钴0.2％，亚硒酸钠预混剂(硒的质量含量为0.45％)1％，碘化钾预混剂(碘的质量含量为1％)4％，硫酸镁20％，碳酸钙47.3％。
本发明首次研究和筛选了一种能降低蛋鸡肠道沙门氏菌增殖和入侵蛋鸡内脏和免疫器官沙门氏菌数量的微量元素预混料配方。本发明通过饲养试验，考察此微量元素预混料配方对正常状态下蛋鸡沙门氏菌阳性率和灌服沙门氏菌蛋鸡的生产性能、肠道、肝脏和脾脏沙门氏菌数量和所产鸡蛋蛋壳及内容物沙门氏菌阳性率或细菌数量的影响，发明一种可提高蛋鸡免疫功能，降低蛋鸡肠道沙门氏菌增殖及入侵内脏和免疫器官沙门氏菌数量的微量元素预混料配方，可使缩短蛋鸡排泄物沙门氏菌阳性7～14天；降低整个感染期鸡蛋阳性率20～30％。该1％微量元素添加剂预混料(按重量百分比计算)由以下组分组成：
富马酸亚铁3％，乳酸亚铁3％，蛋氨酸螯合锌5％，丙酸锌5％，蛋氨酸螯合锰10％，硫酸铜1.5％，乙酸钴0.2％，亚硒酸钠预混剂(含硒0.45％)1％，碘化钾预混剂(含碘1％)4％，硫酸镁20％，碳酸钙47.3％。
本发明中各种成分的作用：
富马酸亚铁和乳酸亚铁：为蛋鸡补充铁元素，具有自然补血作用，提高红血球的造血功能，促进细胞因子的分泌，增强免疫力；同时降低肠道的pH值，抑制肠道沙门氏菌对铁的吸收利用，降低其沙门氏菌增殖能力。
蛋氨酸螯合锌：参与蛋白质、碳水化合物和脂类代谢；作为有机锌，蛋氨酸螯合锌提高蛋鸡对锌的利用效率，抑制肠道沙门氏菌对锌的利用；增加蛋鸡的免疫功能，提高了肠道对病原菌的免疫屏障阻碍作用；锌也是机体组织细胞内Cu-ZnSOD的重要组成部分，能通过将超氧阴离子还原为羟自由基，发挥其抗氧化功能，去除氧自由基。
丙酸锌：降低肠道的pH值，使肠道内环境不适宜沙门氏菌的增殖，抑制肠道沙门氏菌的生存和繁殖，提高动物的抗菌能力。
硫酸铜：参与造血过程，与血红细胞和血红素形成过程中起催化作用，铜是机体Cu-ZnSOD的重要组成部分，通过能将超氧阴离子还原为羟自由基，发挥其抗氧化功能，去除氧自由基。较高水平的硫酸铜本身也具有一定的杀菌功能，抑制沙门氏菌的增殖。
蛋氨酸螯合锰：主要参与碳水化合物、脂类和蛋白代谢的一些酶类的组成；作为有机锰，蛋氨酸螯合锰提高蛋鸡对锰的利用效率，抑制沙门氏菌等病原菌对锰的利用；锰是机体细胞线粒体Mn-SOD的重要组成部分，能将超氧阴离子还原为羟自由基，再在过氧化氢酶的作用下生成H2O2，其具有很强的杀灭细胞内沙门氏菌的功能。
亚硒酸钠：硒为谷胱甘肽过氧化物酶的组成成分，起保护细胞膜的作用，并可防止某些疾病的发生，还具有抗应激作用。
乙酸钴：钴为蛋鸡肠道微生物生存和繁殖需要的必需微量元素，其可以有助于肠道有益菌尤其是乳酸菌和双歧杆菌的生长和繁殖；另外乙酸钴可以降低肠道pH值，抑制沙门氏菌等病原菌的生长和繁殖。
碘化钾：主要参与碳水化合物、脂类和蛋白代谢的一些酶类或激素的组成。
硫酸镁：调节肠道的酸解平衡，降低肠道pH值，抑制肠道沙门氏菌的生长和繁殖。
碳酸钙：载体或稀释剂。
本发明还提供一种降低蛋鸡肠炎沙门氏菌增殖和入侵的预混料的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、称量：按照质量百分比称量以下组分：富马酸亚铁2％-4％，乳酸亚铁2％-4％，蛋氨酸螯合锌3％-7％，丙酸锌3％-7％，蛋氨酸螯合锰8％-12％，硫酸铜1％-2％，乙酸钴0.1％-0.3％，亚硒酸钠预混剂0.5％-1.5％，碘化钾预混剂3％-5％，硫酸镁18％-22％，碳酸钙45％-50％，以上质量总量为100％。
步骤2、将以上各组分在常温、干燥条件下充分混合，混合时间不能超过30分钟，混合均匀度达到90％以上。
步骤3、将混合好的预混料产品在真空状态下密封保存，防止氧化和回潮。
肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis phage type 4)是危害蛋品安全的主要沙门氏菌。自然状态下蛋鸡舍的环境包括养殖设备、饲料、粉尘、饮水和粪便排泄物是此肠炎沙门氏菌的主要来源；昆虫和鼠类可以造成此菌的水平传播。美国农业部统计全国有7％-10％的蛋鸡群受此种沙门氏菌感染；中国尚未见此方面的统计结果。受鸡群大小、年龄和笼具使用年限的影响，成年蛋鸡感染此沙门氏菌的病程或带菌时间在4周到几个月不等；但病程持续过程中所产的鸡蛋带菌率很高，病程过后即不带此菌。携带肠炎沙门氏菌的鸡蛋是危害人类健康的主要病原。肠炎沙门氏菌通过在蛋鸡胃肠道中定植，粘附到肠粘膜细胞上，通过浸入、穿过上皮细胞后，进入内脏组织和器官包括生殖系统；因此，控制肠炎沙门氏菌在肠道中的增殖和入侵是防控此沙门氏菌的关键。
本发明采用有机酸微量元素络合物(富马酸亚铁、乳酸亚铁和丙酸锌)一方面可以减少其在蛋鸡肠道中的解离，降低沙门氏菌对铁和锌在肠道中的吸收和利用；另一方面，解离的酸根离子可以降低肠道的pH值，抑制沙门氏菌增殖。体外pH3.0条件下30分钟，pH4.0条件下6小时沙门氏菌就停止增殖；体外有机酸(丁酸和乳酸)处理肠炎沙门氏菌能降低其入侵鸡小肠上皮细胞中的数量。富马酸亚铁和乳酸亚铁的含量要严格控制在2-4％；低于2％不能满足蛋鸡对铁的需要，降低机体蛋白质和能量代谢效率；高于4％增加了解离亚铁离子的数量，增加了沙门氏菌的利用，有利于沙门氏菌的增殖。低铁降低了沙门氏菌的增殖和毒力效力；降低沙门氏菌对小肠上皮细胞的粘附和入侵数量。
本发明利用硫酸铜1％-2％，可提高蛋鸡体内铜的含量和营养状态，从而提高蛋鸡的免疫功能；另外高水平的硫酸铜在一定程度上能杀灭肠道中的沙门氏菌。大鼠实验性缺铜时，白细胞总数下降，中性粒细胞数减少，白细胞吞噬能力尤其是吞噬之后的杀伤能力下降，血清中补体总浓度降低。铜缺乏小鼠白细胞介素的水平仅为正常鼠的40％～50％。而血铜升高主要与中性粒细胞及巨噬细胞被激活时分泌的一种白细胞内源性物质有关，该物质随血液到达相关靶细胞，并发挥重要的免疫调节及杀菌功能。
本发明利用蛋氨酸螯合锰8％-12％可以提高蛋鸡体内锰的营养状态，促进细胞免疫。高于12％易对蛋鸡组织产生损伤；低于8％的无机锰吸收率低，无法提高蛋鸡体内锰的含量。锰可增加小鼠巨噬细胞的吞噬能力，提高脾脏巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬能力。饲粮中添加锰增加了小鼠巨噬细胞和自然杀伤性细胞的吞噬能力，降低了细胞内活性氧(ROS)和NO的浓度。饲喂添加锰增加了肉鸡对绵羊红细胞的抗体滴度显著增加，且提高了对嗜碱性致敏性植物凝集素的细胞免疫能力；但高剂量的锰对脾脏淋巴细胞有毒性效应。
本发明利用蛋氨酸螯合锌3％-7％，丙酸锌3％-7％，降低其在肠道内的解离，可以提高蛋鸡对锌的吸收和利用。高于7％将超过中国配合饲料中关于微量元素的限量标准，低于3％不能提高蛋鸡体内锌的营养状态。锌具有“营养免疫作用”。锌对免疫系统的发育以及正常免疫功能的维持具有十分重要的作用。锌缺乏减少CD4+/CD8+T细胞的比例，减少IL-2的激活，导致Th1与Th2免疫辅助T细胞的免疫功能不平衡，形成Th1介导的免疫通路的缺失。日粮中添加锌有利于改善鼠伤寒沙门氏菌感染导致的肉仔鸡肠黏膜屏障功能障碍，并且此作用可能与促进回肠黏膜claudin-1和occludinmRNA表达相关。
本发明利用硫酸镁18％-22％，调节肠道的酸碱平衡，降低肠道的pH值，抑制沙门氏菌的增殖。但高于22％的硫酸镁容易使蛋鸡吸收过量的镁，抑制钾、钠等阳离子的吸收，造成动物腹泻。低于18％的硫酸镁，对肠道pH值的降低作用效果不明显。
本发明利用乙酸钴0.1％-0.3％，亚硒酸钠预混剂0.5％-1.5％，碘化钾预混剂3％-5％，目的在于提供蛋鸡所需要的钴、硒和碘3种微量元素。利用碳酸钙45％-50％，目的在于充分混匀和稀释各种微量元素，作为载体和稀释剂使用。
本发明的目的是合理搭配不同来源和水平的微量元素组合配方来提高蛋鸡抗沙门氏菌感染的免疫功能，降低肠道肠炎沙门氏菌的增殖，抑制其从胃肠道入侵蛋鸡组织器官，降低鸡蛋沙门氏菌污染比率，缩短蛋鸡携带沙门氏菌时间。
为了达到上述目的，本发明进行了系统研究，以20～50周龄罗曼粉蛋鸡为试验动物，在自然和人工感染条件下饲喂含1％该发明预混料，探明该预混料在自然状态下能降低普通鸡群沙门氏菌阳性率；在人工感染条件下，能提高蛋鸡抗沙门氏菌感染的免疫能力，降低蛋鸡肠道沙门氏菌增殖数量，降低肝脏和脾脏的沙门氏菌感染率和沙门氏菌数量，通过此途径降低鸡蛋沙门氏菌阳性率，缩短蛋鸡排泄物携带沙门氏菌的时间。
实施例1
一种降低蛋鸡肠炎沙门氏菌增殖和入侵的预混料的制备方法，包括以下步骤：按照质量百分比称量以下组分：富马酸亚铁3％，乳酸亚铁3％，蛋氨酸螯合锌5％，丙酸锌5％，蛋氨酸螯合锰10％，硫酸铜1.5％，乙酸钴0.2％，亚硒酸钠预混剂(含硒0.45％)1％，碘化钾预混剂(含碘1％)4％，硫酸镁20％，碳酸钙47.3％，以上质量总量为100％。将以上各组分在常温、干燥条件下充分混合，混合时间不能超过30分钟，混合均匀度达到90％以上。将混合好的预混料产品在真空状态下密封保存，防止氧化和回潮。
实施例2
一种降低蛋鸡肠炎沙门氏菌增殖和入侵的预混料的制备方法，包括以下步骤：按照质量百分比称量以下组分：富马酸亚铁2％，乳酸亚铁4％，蛋氨酸螯合锌7％，丙酸锌3％，蛋氨酸螯合锰8％，硫酸铜2％，乙酸钴0.1％，亚硒酸钠预混剂1.5％，碘化钾预混剂3％，硫酸镁22％，碳酸钙47.4％，以上质量总量为100％。将以上各组分在常温、干燥条件下充分混合，混合时间不能超过30分钟，混合均匀度达到90％以上。将混合好的预混料产品在真空状态下密封保存，防止氧化和回潮。
实施例3
一种降低蛋鸡肠炎沙门氏菌增殖和入侵的预混料的制备方法，包括以下步骤：按照质量百分比称量以下组分：富马酸亚铁4％，乳酸亚铁2％，蛋氨酸螯合锌3％，丙酸锌4％，蛋氨酸螯合锰12％，硫酸铜1％，乙酸钴0.3％，亚硒酸钠预混剂0.5％，碘化钾预混剂5％，硫酸镁18.2％，碳酸钙50％，以上质量总量为100％。将以上各组分在常温、干燥条件下充分混合，混合时间不能超过30分钟，混合均匀度达到90％以上。将混合好的预混料产品在真空状态下密封保存，防止氧化和回潮。
实施例4
一种降低蛋鸡肠炎沙门氏菌增殖和入侵的预混料的制备方法，包括以下步骤：按照质量百分比称量以下组分：富马酸亚铁2.5％，乳酸亚铁3.5％，蛋氨酸螯合锌6％，丙酸锌7％，蛋氨酸螯合锰11％，硫酸铜1.5％，乙酸钴0.2％，亚硒酸钠预混剂1.3％，碘化钾预混剂4％，硫酸镁18％，碳酸钙45％，以上质量总量为100％。将以上各组分在常温、干燥条件下充分混合，混合时间不能超过30分钟，混合均匀度达到90％以上。将混合好的预混料产品在真空状态下密封保存，防止氧化和回潮。
实施例5验证该发明微量元素预混料对非感染状态下蛋鸡沙门氏菌阳性率的影响
本试验采用单因子试验设计，分2个处理，分别为对照组和该发明1％微量元素预混料添加组(预混料组)。选择20周龄沙门氏菌检测为阴性的罗曼粉壳蛋鸡1000只，按完全随机区组设计，随机分到10个区组中；每个重复50只，分别饲喂对照组和预混料组饲粮，试验期25周。对照组饲粮按中国鸡饲养标准(2004)中蛋鸡推荐量，采用商品微量元素预混料，微量元素组分为：60mg/kg铁、8mg/kg铜、60mg/kg锰、80mg/kg锌、0.35mg/kg碘和0.30mg/kg硒；铁、铜、锰和锌来源于硫酸盐，碘来源于碘化钾，硒来源于亚硒酸钠。试验基础饲粮为玉米-豆粕型饲粮，粉料；参考中国鸡饲养标准配制，代谢能为11.29MJ/kg、粗蛋白16.5％、可消化赖氨酸为0.75％、可消化蛋氨酸为0.34％、可消化蛋氨酸+胱氨酸为0.65％、钙3.5％、非植酸磷0.32％。饲养管理按《罗曼粉壳蛋鸡饲养管理手册》进行，自由采食和饮水。
样品采集与测定：试验结束后，利用消毒棉签在蛋鸡泄殖腔蘸取少量排泄物，利用沙门氏菌选择性培养基作涂板培养，确定其是否为沙门氏菌阳性。
表1该发明预混料对自然状态下蛋鸡沙门氏菌阳性率的影响
注：同行标有不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
实施例6验证该发明微量元素预混料对人工感染条件下蛋鸡肠道、肝脏和脾脏沙门氏菌数量及鸡蛋沙门氏菌阳性率的影响
本试验采用两因子试验设计，分4个处理，分别为对照组、对照+沙门氏菌感染组、该发明1％微量元素预混料添加组(预混料组)和预混料+沙门氏菌感染组。选择50周龄沙门氏菌检测为阴性的罗曼粉壳蛋鸡600只，按完全随机区组设计，随机分到5个区组中；每个区组4个处理，每个处理10个重复，每个重复15只。对照组饲粮按中国鸡饲养标准(2004)中蛋鸡推荐量，采用商品微量元素预混料，微量元素组分为：60mg/kg铁、8mg/kg铜、60mg/kg锰、80mg/kg锌、0.35mg/kg碘和0.30mg/kg硒；铁、铜、锰和锌来源于硫酸盐，碘来源与碘化钾，硒来源于亚硒酸钠。试验基础饲粮为玉米-豆粕型饲粮，粉料；参考中国鸡饲养标准配制，代谢能为11.00MJ/kg、粗蛋白16.0％、可消化赖氨酸为0.75％、可消化蛋氨酸为0.34％、可消化蛋氨酸+胱氨酸为0.65％、钙3.5％、非植酸磷0.32％。饲养管理按《罗曼粉壳蛋鸡饲养管理手册》进行，自由采食和饮水。饲喂10周后，沙门氏菌感染组蛋鸡灌喂浓度为5×107CFU/ml的鸡肠炎沙门氏菌1ml；对照组灌喂无菌蛋白胨缓冲液1ml。此肠炎沙门氏菌(SalmonellaEnteritidis；Phage types 4)为四川本地蛋鸡场分离得的，由四川农业大学动物医学院家禽实验室保存。
样品采集与测定：试验第1、3、7、14、21、28、42、56天，每个处理选取100只鸡利用消毒棉签在蛋鸡泄殖腔蘸取少量排泄物，利用沙门氏菌选择性培养基作涂板培养，确定其是否为沙门氏菌阳性。试验第1、3、7、14～16、21～23、28～30、42～44和56～58天选取一定数量的鸡蛋进行沙门氏菌阳性率分析。试验第1、3、7、14和21天，每个处理麻醉处死12只鸡，取肝脏、脾脏和盲肠内容物，采用梯度稀释法，测定其沙门氏菌数量；试验第3和7天取脾脏和盲肠扁桃体测定TNF-α、IL-4、IL-10、IL-12和IL-18mRNA表达水平。
统计分析：对生产性能、蛋品质指标、沙门氏菌含量数据和基因表达数据采用SAS8.0中的GLM程序进行单因素方差分析，方差分析显著者，利用Tukey法进行多重比较。对蛋品或组织沙门氏菌阳性率数据采用SAS8.0中的Freq程序进行卡方检验，利用Fisher精准概率分析进行处理效应比较；不同时间点的差异采用Rank程序进行秩和检验。0.05作为所有数据的差异显著性检验标准。
表2该发明预混料对灌服沙门氏菌蛋鸡生产性能和蛋品质的影响
注：同行标有不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
表3预混料对灌服沙门氏菌蛋鸡泄殖腔排泄物沙门氏菌阳性率的影响
灌服后的天数 对照组 1％该发明预混料添加组
第1天 48/48(100)<sup>a,A</sup> 47/48(97.9)<sup>a,A</sup>
第3天 48/48(100)<sup>a,A</sup> 48/48(100)<sup>a,A</sup>
第7天 46/48(95.8)<sup>a,A</sup> 40/48(83.3)<sup>b,B</sup>
第14天 32/48(66.7)<sup>a,B</sup> 19/48(39.5)<sup>b,C</sup>
第21天 16/48(33.3)<sup>a,C</sup> 8/48(16.7)<sup>b,D</sup>
第28天 10/48(20.8)<sup>a,CD</sup> 1/48(2.1)<sup>b,E</sup>
第42天 6/48(12.5)<sup>a,D</sup> 0/48(0)<sup>b,E</sup>
第56天 5/48(10.4)<sup>a,D</sup> 0/48(0)<sup>a,E</sup>
总计 211/384(54.9)<sup>a</sup> 163/384(42.4)<sup>b</sup>
注：同行标有不同小写字母表示差异显著(P&lt;0.05)；同列标有不同大写字母表示差异显著(P&lt;0.05)。
表4预混料对灌服沙门氏菌蛋鸡所产鸡蛋蛋壳沙门氏菌阳性率的影响
灌服后的天数 对照组 1％该发明预混料添加组
第1天 9/34(26.4)<sup>a,A</sup> 8/32(25.0)<sup>a,BC</sup>
第3天 15/33(45.4)<sup>a,AB</sup> 15/35(42.9)<sup>a,BCD</sup>
第7天 23/36(63.9)<sup>a,BC</sup> 16/35(45.7)<sup>a,CD</sup>
第14～16天 68/100(68.0)<sup>a,C</sup> 41/100(41.0)<sup>b,CD</sup>
第21～23天 65/100(65.0)<sup>a,C</sup> 45/100(45.0)<sup>b,D</sup>
第28～30天 64/100(64.0)<sup>a,C</sup> 45/100(45.0)<sup>b,D</sup>
第42～44天 46/100(46.0)<sup>a,AB</sup> 12/100(12.0)<sup>b,AB</sup>
第56～58天 42/100(42.0)<sup>a,A</sup> 2/100(2.0)<sup>b,A</sup>
总计 332/603(55.1)<sup>a</sup> 184/602(30.6)<sup>b</sup>
注：同行标有不同小写字母表示差异显著(P&lt;0.05)；同列标有不同大写字母表示差异显著(P&lt;0.05)。
表5预混料对灌服沙门氏菌蛋鸡所产鸡蛋内容物(蛋白和蛋黄混合)沙门氏菌阳性率的影响
灌服后的天数 对照组 1％该发明预混料添加组
第1天 4/34(11.8)<sup>a,A</sup> 4/32(12.5)<sup>a,ABC</sup>
第3天 10/33(30.3)<sup>a,ABC</sup> 9/35(25.7)<sup>a,D</sup>
第7天 20/36(55.6)<sup>a,DE</sup> 15/35(42.9)<sup>b,D</sup>
第14～16天 60/100(60.0)<sup>a,E</sup> 35/100(35.0)<sup>b,D</sup>
第21～23天 45/100(45.0)<sup>a,CD</sup> 20/100(20.0)<sup>b,C</sup>
第28～30天 34/100(34.0)<sup>a,BC</sup> 16/100(16.0)<sup>b,BC</sup>
第42～44天 30/100(30.0)<sup>a,AB</sup> 6/100(6.0)<sup>b,AB</sup>
第56～58天 22/100(22.0)<sup>a,AB</sup> 2/100(2.0)<sup>b,A</sup>
总计 225/603(37.3)<sup>a</sup> 107/602(17.7)<sup>b</sup>
注：同行标有不同小写字母表示差异显著(P&lt;0.05)；同列标有不同大写字母表示差异显著(P&lt;0.05)。
表6该发明预混料对灌服沙门氏菌蛋鸡肝脏沙门氏菌阳性率的影响
灌服后的天数 对照组 1％该发明预混料添加组
第1天 11/12(91.6)<sup>a,A</sup> 10/12(83.3)<sup>a,A</sup>
第3天 10/12(83.3)<sup>a,AB</sup> 10/12(83.3)<sup>a,A</sup>
第7天 9/12(75.0)<sup>a,AB</sup> 8/12(66.7)<sup>a,A</sup>
第14天 9/12(75.0)<sup>a,AB</sup> 3/12(25.0)<sup>b,B</sup>
第21天 6/12(50.0)<sup>a,B</sup> 2/12(16.7)<sup>b,B</sup>
总计 45/60(75.0)<sup>a</sup> 33/60(55.0)<sup>b</sup>
注：同行标有不同小写字母表示差异显著(P&lt;0.05)；同列标有不同大写字母表示差异显著(P&lt;0.05)。
表7该发明预混料对灌服沙门氏菌蛋鸡脾脏沙门氏菌阳性率的影响
灌服后的天数 对照组 1％该发明预混料添加组
第1天 10/12(83.3)<sup>a,</sup> 10/12(83.3)<sup>a,A</sup>
第3天 10/12(83.3)<sup>a,</sup> 10/12(83.3)<sup>a,A</sup>
第7天 7/12(58.3)<sup>a,</sup> 8/12(66.7)<sup>a,A</sup>
第14天 7/12(58.3)<sup>a,</sup> 3/12(25.0)<sup>b,B</sup>
第21天 6/12(50.0)<sup>a,</sup> 0/12(0)<sup>b,C</sup>
总计 40/60(66.7)<sup>a</sup> 31/60(51.6)<sup>b</sup>
注：同行标有不同小写字母表示差异显著(P&lt;0.05)；同列标有不同大写字母表示差异显著(P&lt;0.05)。
表8该发明预混料对感染沙门氏菌蛋鸡脾脏细胞因子mRNA表达的影响
注：同行标有不同小写字母表示差异显著(P&lt;0.05)。
表9预混料对感染沙门氏菌蛋鸡盲肠扁桃体细胞因子mRNA表达的影响
注：同行标有不同小写字母表示差异显著(P&lt;0.05)。
结果表明：由表1可见，正常饲喂1％该发明预混料显著降低了正常蛋鸡群中沙门氏菌阳性率的比例。由表2可见，1％该发明预混料增加了蛋鸡的产蛋率和蛋壳厚度，但对灌服沙门氏菌的蛋鸡产蛋率无显著影响。添加该预混料显著降低了第7、14、21、42和56天的蛋鸡沙门氏菌阳性率；添加该预混料后，蛋鸡沙门氏菌阳性率从灌服后第7天开始下降；对照组从第14天开始下降。添加该预混料后，灌服沙门氏菌蛋鸡第42天未检测出沙门氏菌；但对照组蛋鸡灌服沙门氏菌56天后仍能检测出沙门氏菌(见表3)。添加该预混料使灌服沙门氏菌蛋鸡鸡蛋蛋壳的阳性率从第14～16天显著降低(见表4)，鸡蛋内容物的阳性率从第7天显著降低(见表5)。另外，与对照组相比，该预混料添加组从第14天开始降低了肝脏和脾脏的沙门氏菌阳性率(见表6和表7)；添加该预混料显著降低了灌服沙门氏菌蛋鸡盲肠、肝脏和脾脏中沙门氏菌数量(见图1、图2和图3)。
添加该预混料提高了对照组蛋鸡脾脏IFN-γ和IL-18(见表8)，盲肠扁桃体IFN-γ、IL-12和IL-18(见表9)；但降低了盲肠扁桃体IL-4和IL-10的mRNA表达水平(见表9)。添加该预混料提高了沙门氏菌感染蛋鸡第3天盲肠扁桃体IL-12mRNA水平，降低了IL-4的mRNA表达水平；提高了沙门氏菌感染蛋鸡第7天盲肠扁桃体IL-12和IL-18的mRNA表达水平(见表9)。添加该预混料提高了沙门氏菌感染蛋鸡第3天脾脏IFN-γ和IL-18，降低了IL-10的mRNA表达水平；提高了沙门氏菌感染蛋鸡第7天脾脏IL-12和IL-18的mRNA表达水平(见表8)。添加该预混料提高了沙门氏菌感染蛋鸡第3天盲肠扁桃体IL-12mRNA水平，降低了IL-4的mRNA表达水平；提高了沙门氏菌感染蛋鸡第7天盲肠扁桃体IL-12和IL-18的mRNA表达水平(见表9)。这些提示该预混料提高了蛋鸡脾脏和盲肠扁桃体对沙门氏菌的抗感染能力和自身的免疫功能。
综上所述，该发明预混料可通过提高蛋鸡免疫能力，降低肠道沙门氏菌的增殖，来降低肠道沙门氏菌的入侵蛋鸡内脏组织和免疫器官。

Claims (5)

1.一种降低蛋鸡肠炎沙门氏菌增殖和入侵的预混料，其特征在于，按照质量百分比由以下组分构成：富马酸亚铁2%-4%，乳酸亚铁2%-4%，蛋氨酸螯合锌3%-7%，丙酸锌3%-7%，蛋氨酸螯合锰8%-12%，硫酸铜1%-2%，乙酸钴0.1%-0.3%，亚硒酸钠预混剂0.5%-1.5%，碘化钾预混剂3%-5%，硫酸镁18%-22%，碳酸钙45%-50%，以上质量总量为100%；
所述亚硒酸钠预混剂的硒的质量含量为0.45%；所述碘化钾预混剂的碘质量含量为1%。
2.根据权利要求1所述的降低蛋鸡肠炎沙门氏菌增殖和入侵的预混料，其特征在于，该预混料按照质量百分比由以下组分构成：富马酸亚铁3%，乳酸亚铁3%，蛋氨酸螯合锌5%，丙酸锌5%，蛋氨酸螯合锰10%，硫酸铜1.5%，乙酸钴0.2%，亚硒酸钠预混剂1%，碘化钾预混剂4%，硫酸镁20%，碳酸钙47.3%。
3.一种降低蛋鸡肠炎沙门氏菌增殖和入侵的预混料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、称量：按照质量百分比称量以下组分：富马酸亚铁2%-4%，乳酸亚铁2%-4%，蛋氨酸螯合锌3%-7%，丙酸锌3%-7%，蛋氨酸螯合锰8%-12%，硫酸铜1%-2%，乙酸钴0.1%-0.3%，亚硒酸钠预混剂0.5%-1.5%，碘化钾预混剂3%-5%，硫酸镁18%-22%，碳酸钙45%-50%，以上质量总量为100%；所述亚硒酸钠预混剂的硒的质量含量为0.45%；所述碘化钾预混剂的碘质量含量为1%；
步骤2、将以上各组分在常温、干燥条件下充分混合；
步骤3、将混合好的预混料产品密封保存。
4.根据权利要求3所述的降低蛋鸡肠炎沙门氏菌增殖和入侵的预混料的制备方法，其特征在于，所述步骤2中的混合时间不超过30分钟，混合均匀度达到90%以上。
5.根据权利要求3所述的降低蛋鸡肠炎沙门氏菌增殖和入侵的预混料的制备方法，其特征在于，所述预混料产品在真空状态下密封保存。
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