CN105208853B

CN105208853B - 红色菠菜植株

Info

Publication number: CN105208853B
Application number: CN201480015521.2A
Authority: CN
Inventors: J·H·登布拉贝尔
Original assignee: Ruixwang Seedling Group Corp
Current assignee: Ruixwang Seedling Group Corp
Priority date: 2013-03-13
Filing date: 2014-03-13
Publication date: 2021-07-27
Anticipated expiration: 2034-03-13
Also published as: AU2014230459B2; DK2966994T3; EP4026424A1; ES2915073T3; EP2966994A1; WO2014140209A1; CN105208853A; AU2014230459A1; EP2966994B1

Abstract

本发明涉及一种菠菜植株(Spinacia oleracea)，其包含使植株具有红色叶的遗传决定因子，其中可从包括所述遗传决定因子的菠菜植株得到遗传决定因子，其代表性种子保藏于NCIMB，保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956。

Description

红色菠菜植株

本发明涉及红色菠菜植株(Spinacia oleracea L.)。本发明还涉及这种植株的种子和子代以及得到这种植株的繁殖材料。本发明进一步涉及植株、种子和在育种程序中源自作为种质的这种植株的繁殖材料的使用。

菠菜(Spinacia oleracea L.)是作为蔬菜培育的苋科开花植物。菠菜植株的可食用部分为营养生长期的叶。在营养生长期期间，菠菜产生环状叶。这些叶在皱叶类型的情况下卷缩和卷曲、在半皱叶类型的情况下略卷缩、或光滑叶类型的情况下宽扁。菠菜植株的叶通常以新鲜剪切和袋装、新鲜成束、罐装或冷冻的形式出售。主要市售的菠菜产品是新鲜剪切和袋装菠菜。这种袋装产品或者以含有非常小、嫩的叶出售的嫩菠菜、或以含较成熟、中型的叶出售的稍成熟波菜。嫩的和稍成熟波菜叶的尺寸均小于成熟期的成束、冷冻或罐装菠菜的叶尺寸。通常成熟期嫩菠菜的叶不长于大约八厘米。这些嫩、甜的叶常用于沙拉，且还可被稍微煮熟或蒸熟。

餐馆、餐饮企业甚至超市顾客对用于沙拉或其他菜式的色彩绚丽的叶菜类蔬菜的方式改变和需求不断上升。因此，蔬菜育种公司正在寻找带有突出色彩、更好口味和多种质地的品种。

虽然菠菜(Spinacia oleracea L.)由于其诱人的口感和高营养价值而成为受欢迎的产品，但目前的波菜除了绿色不能向菜肴或沙拉混合添加更多颜色。最丰富多彩的菠菜(Spinacia oleracea L.)迄今已知为带有红色叶柄和红色粗脉(major vein)的绿色叶。这些植株具有的绿色叶带有限制在叶柄和一级、二级、和在一些情况下三级叶脉所位于的叶片区的红色叶，而在叶脉之间的叶片区是绿色的。这种植株的例子表示于图2D中。

图1示出了菠菜叶的图片和示意性示图，指示出叶柄和椎板，其通常被指示为叶片，带有一级、二级和三级叶脉。

鉴于需要带有更多红色叶的菠菜(Spinacia oleracea L.)，本发明的目的在于提供一种菠菜(Spinacia oleracea L.)植株，其具有比现有菠菜植株更多红色。

在本发明的研究中，所形成的新型菠菜植株(Spinacia oleracea L.)包括导致具有红色叶的植株的遗传决定因子，其中在至少近轴叶面(上部)叶面、优选地近轴面和远轴面(下部)叶面的叶脉之间的菠菜叶的至少部分表皮细胞包含红色素。

本发明的菠菜植株既诱人又美味。另外，它们比未携带本发明遗传性状的植株更健康。本发明植株的β花青苷含量被增多，且β花青苷已被报道过具有多种健康益处。β花青苷具有优异的抗氧化活性。而且，β花青苷已被报道过具有抗癌作用。

因此本发明提供一种菠菜植株(Spinacia oleracea L.)，包括使植株具有红色叶的遗传决定因子，其中在至少近轴叶面、优选地在近轴叶面和远轴叶面二者的叶脉之间的至少部分菠菜叶表皮细胞包含红色素，其中所述遗传决定因子被包括在菠菜植株的代表性种子中，种子所登记的NCIMB保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956。

在本文中，“菠菜”意于包括Spinacia oleracea L.。

通过半显性或不完全显性遗传决定因子确定本发明的性状。在不完全显性或半显性的情况下，杂合子的表型在亲本纯合子表型之间的中间。这种类型的遗传也可以表示为中间遗传。遗传决定因子可存在于纯合的或杂合状态以产生本发明的表型性状。

本发明的遗传决定因子表现为单一半显性或不完全显性基因座。该基因座可以是基因或等位基因并且还可以包括调控元件。

在本文中，“遗传决定因子”为潜在的基因要素，其形成本发明的表型性状。“表型性状”是表现型的，其中植株具有红色叶，其中在至少近轴叶面、优选地近轴叶面和远轴叶面的叶脉之间的菠菜叶的至少部分表皮细胞包含红色素。可互换使用“基因性状”、“性状”和“表型性状”。

菠菜(Spinacia oleracea L.)种子的代表性样品包括遗传决定因子，其存在时导致植株具有红色叶，其中在至少近轴叶面、优选地近轴叶面和远轴叶面的叶脉之间的菠菜叶的至少部分表皮细胞包含红色素，所述代表性样品在2012年4月6日于Aberdeen的NCIMB以登录号NCIMB41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956进行保藏。这些保藏物的种子纯合地包含遗传决定因子。这些保藏物不符合均一性和稳定性的要求，因此它们并不构成植物品种。

赋予本发明表型性状的遗传决定因子可转移至所有Spinacia oleracea L.类型，如半皱叶、半皱叶和光滑的菠菜类型。

本发明植株全部或部分叶的红色为紫红色、或酒红色(burgundy red-likecolour)。本领域技术人员可容易观察到本发明植株全部或部分叶的红色，还可利用RHS比色表确定(英国皇家园艺学会，伦敦，英国)。在该比色表上，本发明的红色类似于颜色187A、187B、187C、187D、N186B、N186C或N186D。

在一种实施方式中，本发明涉及一种菠菜(Spinacia oleracea L.)植株，其包含本发明的遗传决定因子，其中所述遗传决定因子以杂合状态存在。

可通过图2B描述的本发明叶的红色识别杂合地携带所述遗传决定因子的本发明植株，其任选地在植株的头两片叶已处于收获阶段时、优选地在植株的头两片叶处于完全长成时。

术语“可收获阶段”对于熟练的菠菜种植者来说是清楚的，且更具体地意为在菠菜植株开始抽薹和花序梗发育之前来自嫩叶阶段通过成熟叶阶段的叶阶段。可以互换使用“可收获阶段”、“收获阶段”和“收获期”。

熟练的菠菜种植者知道何时到达嫩叶阶段和可收获菠菜。植株在收获时越年轻，其叶越小和越嫩，这是顾客所喜欢的。另一方面，如果过早收获菠菜，种植者将在其田地上获得较少公斤的产品。熟练的菠菜种植者会平衡二者以使利润最大化。虽然可更早收获和/或以不同密度种植嫩叶菠菜，典型地以8百万种子/公顷的密度种植嫩叶菠菜，且在菠菜植株在大约10cm高时收获。在嫩叶阶段，菠菜植株典型地具有至少两片完全长大的叶。真叶意味着已经形成子叶之后开始发育的叶。

在携带杂合遗传决定因子的本发明植株中，处于收获阶段的叶至少局部是红色的。更具体地，所述植株具有红色叶柄和叶片，叶片带有红色一级和二级叶脉和在这些叶脉之间的叶的近轴叶面(例如上侧)的叶面积上有额外的微红色。这种植株的实例呈现在图2B中。在本发明的所述植株中，因此红色不限于叶柄和粗脉上的叶区域。

叶呈现携带本发明杂合遗传决定因子的微红色植株的百分比因基因背景不同而不同，但是总是高于种植于相同环境下的未携带本发明遗传决定因子的红脉菠菜植株。

在携带本发明杂合遗传决定因子的一些植株中，红色可被更多地限制在接近叶粗脉的区域，而在携带本发明杂合遗传决定因子的其它植株中，红色素可呈现在几乎遍及叶片的叶表皮细胞中。

可通过检查近轴叶面和远轴叶面的叶脉之间的菠菜叶的表皮细胞是否为红色来分析本发明的植株。可用锋利镊子和随后用透射光显微镜或者从叶近轴叶面或者从远轴面表面剥离表皮细胞层。

在携带杂合遗传决定因子的本发明的植株中，以优选增加的顺序，大约10-100％、15-90％、20-80％、30-70％的在至少近轴叶面的叶脉、优选地在近轴叶面和远轴叶面的叶脉之间的菠菜叶表皮细胞且不含气孔复合体(stomatal complex)的细胞包含红色素。更具体地，在携带杂合遗传决定因子的本发明的植株中，大约15-80％、更具体地20-80％和更具体地30-80％的在至少近轴叶面的叶脉、优选地在近轴叶面和远轴叶面的叶脉之间的菠菜叶表皮细胞且不含气孔复合体的细胞包含红色素。

在涉及菠菜(Spinacia oleracea L.)植株的本发明进一步的实施例中，植株包括纯合状态下的本发明遗传决定因子。

可通过红叶柄和红色叶识别携带杂合遗传决定因子的本发明的植株，任选地在植株已有头两片叶时/优选地在植株的头两片叶完全长成时，植株处于可收获阶段。

图2A表示出携带杂合遗传决定因子的本发明的植株的实例。

携带杂合遗传决定因子的本发明的植株具有红色的植株地上营养部分。

此处所使用的“地上营养植株部分”意指不参与有性生殖的地上植株部分，不包括下胚轴和子叶，包括叶、茎和叶柄。

已发现携带杂合遗传决定因子的本发明的植株花序和花也可具有红色。

携带纯合遗传决定因子的本发明的植株在收获阶段在植株的整个叶面具有红色。更具体地，所述植株在收获阶段在植株的整个叶面具有均匀的红色。

携带纯合遗传决定因子的本发明植株的红色地上营养部分、更具体地处于收获阶段的叶的红色为紫红色、或酒红色。

用于本申请中的红色包括被感知为紫色的颜色。

本发明植株的地上营养部分的红色可使用RHS比色表(英国皇家园艺学会，伦敦，英国)确定，优选地选自RHS码为187A、187B、187C、187D、N186B、N186C和/或N186D或其组合的颜色。更具体地，用所登记的NCIMB保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956的种子种植的植株中可见这种红色。在不同的菠菜类型或品种中，颜色可以不同，但本领域技术人员仍感知为红色。

虽然植物育种者和种植者普遍使用RHS比色表，清楚的是，可使用其它比色表或体系确定颜色。例如，还可使用Munsell颜色体系在RGB色码中指定或者可以用比色计来确定颜色。本领域技术人员已知如何使用这种不同的色彩体系和在不同色彩体系之间转换颜色。用于这些RHS颜色的RGB、CIELab和CIELCh值被列于下表中。

更具体地，携带纯合遗传决定因子的本发明植株的可收获的叶的至少近轴叶面、优选地近轴叶面和远轴面具有如上所定义的颜色。

携带纯合遗传决定因子的本发明植株的可收获叶的红色素主要定位在叶的至少近轴叶面(如图3H所描述的)、优选地近轴叶面和远轴面(如图3G所描述的)的叶表皮中。

在叶表皮内，红色素被包括在表皮细胞中，不包括气孔复合体的保卫细胞。所述红色素可存在于表皮细胞之外的其它细胞中。

在携带纯合遗传决定因子的本发明植株中，以优选增加的顺序，大约50-100％、60-100％、70-100％、80-100％、90-100％、95-100％的在至少近轴叶面、优选地在近轴叶面和远轴面之间的菠菜叶表皮细胞且不含气孔复合体的细胞包含红色素。更具体地，在携带杂合遗传决定因子的本发明植株中，大约90-100％、更具体地95-100％和最具体地99-100％的在至少近轴叶面的叶脉、优选地在近轴叶面和远轴面的叶脉之间的菠菜叶表皮细胞且不合气孔复合体的细胞包含红色素。

一种实施方式中，本发明涉及菠菜(Spinacia oleracea L.)植株，其包含本发明的遗传决定因子，其中在收获期的叶的β花青苷含量优选地以上升顺序值至少为55μg甜菜苷当量/g鲜重、60μg甜菜苷当量/g鲜重、70μg甜菜苷当量/g鲜重、80μg甜菜苷当量/g鲜重、90μg甜菜苷当量/g鲜重、100μg甜菜苷当量/g鲜重、110μg甜菜苷当量/g鲜重、120μg甜菜苷当量/g鲜重、130μg甜菜苷当量/g鲜重、140μg甜菜苷当量/g鲜重、150μg甜菜苷当量/g鲜重、160μg甜菜苷当量/g鲜重、170μg甜菜苷当量/g鲜重、180μg甜菜苷当量/g鲜重、190μg甜菜苷当量/g鲜重、200μg甜菜苷当量/g鲜重、210μg甜菜苷当量/g鲜重、220μg甜菜苷当量/g鲜重、230μg甜菜苷当量/g鲜重、240μg甜菜苷当量/g鲜重、250μg甜菜苷当量/g鲜重、300μg甜菜苷当量/g鲜重、350μg甜菜苷当量/g鲜重、400μg甜菜苷当量/g鲜重、450μg甜菜苷当量/g鲜重、500μg甜菜苷当量/g鲜重、550μg甜菜苷当量/g鲜重、600μg甜菜苷当量/g鲜重。在收获阶段的叶的β花青苷含量是适当地不高于1000μg甜菜苷当量/g鲜重。

具体地，在收获期的叶的β花青苷含量为至少55μg甜菜苷当量/g鲜重，更具体地，在成熟期的叶的β花青苷含量为至少90μg甜菜苷当量/g鲜重，甚至更具体地，在成熟期的叶的β花青苷含量为至少160μg甜菜苷当量/g鲜重，更加具体地，在成熟期的叶的β花青苷含量为至少200μg甜菜苷当量/g鲜重。

β花青苷为落入甜菜红碱(betalain)组别内的红-紫色素。甜菜红碱是源于酪氨酸的含氮水溶性化合物，记载于仅有限数量的植物谱系中(Tanaka et al，The PlantJournal(植物杂志)(2008)54，733-749)。甜菜红碱使鲜花、水果和(除了石竹科和粟米草科)其他属于石竹目的科的品种植物部分显现有绚丽色彩。来自红甜菜(Beta vulgaris)的甜菜红碱被用作天然色素。甜菜红碱的颜色的优点是不取决于pH值的颜色且比来自花青苷的颜色更稳定。甜菜红碱被归类为红色(绯红、紫色、蓝紫色)β花青苷和黄色β花青苷。它们是分别带有环-二羟基苯丙氨酸(cDOPA)葡糖苷和氨基酸或胺的甜菜醛氨酸亚铵。仅由糖基或酰基部分修改β花青苷。已偏析和识别超过50种分子物种β花青苷和几种甜菜黄素。甜菜红碱积聚在这两种营养生长和生殖组织中的表皮和真皮下组织层空泡中。

β花青苷的实施例为甜菜苷、异甜菜苷、亲甜菜苷(probetanin)、新甜菜苷(neobetanin)、苋菜红素(amaranthine)、异苋菜红素(isoamaranthine)、血苋内酯(酰化的苋菜红素)、鸡冠花素(celosianin)(酰化的苋菜红素)、千口红素I、异千口红素I、醋酸千口红素。在产生β花青苷的植株中的这些色素的每一种的相对水平和呈现或缺少在物种间产生变化。

通过在萃取缓冲液中制备试样溶液来测量在任何植株组织中的β花青苷含量，利用分光光度计和量化β花青苷吸收峰来测量吸收光谱。可选地，利用HPLC(高效液相色谱法，high-performance liquid chromatography)来测量全部β花青苷含量，可与例如MALDI-TOF(基质辅助激光解吸/电离，matrix-assisted laser desorption/ionization)或Q-TOF(串联质谱，tandem mass spectrometry)的质谱分析方法相结合。使用HPLC或质谱方法(如MALDI-TOF或Q-TOF)，可以鉴别不同β花青苷(如，例如，甜菜苷、苋菜红素或千口红素)的水平。然后通过加上被识别的不同β花青苷色素水平来计算总β花青苷含量。本领域技术人员已知如何执行这种分析和进行这种计算。

通过采用样本来测量在收获阶段的菠菜植株叶的β花青苷含量，例如在成熟叶阶段收获的大约200克鲜重的地上部分和抽样例如用作重复的5-10个植株的两种样本。

在磷酸钾缓冲液(250mM，pH＝5)的情况下，其被用作提取液，且利用分光光度计测量吸收光谱，至少确定在537nm上的吸收光谱，以确定样本的β花青苷含量。然后本领域技术人员可利用在所述磷酸钾缓冲液中的例如甜菜苷的消光系数的公式计算β花青苷的总量。在该情况下，可以μg甜菜苷当量/克鲜重(FW)给出总的β花青苷水平。

利用用作提取液的磷酸钾缓冲液(250mM，pH＝5)、利用分光光度计测量在537nm上的吸收光谱和利用在所述磷酸钾缓冲液中的甜菜苷的消光系数的公式计算β花青苷的总量来得到本文中所列出的β花青苷含量值。

本发明还涉及包含本发明遗传决定因子的菠菜(Spinacia oleracea L.)植株，其中叶在收获阶段时总叶绿素和总β花青苷在甜菜苷等式(μg总叶绿素/克鲜重量微克除以μg甜菜苷当量/克鲜重)中计算的比率以优选增大的顺序为在0.001和29之间、在0.01和25之间、在0.10和15之间、在0.25和10之间、在0.5和5之间。具体地，叶在收获阶段时总叶绿素和总β花青苷在甜菜苷等式(μg总叶绿素/克鲜重量微克除以μg甜菜苷当量/克鲜重)中计算的比率在0.10和15之间、优选地在0.5和5之间。

通过采用例如代表性样品来测量在收获期的菠菜叶的总叶绿素含量，在收获阶段、优选地在用于比较菠菜植株的大致相同阶段收获的样品地上部分鲜重大约200克，和采用例如分别用作重复的5-10个植株的两种样品。例如可通过使用分光光度计测量提取液中样品溶液的吸收光谱、量化叶绿素A和叶绿素B吸收峰并计算总叶绿素水平来确定总叶绿素含量。本领域技术人员熟知这些方法。

本发明还涉及通过杂交第一菠菜植株与第二菠菜植株来得到本发明的菠菜植株，其中至少一种所述植株包含遗传决定因子，所述遗传决定因子被包括在菠菜植株的代表性种子中，种子保藏于NCIMB，登录号为NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956，或携带遗传决定因子的其子代植株，和选择(优选地在F2代中)具有红色叶的植株，其中在至少近轴叶面、优选地在近轴叶面和远轴叶面二者的叶脉之间的至少部分菠菜叶表皮细胞包含红色素。

通过杂交野生型植株与对于本发明遗传决定因子纯合或杂合的植株来将本发明的性状带入野生型菠菜植株中，并通过选择具有红色叶的植株来选择对于杂交子代、优选地在杂交F1和F2中的期望表型，其中在至少近轴叶面、优选地在近轴叶面和远轴叶面二者的叶脉之间的至少部分菠菜叶表皮细胞包含红色素。

在使用携带杂合遗传决定因子的本发明植株时，在与野生型植株相杂交中，在杂交F1中的这种选择是必需的，因为在该情况下，仅大约50％的F1植株会携带本发明的遗传决定因子。

在使用携带杂合遗传决定因子的本发明植株与野生型植株交杂时，另一方面，通过来自杂交的所有F1植株将携带本发明杂合遗传决定因子且可被用于自交以产生F2群体，其也含有携带本发明杂合遗传决定因子的植株。

通过用例如由初始杂交和自交步骤生成的大约12粒种子繁殖F2植株、和选择呈现本发明期望性状的植株，可适当地在来自不包括遗传决定因子的植株与包括处于纯合状态的遗传决定因子的植株之间的杂交的子代中识别携带本发明遗传决定因子的导致具有红色叶性状的菠菜植株，其中在至少近轴叶面、优选地在近轴叶面和远轴叶面二者的叶脉之间的至少部分菠菜叶表皮细胞包含红色素。

可选地，通过选择呈现包括本发明杂合性遗传决定因子的植株表型性状的来自初始杂交F1植株、自花授粉所述植株和用例如大约12粒种子繁殖F2植株、和选择呈现本发明期望性状的植株，可适当地在来自不包括遗传决定因子的植株与包括处于杂合状态的遗传决定因子的植株之间的杂交的子代中识别携带本发明遗传决定因子的导致具有红色叶性状的菠菜植株，其中在至少近轴叶面、优选地在近轴叶面和远轴叶面二者的叶脉之间的至少部分菠菜叶表皮细胞包含红色素。

植株的选择可以表型地进行，这是由于用红色叶可简单地识别携带纯合状态下遗传决定因子的植株以及携带杂合状态下遗传决定因子的植株。本发明的菠菜植株的红色因此用作可视标记物。可选地，可例如通过一种或多种分子标记方式通过识别遗传决定因子识别选择。相应地可通过本领域技术中员基于保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB41956的材料来培育标记物。

在由超过一种基因负责某种性状时，可进行等位性测试以确定等价性(equivalence)。本领域技术人员进行测试以确定所有相关的基因呈现纯合性，这样测试才能正常进行。

因此可通过等位性测试确定遗传决定因子的等价性。为了执行等位性测试，材料是对于已知决定因子是纯合性的，测试植株被与待测试的用于遗传决定因子是纯合性的材料相杂交。后种植株被称为供体植株。待测试的供体植株应该是或应该制成纯合性的，以用于待测试的遗传决定因子。在观察到在供体植株与测试植株之间杂交的F2中没有用于相关遗传决定因子的表型的隔离时，供体植株和测试植株的遗传决定因子已被证明是等价的或相同的。

在一种实施方式中，本发明涉及的菠菜植株(Spinacia olercea)包含的遗传决定因子导致具有红色叶的植株，其中在至少近轴叶面、优选地在近轴叶面和远轴叶面二者的叶脉之间的至少部分菠菜叶表皮细胞包含红色素，其遗传决定因子被包含在或等同于发现于菠菜植物代表性种子中的遗传决定因子，种子的NCIMB保藏号为NCIMB 41954、NCIMB41955和NCIMB 41956，如更具体地在上面的描述中的使用等位性测试确定。

在进一步的实施方式中，本发明涉及的菠菜植株包含本发明的遗传决定因子，其中通过渗入植株可得到所述遗传决定因子，从NCIMB保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956的种子种植所述植株。

本发明进一步提供的菠菜植株包含的遗传决定因子导致具有红叶的植株，其中在至少近轴叶面、优选地在近轴叶面和远轴叶面二者的叶脉之间的至少部分菠菜叶表皮细胞包含红色素，从NCIMB保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956的种子种植的所述植株渗入所述遗传决定因子。

本申请中使用的“渗入”意指通过杂交和选择方式将性状导入未携带该性状的植株中。

根据其进一步的方面，本发明涉及的菠菜植株种子包含的遗传决定因子导致具有本发明红叶的植株，如保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956的种子。本发明的种子可包括或者杂合或者纯合遗传决定因子。

本发明还涉及能够成长成本发明菠菜植株的本发明菠菜(Spinacia oleraceaL.)植株的种子。

另外，本发明涉及使用本发明的植株，作为在育种程序中的种质，用于培育具有红色叶的菠菜植株，其中红色叶源自包含红色素的在至少近轴叶面、优选地在近轴叶面和远轴叶面二者的叶脉之间的至少部分菠菜叶表皮细胞。

本发明还涉及本发明菠菜植株的子代，其显示出本发明的红叶。可通过有性或无性繁殖本发明植株或其子代植株产生所述子代。所述子代携带造成本发明性状的遗传决定因子且存在于或者以杂合或者以纯合形式的保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB41956的种子。

当本发明遗传决定因子是纯合性呈现时，子代植株以与用种子种植的植株相同或相似的方式显示本发明性状，种子的代表性样本保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956。这意味着这种子代具有与所主张权利的本发明菠菜植株的叶相同的红色。以外，可改变植株的一种或多种其它特征。例如通过诱变或通过用转基因转化执行这种额外改变。

本文所使用的词语“子代”意指子裔或第一或所有进一步的子代，来自与显示本发明性状和/或携带引起性状的遗传决定因子的本发明植株的杂交。本发明的子代包括与携带造成本发明性状的遗传决定因子的本发明植株的任意杂交的子代。例如可通过杂交第一菠菜植株与第二菠菜植株可得到这种子代，用种子培植其中的植株之一，种子的代表性样品所登记保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956，但还可为如携带呈现在NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956中的遗传决定因子的任何其它菠菜植株。

所述子代植株包括造成本发明表型性状的一个或多个数量性状基因座(Quantitative Trait Loci，QTLs)，其中由用由种子培植的菠菜植株可得到所述遗传决定因子，种子的代表性样品所登记NCIMB保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956。因此本发明性状在菠菜植株基因组中具有遗传基础，和例如通过使用描述于实施例2中的分型方法，菠菜植株可被鉴别为本发明的植株。

本发明进一步涉及本发明的菠菜植株的部分，其适于有性和无性繁殖，即繁殖材料，其中所述繁殖材料包括造成本发明性状的遗传决定因子。这种部分例如选自小孢子、花粉、子房、胚珠、胚囊和卵细胞。

另外，本发明涉及本发明的菠菜植株的部分，其适于无性繁殖，更具体地，本发明菠菜植株的插条、根、茎、细胞、原生质体、愈伤组织和组织培养物。组织培养物包含可再生细胞，如组织培养物可源自叶、花粉、胚、子叶、下胚轴、分生细胞、根尖、花药、花、种子和茎。繁殖材料携带造成本发明性状的遗传决定因子，为纯合或杂合的形式。

本发明进一步涉及用本发明植株的所述繁殖材料种植或再生的菠菜植株，所述菠菜植株具有红色叶，其中红色叶来自包含红色素的在至少近轴叶面、优选地近轴叶面和远轴叶面的叶脉之间的至少部分菠菜叶的表皮细胞。作为本发明表型性状基础的遗传决定因子呈现在保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956的种子中。

本发明涉及本发明菠菜植株的细胞，其中所述细胞包含造成具有本发明红叶的植株的遗传决定因子，其中所述决定因子呈现在从种子种植的菠菜植株中，种子的代表性样品所登记NCIMB保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956。通过杂交菠菜植株与第二菠菜植株可得到所述菠菜植株，更具体地，用登记保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956的种子种植菠菜植株，选择用于具有本发明性状的菠菜植株。因此所述细胞包含编码本发明所述性状的遗传信息，更具体地，遗传信息基本相同于、优选完全等同于编码菠菜植物所述性状的遗传信息，从种子种植的菠菜植株，种子的代表性样品所登记保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956，更具体地等同于描述于本文中的遗传决定因子。优选地，本发明的细胞为植株或植株部分的部分，但是细胞也可为分离的形式。

在一种实施方式中，本发明涉及使用NCIMB保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956的种子，用于向另一菠菜植株传送给予本发明性状的本发明遗传决定因子。

在另一种实施方式中，本发明涉及使用菠菜植株，其携带的遗传决定因子赋予如呈现在且可得到于菠菜植株的本发明性状，用种子种植作为农作物的菠菜植株，其中种子的NCIMB保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956。

本发明还涉及菠菜植株的应用，所述菠菜植株携带的遗传决定因子赋予如呈现在菠菜植株中的本发明性状，更具体地涉及使用作为种子源的用种子种植的菠菜植株，其中种子的NCIMB保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956。

在另一种实施方式中，本发明涉及菠菜植株的应用，所述菠菜植株携带的遗传决定因子赋予如呈现在菠菜植株中的本发明性状，更具体地涉及使用作为繁殖材料源的用种子种植的菠菜植株，其中种子的NCIMB保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956。

进一步地，本发明涉及菠菜植株的应用，所述菠菜植株携带的遗传决定因子赋予如呈现在菠菜植株中的本发明性状，更具体地涉及使用种子种植的菠菜植株用于消费，其中种子的NCIMB保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956。

在另一种实施方式中，本发明涉及菠菜植株的应用，所述菠菜植株携带的遗传决定因子赋予本发明性状，呈现在种子中的等位基因用于将导致本发明性状的遗传决定因子给予菠菜植株，其中种子的NCIMB保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956。

在另一种实施方式中，本发明涉及使用菠菜植株，作为呈现在种子中的遗传决定因子的受体，种子的NCIMB保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956。

在一种实施方式中，本发明涉及的遗传决定因子包括造成本发明性状的遗传决定因子和通过引导遗传信息要求所述遗传决定因子，遗传信息通过或常规育种、或遗传修饰、更具体地通过基因顺化(cisgenesis)或基因转移(transgenesis)负责来自适当源的性状。基因顺化为以天然基因对植株进行遗传修饰，所述天然基因编码来自农作物植株本身的性状或来自性兼容的供体植物的(农业)性状。基因转移为以来自非可杂交种类的基因或以合成基因对植株进行遗传修饰。

在一种实施方式中，获取基因信息(更具体地遗传决定因子)的源通过培植保藏的种子、或通过其有性或无性的子代形成。

本发明还涉及本发明菠菜植株的收获部分或其部分，涉及包括本发明Spinaciaoleracea L.的菠菜植株的收获部分(更具体地为叶)或其部分的食品，其或者以天然形式，或任选地以加工的形式。

收获部分或食品可为或包括菠菜植株的茎、叶、叶柄、根、芽、花序、花、或任何其他部分。包括本发明菠菜植株的部分的优选食品是沙拉，其中菠菜叶可任选地与例如生菜、苦苣、菊苣、甜菜，瑞士甜菜等的其它叶相混合。

食品或收获部分可经过一个或多个加工步骤。所述加工步骤包括但不限于其中一种如下处理步骤或其结合：切割、清洗、烹饪、蒸、烤、炸、巴氏杀菌、冷冻、研磨、提取油、腌制或发酵。所得到的经加工的形式为本发明的部分。

经加工的菠菜还可被包括在另外的食品中，如馅饼、汤或者干燥或新鲜的面食制品(pasta product)，如馄饨、饺子、春卷等。这种食品通常会预先包装并意欲在超市出售。因此本发明还涉及使用本发明的菠菜植株或其部分制备食品，尤其是沙拉、馅饼、汤和面食(pasta)。

在进一步的实施方式中，本发明涉及一种容器，其包括本发明的一种或多种菠菜植株，在生长基质中，用于在居家环境中从菠菜植株收获叶。

在一个方面中，本发明涉及用于产生菠菜植株的方法，其产生具有本发明性状的植株，所述方法包括

a)杂交包含产生所述性状的遗传决定因子的植株与另一植株；

b)任选地在具有遗传决定因子的生成F1中选择植株和自交具有遗传决定因子的生成F1植株，用于得到F2植株；

c)选择在F2中具有性状的植株；

d)任选地执行一轮或更多额外轮的自交或杂交，然后选择包括/呈现本发明性状的植株。

本申请文本中的词语“性状”指表型植株。更具体地，词语“性状”指本发明性状，特别是具有红色叶的性状，其中红色叶源自包含红色素的在至少近轴叶面、优选地在近轴叶面和远轴叶面二者的叶脉之间的至少部分菠菜叶表皮细胞。术语“遗传决定因子”用于造成本发明性状的植株基因组中的遗传信息。当植株呈现本发明性状时，其基因组包含造成本发明性状的遗传决定因子。因此植株具有本发明遗传决定因子。

清楚的是，提供本发明性状的亲代不需要是直接从被保藏的种子培植的植株。亲代还可为来自种子的子代植物或来自与通过另外方式得到的具有本发明性状相同的种子的子代植物。

a)杂交包括导致所述性状的遗传决定因子的植株与另一植株；

b)任选地回交生成的F1植株与优选的亲本；

c)在F2中选择具有所述性状的植株；

d)任选地执行额外一轮或更多轮的自交或杂交，然后选择包括所述性状的植株。

本发明另外提供一种将另外期望的性状引入具有本发明性状的Spinaciaoleracea菠菜植株中的方法，所述方法包括：

a)杂交具有本发明性状的菠菜植株与包括期望性状的第二菠菜植株以产生F1子代，所述具有本发明性状的菠菜植株的代表性种子保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956；

b)选择包括本发明所述性状和期望性状的F1子代；

c)杂交所述选择的F1子代与亲代，以生成回交子代；

d)选择包括期望性状和本发明性状的回交子代；和

e)任选地重复步骤c)和d)一次或连续多次，以生成经选择的第四代或更高代的回交子代，其包括期望性状和本发明性状。本发明包括通过该方法生成的菠菜植株。

在一种实施方式中，在F1或任何其它代中选择具有本发明性状的植株。在另一方面中，在杂交或任选的回交的F2中开始本发明的性状选择。表型地进行植株的选择，其间接检测作为所述性状基础的遗传决定因子。

在一种实施方式中，在F3或更后代中开始选择具有本发明性状的植株。

在一种实施方式中，包括所述遗传决定因子的植株为近交系、混合、双单倍体、或分离群体的植株。

本发明进一步提供通过使用双单倍体产生技术来产生包含本发明性状的菠菜植株以生成具有所述性状的菠菜植株的方法。

而且，本发明涉及杂交种子，其可被培植成具有本发明性状的植株，还涉及产生这样的杂交种子的方法，所述方法包括杂交第一亲代植株与第二亲代植株以及收获得到的杂交种子，其中所述第一亲代植株和/或所述第二亲代植株为请求保护的植株。

在一种实施方式中，本发明涉及生成具有本发明性状的杂交菠菜植株的方法，包括杂交第一亲代植株与第二亲代植株以及收获得到的杂交种子，其中所述第一亲代植株和/或所述第二亲代植株具有本发明性状，并将所述杂交种子培植成具有本发明性状的杂交植株。

本发明还涉及通过使用种子产生具有本发明性状的菠菜植株的方法，其中所述种子在其基因组中包括导致本发明性状的遗传决定因子，用于培植所述菠菜植株。种子适合地是NCIMB保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956的代表性样品的种子。

本发明还涉及包括种子的生成方法，所述方法包括从NCIMB保藏号为NCIMB41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956的代表性样品的种子培植菠菜植株的，使植株生成种子，并收获那些种子。通过杂交或自交适合地生成种子。

在一种实施方式中，本发明涉及通过使用组织培养物生成具有本发明性状的菠菜植株的方法。

而且，本发明涉及通过使用无性繁殖生成具有本发明性状的菠菜植株的方法。

在一种实施方式中，本发明涉及通过使用遗传修饰将性状基因渗入所述菠菜植株的方法来生成具有本发明性状的菠菜植株的方法。遗传修饰包括来自非可杂交物种或合成基因的转基因修改或基因转移，和使用天然基因、编码用于(农业)性状的来自农作物植株本身或来自性兼容供体植物的同源基因修饰或基因顺化。

本发明还涉及一种育种方法，用于开发具有本发明性状的菠菜植株，其中使用包括所述性状的种质资源。包括遗传决定因子且代表用于种质资源的所述植株的代表性种子的NCIMB保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956。

在进一步的实施方式中，本发明涉及生成具有本发明性状的菠菜植株的方法，其中包含给予所述性状的遗传决定因子的植株的子代或繁殖材料被用作源，以将所述性状基因渗入另一菠菜植株。包含所述遗传决定因子的所述植株的代表性种子保藏于NCIMB，保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956。

本发明优选地提供具有本发明性状的菠菜植株，其中通过本文描述的和/或本领域技术人员已知的任何方法可得到所述植株。

本发明进一步提供一种选择具有红色叶的菠菜植株的方法，其中红色叶源自包含红色素的在至少近轴叶面、优选地在近轴叶面和远轴叶面二者的叶脉之间的至少部分菠菜叶表皮细胞，所述方法包括筛选植株中如本文所描述的红色叶的存在。

而且，本发明涉及导致具有红色叶的菠菜植株的突变的基因，其中红色叶源自包含红色素的在至少近轴叶面、优选地在近轴叶面和远轴叶面二者的叶脉之间的至少部分菠菜叶表皮细胞，其中所述突变的基因存在于植株基因组中，所述植株的代表性样品的保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956。

本发明还涉及使用形成红色叶的遗传决定因子的应用，其中红叶源自包含红色素的在至少近轴叶面、优选地在近轴叶面和远轴叶面二者的叶脉之间的至少部分菠菜叶表皮细胞，所述遗传决定因子用于产生带有红叶的植株，更具体地产生带有红叶的菠菜植株，所述遗传决定因子存在于植株基因组中，所述植株的代表性样品的保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956。

根据其另一方面，本发明涉及具有红色叶的非天然生成的植株，其中红色叶源自包含红色素的在至少近轴叶面、优选地在近轴叶面和远轴叶面二者的叶脉之间的至少部分菠菜叶表皮细胞，该红色是植株基因组中存在遗传决定因子的结果，所述遗传决定因子存在于植株基因组中，其代表性样品的保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956。所述非天然生成的植株具体地为突变体植株。

本文中使用的术语“本发明的性状”被定义为导到本发明菠菜植株具有红色叶的性状，其中红色叶源自包含红色素的在至少近轴叶面、优选地在近轴叶面和远轴叶面二者的叶脉之间的至少部分菠菜叶表皮细胞。

保藏

菠菜(Spinacia oleracea L.)12.3002、12.3007和12.3009的种子包含生成具有红色叶的植株的本发明遗传决定因子，其中在近轴叶面和/或远轴叶面的叶脉之间的菠菜叶的至少部分表皮细胞包含红色素，所述种子于2012年4月6日保藏在NCIMB Ltd，FergusonBuilding，Craibstone Estate，Bucksburn，Aberdeen AB21 9YA，UK，保藏号为NCIMB41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956。这些保藏物的种子包含处于纯合状态的遗传决定因子。

保藏的种子不满足获得植物品种保护的DUS标准，因此不能被认为是植物品种。

附图说明

在以下实施例中，将进一步说明本发明，所述实施例仅用于说明目的、而非意于限制本发明的范围。在实施例中参考了下述附图：

图1：菠菜叶的图片和示意图。示出叶柄、叶片(也称为叶基)和叶的一级脉(也称为中脉)、二级脉和三级脉。

图2：A：携带纯合性遗传决定因子的本发明菠菜植株的图片和示意图。在本发明植株的示意图中，阴影指示具有红色的植株的区域；虚线指示具有红色的叶脉。非虚线指示非红色的叶脉。

B：携带杂合性遗传决定因子的本发明菠菜植株的图片和示意图。在示意图中，描绘出完整植株的实例和所述植株的叶的一个实例。阴影指示具有红色的植株的区域；虚线指示具有红色的叶脉。非虚线指示非红色的叶脉。

C：绿色菠菜品种(Squirrel)的图片和示意图。阴影指示具有红色植株的区域；虚线指示具有红色的叶脉。非虚线指示非红色的叶脉。

D：带红叶柄和红色粗脉(红脉菠菜)的绿叶菠菜的图片和示意图。在示意图中描绘出完整植株的实例和所述植株的叶的一个实例。阴影指示具有红色的植株的区域；虚线指示具有红色的叶脉。非虚线指示非红色的叶脉。

图3：A：本发明菠菜叶的近轴(上)侧的图片和示意图。矩形(b)指示叶脉间的叶区域的实例，用于提取如图3C-F的图片中所示的表皮条。虚线(a)指示可提取的如图3G和3H所示的不包括任何粗脉的叶横断面的实例。

B：本发明菠菜叶的远轴(下)侧的图片和示意图。矩形(b)指示叶脉间的叶区域的实例，用于提取如图3C-F的图片中所示的表皮条。

C：携带纯合性遗传决定因子的本发明植株叶脉之间区域的表皮。阴影指示具有红色和因此包含红色素的细胞。通过(2)指示这种细胞的实例。不包含红色素的表皮细胞的实例用(3)指示。在表皮上存在气孔(1)，气孔细胞(也称为保卫细胞)不具有红色。

D：携带杂合性遗传决定因子的本发明植株叶脉之间区域的表皮。阴影指示具有红色和因此包含红色素的细胞。通过(2)指示这种细胞的实例。不包含红色素的表皮细胞的实例用(3)指示。在表皮上存在气孔(1)，气孔细胞(也称为保卫细胞)不具有红色。

E：绿色菠菜植株叶脉之间区域的表皮。阴影指示具有红色和因此包含红色素的细胞。在该情况下，表皮条中没有细胞具有红色。不包含红色素的表皮细胞的实例用(3)指示。在表皮上存在气孔(1)，气孔细胞(也称为保卫细胞)不具有红色。

F：带有红叶柄和红色粗脉(红脉菠菜)的绿叶植株的叶脉之间区域的表皮。阴影指示具有红色和因此包含红色素的细胞。在该情况下，表皮条总没有细胞具有红色。不包含红色素的表皮细胞的实例用(3)指示。在表皮上存在气孔(1)，气孔细胞(也称为保卫细胞)不具有红色。

G：本发明植株叶的横断面的图片和示意图。示意图中的阴影指示具有红色和因此包含红色素的细胞。

H：本发明植株叶的横断面的图片和示意图。在该横断面中，仅可见一层表皮细胞和几层叶肉细胞。示意图中的阴影指示具有红色和因此包含红色素的细胞。

实施例

实施例1

本发明植株的培育

以如下方式得到本发明的菠菜植株：对带有叶柄红色和红色粗脉的绿叶RijkZwaan菠菜繁殖种群的种子进行EMS处理。经EMS处理后的这些种子被播种和培育以用于大规模种子生产。在Fijnaart(费纳特)的Rijk Zwaan田地上播种得到的种子和培育植株以对叶的红色进行表型选择。进一步轮次的自交和选择得到菠菜(Spinacia oleracea L.)12.3002、12.3007和12.3009的种子，其包含本发明的遗传决定因子。这些种子于2012年4月6日保藏在NCIMB Ltd，Ferguson Building，Craibstone Estate，Bucksburn，AberdeenAB21 9YA，UK，保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956。这些保藏物的种子包括处于纯合状态的遗传决定因子。

实施例2

本发明植株的表型特征

在温室或田间的正常生长条件下培育时和在头两片植株叶完全长成时，通过红色叶柄和叶的红色着色(参见图2A)容易识别携带纯合状态的遗传决定因子的本发明的植株。使用RHS比色表(英国皇家园艺学会，伦敦，英国)对红色着色进行评分。携带纯合状态遗传决定因子的本发明植株叶片的上面(近轴面)和下面(远轴面)均具有紫红色(见图3A+B)，其被评分为187A、N186C或在一些情况下为N186B，均在灰紫色(greyed-purple)组。

在还被称为中脉或中肋的一级脉上的叶柄颜色和表皮层颜色通常比叶片其余部分的颜色浅。在叶的远轴面，二级脉通常也标志在于比叶片其余部分较浅的颜色。携带纯合状态的遗传决定因子的本发明的植株的叶柄颜色被评分为187B、187C、187D或N186D，均在灰紫色组。在叶片的一级脉上，颜色被评分为187A、187B、187C、187D、N186C或N186D，而叶远轴面的二级脉的颜色被评分为187A、187B、187C或187D，均在灰紫色组。

以杂合状态携带本发明遗传决定因子的植株具有红色叶柄和绿色叶片，带有红色一级脉和二级脉，且在这些叶脉之间的叶近轴面的叶区域上有额外的微红色(见图2B)。

在以杂合状态携带本发明遗传决定因子的植株中，呈现红色叶的百分比因遗传背景不同而不同，但是在相同或相似培育环境下，总是高于未携带本发明遗传决定因子的红脉菠菜植株。

在以杂合状态携带本发明遗传决定因子的一些植株中，红色可被更多地限制在接近叶的粗脉的区域，而在其它以杂合状态携带本发明遗传决定因子的植株中，红色素可呈现在几乎整个叶片的叶表皮细胞中。

在取下以纯合状态携带遗传决定因子的本发明植株叶的横断面时，清楚的是，形成红叶的红色素主要位于叶的表皮层(见图3H)，既在叶的近轴侧也在叶的远轴侧(见图3G)。在与不包含本发明遗传决定因子的植株相比较时，在最外1至3层的细胞层下面含叶绿素(具有绿色)的叶肉不受影响(见图3H)。

在利用新鲜叶组织(即，不固定或嵌入)形成叶横断面时，红色素可从受损细胞泄漏出来，还使得自身不包含红色素的细胞显出红色。

另外，通过检验至少近轴叶面、优选地近轴叶面和远轴叶面的叶脉之间菠菜叶表皮细胞是否是红色来分析本发明的植株。

在近轴叶面和远轴叶面的叶脉之间取下例如0.15×0.2cm的表皮条。首先沿条的3个侧面取下表皮。沿剩余侧面将镊子的一个细点插入表皮和叶肉之间。然后表皮被抓取且慢慢地从叶肉剥离。然后将条传送到其中带有水滴的显微镜载玻片，且覆盖盖玻片。之后在透射光显微镜下观察表皮条细胞的颜色。

为了避免混淆，提取所述表皮条是重要的，以对良好地从红色叶脉移除的叶片区域进行分析。

在提取和检验时，必须小心处理这些表皮条以不损坏和刺破任何表皮细胞，否则红色素会从细胞泄漏且表皮中含有红色素的细胞百分比被低估。

在以纯合状态携带遗传决定因子的本发明植株中，大约90-100％表皮细胞(不包括组成气孔的保卫细胞)在表皮带上具有鲜艳的粉红色，因此包含红色素(见图3C)。在以杂合状态携带遗传决定因子的本发明植株中，表皮条中18-67％的表皮细胞具有红色/粉色(见图3D)，百分比取决于提取的表皮条与叶脉接近程度。

提取于带有绿叶的菠菜植株(见图3E)和带有红色叶柄和红色粗脉的绿叶菠菜植株二者的近轴叶面或远轴叶面的叶脉之间的表皮条细胞无一具有粉红色，其中红色被限制在(红脉菠菜)粗脉之上的叶柄和表皮(见图3F)。因此，在采用这种方法可量化的程度上，这些细胞无一显示可检测水平的β花青苷。

实施例3

本发明植株的生化分析

分析本发明植株的叶绿素和β花青苷含量，并与绿色菠菜植株和带有红色叶柄和红色粗脉的绿叶菠菜植株相比较，其中红色被限制在粗脉之上的叶柄和表皮(红脉菠菜，见图2D)。在2011-2012年的冬天的Fijnaart(费纳特)未加热的温室的土壤中培育所有植株。用生物化学方法测量叶绿素和β花青苷水平。

以653nm和667nm吸光度测量总叶绿素(叶绿素a和b)，同时以537nm吸光度测量β花青苷。对于每个菠菜品种，在叶成熟阶段收获大约200克鲜重的菠菜植株地上部分以作为代表性样品。对于每行菠菜，分别采用5-10株两个样品以作为重复。

将样品放入塑料袋并于小于-80℃立即冷却。用手粉碎冷冻的样品。然后根据需要使用存在尽可能少的液氮的自由浮动盖将所述粉碎的叶材料在Grindomix中研磨(Retsch，5″3000rpm然后5″5000rpm)，以得到粉末。然后将该粉末传送到管中，将管用液氮冷却并在小于-70℃的温度下存储，直到进一步分析。

对于叶绿素测量，将1克粉末(指定的准确质量)分别传送到两个60ml烧瓶中。立即将50ml 100％的甲醇添加到两个烧瓶中。指定使用体积(ml)。用Ultra Turrax匀浆样品溶液1分钟并在超声浴中在‘脱气设置’下超声浴5分钟。将一部分溶液置于1.5ml微量离心管中并在4℃下以13000rpm的速率离心处理4分钟。测量出360-900nm的谱和测定653nm和667nm处的吸光度(如果需要，在用提取液稀释之后)。使用下式计算总叶绿素的量：

总叶绿素＝25.5＊A₆₃₅+4＊A₆₆₇(μg/ml甲醇提取物)

带有用于稀释的补偿并转换成μg/g样品鲜重。用于计算总叶绿素水平的式取自Goodwin T.W.(1976年；植物色素的化学和生物化学，笫2卷，第18章，通过引用并入本文)。

对于β花青苷测量，将10克粉末(指定的准确质量)分别传送到两个50ml管中。将4到5倍样品体积量的磷酸钾缓冲液(250mM，pH＝5)添加到两个管中。指定使用缓冲液的质量(g)。将样品溶液在超声浴中在‘脱气设置’下超声处理5分钟。将一部分溶液置于12ml管中，用于可能的再分析。将一部分溶液传送入1.5ml微量离心管中并在4℃以13000rpm离心4分钟。测量400-800nm的谱，并测定537nm处的吸光度(如果需要，在用提取液稀释之后)。

用使用在磷酸钾缓冲液(250mM，pH＝5)中的甜菜苷的消光系数的公式计算β花青苷的量。因此用μg甜菜苷当量/g鲜重(FW)给出β花青苷含量。

甜菜苷当量(μg/g鲜重)＝

(10＊A₅₃₇＊稀释＊(缓冲液质量+液体部分样品质量))/

(1.1599＊样品质量)

其中1.1599为使用的磷酸钾缓冲液(250mM，pH＝5)中1mg/100ml甜菜苷溶液的A₅₃₇，通过样品质量(＝10g)乘以(1-(干物质/100的百分比))计算样品的液体部分的质量。

表1

测量本发明植株、绿色菠菜植株和带有红色叶柄和红色粗脉的绿叶菠菜植株的叶绿素和β花青苷，其中红色被限制在粗脉之上的叶柄和表皮。在2011-2012年冬天的荷兰Fijnaart(费纳特)未加热的温室的土壤中培育所有植株。Squirrel是一种绿色Rijk Zwaan菠菜品种。Rijk Zwaan红脉菠菜行具有的绿叶植株带有红色叶柄和红色粗脉，其中红色被限制在粗脉上的叶柄和表皮。行12.30002、12.30007和12.30009的本发明植株的群体从保藏的种子培育并仅含有以纯合状态携带遗传决定因子的植株。β花青苷和叶绿素含量的给定平均值为每5-10株的每植株行的两个生物重复的平均值。

从表1清楚的是，以纯合状态携带遗传决定因子的本发明植株的β花青苷水平(每克鲜重甜菜苷当量)显著高于带绿色叶柄的绿叶的WT菠菜植株(大约高100倍)并显著高于带红色叶柄和红色粗脉的绿叶WT菠菜植株，其中红色被限制于粗脉之上的叶柄和表皮(大约高100倍)。

有趣的是，在与WT绿色菠菜和WT红脉菠菜相比较时，以纯合状态携带遗传决定因子的本发明植株的叶绿素水平未改变(见表1)。

由于所有不同行(Squirrel、RZ红脉菠菜行和三行以纯合状态携带遗传决定因子的本发明植株)的叶绿素水平很相近而β花青苷水平差别相当大，纯合状态携带遗传决定因子的本发明植株与两行WT菠菜行的总叶绿素(μg/g鲜重)与β花青苷(μg甜菜苷当量/g鲜重)之比也明显不同(见表1)。

实施例4

本发明性状向其他菠菜植株的转移

用以纯合状态包含遗传决定因子的菠菜植株与未携带本发明性状的几种不同野生型(WT)菠菜植株相杂交，其中所述遗传决定因子形成具有红叶的植株，如以保藏号NCIMB41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956进行保藏的代表性种子(此处称为供体)中所发现。

在菠菜杂交中，发生自我授粉的情况并不少见。为了能轻易检测到自花授粉的偶发事件，将供体亲本在这些杂交中用作传粉者或父本。如果假设从WT母本收获的种子种植的F1植株具有非常相似于WT母本的表型，以及通过那些假设的F1植株自我授粉得到的F2植株也看起来像初始WT母本植株，那么可以推断，那些植株来自于WT母本的自我授粉并可将它们丢弃。

出乎意料地，从该杂交得到的F1植株具有的叶着色表型介于WT亲本的表型和以纯合状态包含造成植株具有红色叶的遗传决定因子(供体亲本)的菠菜植株之间。这表明本发明性状为半显性遗传。这些F1植株在这些叶脉之间叶区域上的近轴叶面上具有带红色一级脉和二级脉以及额外的红着色的红色叶柄和叶片(见图2B)。从具有绿色叶和叶柄的WT亲本杂交得到的F1植株以及从具有红色叶柄和红色主叶脉的绿叶WT亲本杂交得到的F1植株皆是这种情况，其中红色被限制在粗脉之上的叶柄和表皮。

可引入本发明性状的WT菠菜植株可为任何叶型、任何形式或着色的菠菜植株。

随后，这些F1代植株自我授粉，并获得F2代植株。以继承本发明性状的相应的单基因半显性(还被称为不完全显性)的方式分离不同的F2。F2中的结果大约为：带有WT亲本叶着色的一株；带有供体亲本红叶着色的一株；带有中间表型的两株，其具有红色叶柄的绿叶，带有红色一级脉和二级脉的叶片，且在这些叶脉之间的叶面区域上的近轴叶面上带有额外的微红色(见表2和图2)。

表2

分离用带有不同WT绿色菠菜亲本(绿色)的供体亲本(父本)杂交的3个F2群体中的和带有红色叶柄和红色粗脉的绿叶的不同亲本菠菜植株的供体亲本(父本)杂交的3个F2群体中的本发明性状，其中红色被限制在粗脉(红色叶脉)之上的叶柄和表皮。

卡方检验证实：观察到的具有WT亲本表型(绿色或红色的叶脉)、供体亲本表型(红色)和中间表型(微红)的F2代植株的数量与如果性状以半显性方式分离所期望的情况相符，即1∶1∶2(WT亲本表型：供体亲本表型：中间表型)。在所有这些群体中的卡方概率值大于0.05。根据表2中的分离数据，可由此得出结论，本发明的遗传决定因子表现为单基因半显性性状。

Claims

1.用于产生菠菜植株的方法，其导致具有红色叶性状的植株，其中在至少近轴叶面的叶脉之间的至少部分菠菜叶表皮细胞包含红色素，所述方法包括

a)杂交包含导致所述性状的遗传决定因子的植株与另一植株；

b)任选地在具有遗传决定因子的生成的F1中选择植株和自交具有遗传决定因子的生成的F1植株用于得到F2植株；

c)在F2中选择具有所述性状的植株；

d)任选地执行额外一轮或多轮的自交或杂交，然后选择包含/显示所述性状的植株，

其中所述遗传决定因子包含于菠菜植株中，所述菠菜植株的种子保藏于NCIMB，保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956。

2.根据权利要求1所述的方法，其中在近轴叶面和远轴叶面二者的叶脉之间的菠菜叶表皮细胞包含红色素。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述遗传决定因子是纯合性存在的。

4.用于产生菠菜植株的方法，其导致具有红色叶性状的植株，其中在至少近轴叶面的叶脉之间的至少部分菠菜叶表皮细胞包含红色素，所述方法包括

b)任选地回交生成的F1植株与优选的亲本；

c)在F2中选择具有所述性状的植株；

d)任选地执行额外一轮或多轮的自交或杂交，然后选择包含所述性状的植株，

5.根据权利要求4所述的方法，其中在近轴叶面和远轴叶面二者的叶脉之间的菠菜叶表皮细胞包含红色素。

6.根据权利要求1或4所述的方法，其中在收获期菠菜植株的叶的β花青苷含量以优先级增加的顺序至少为55μg甜菜苷当量/g鲜重、60μg甜菜苷当量/g鲜重、70μg甜菜苷当量/g鲜重、80μg甜菜苷当量/g鲜重、90μg甜菜苷当量/g鲜重、100μg甜菜苷当量/g鲜重、110μg甜菜苷当量/g鲜重、120μg甜菜苷当量/g鲜重、130μg甜菜苷当量/g鲜重、140μg甜菜苷当量/g鲜重、150μg甜菜苷当量/g鲜重、160μg甜菜苷当量/g鲜重、170μg甜菜苷当量/g鲜重、180μg甜菜苷当量/g鲜重、190μg甜菜苷当量/g鲜重、200μg甜菜苷当量/g鲜重、210μg甜菜苷当量/g鲜重、220μg甜菜苷当量/g鲜重、230μg甜菜苷当量/g鲜重、240μg甜菜苷当量/g鲜重、250μg甜菜苷当量/g鲜重、300μg甜菜苷当量/g鲜重、350μg甜菜苷当量/g鲜重、400μg甜菜苷当量/g鲜重、450μg甜菜苷当量/g鲜重、500μg甜菜苷当量/g鲜重、550μg甜菜苷当量/g鲜重、600μg甜菜苷当量/g鲜重。

7.一种将另一期望性状引入具有如权利要求1中所定义的红色叶性状的菠菜(Spinacia oleracea)植株中的方法，所述方法包括：

a)杂交具有如权利要求1中所定义的红色叶性状的菠菜植株与包括期望性状的第二菠菜植株以产生F1子代，所述具有如权利要求1中所定义的红色叶性状的菠菜植株的种子保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956；

b)选择包含如权利要求1中所定义的红色叶性状和所述期望性状的F1子代；

c)杂交所述选择的F1子代与任一亲代，以产生回交子代；

d)选择包含所述期望性状和如权利要求1中所定义的红色叶性状的回交子代；和

e)任选地重复步骤c)和d)一次或连续多次，以产生经选择的第四代或更高代的回交子代，其包含所述期望性状和如权利要求1中所定义的红色叶性状。

8.用于产生具有如权利要求1中所定义的红色叶性状的杂交菠菜植株的方法，所述方法包括杂交第一亲代菠菜植株与第二亲代菠菜植株，以及收获得到的杂交种子，并将所述杂交种子培植成具有所述性状的杂交植株，其中所述第一亲代菠菜植株和/或所述第二亲代菠菜植株具有导致所述性状的遗传决定因子，其中所述遗传决定因子包含于菠菜植株中，所述菠菜植株的种子保藏于NCIMB，保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB41956。

9.通过使用种子用于产生具有如权利要求1中所定义的红色叶性状的菠菜植株的方法，其中所述种子在其基因组中包括导致所述性状的遗传决定因子，并且所述种子用于培植所述菠菜植株，其中所述遗传决定因子包含于菠菜植株中，所述菠菜植株的种子保藏于NCIMB，保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其中种子保藏于NCIMB，保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955或NCIMB 41956。

11.通过对包含在其种子保藏于NCIMB且保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB41956的菠菜植株中包含的遗传决定因子的菠菜植株使用双单倍体产生技术生成包含如权利要求1中所定义的红色叶性状的双单倍体系用于产生具有所述性状的菠菜植株的方法。

12.通过使用源自包含在其种子保藏于NCIMB且保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956的菠菜植株中包含的遗传决定因子的菠菜植株的组织培养物用于产生具有如权利要求1中所定义的红色叶性状的菠菜植株的方法。

13.通过使用包含在其种子保藏于NCIMB且保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956的菠菜植株中包含的遗传决定因子的菠菜植株的至少一部分的无性繁殖用于产生具有如权利要求1中所定义的红色叶性状的菠菜植株的方法。

14.用于种子生产的方法，所述方法包括从其样品保藏于NCIMB的保藏号为NCIMB41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956的种子培植菠菜植株，使植株产生种子，并收获那些种子。

15.一种育种方法，其用于开发具有如权利要求1中所定义的红色叶性状的菠菜植株，其中使用包含导致所述性状的在其种子保藏于NCIMB且保藏号为NCIMB 41954、NCIMB41955和NCIMB 41956的菠菜植株中包含的遗传决定因子的种质。

16.用于产生具有如权利要求1中所定义的红色叶性状的菠菜植株的方法，其中包含给予所述性状的遗传决定因子的植株的子代或繁殖材料被用作源，以将所述性状基因渗入另一菠菜植株，其中所述遗传决定因子包含于菠菜植株中，所述菠菜植株的种子保藏于NCIMB，保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956。

17.根据权利要求16所述的方法，其中子代或繁殖材料是来源于以下种子培植成的植株，所述种子保藏于NCIMB，保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955或NCIMB 41956。

18.可根据权利要求1-13和15-17任一项获得的植株的菠菜叶，其带有红色，其中在至少近轴叶面的叶脉之间的至少部分菠菜叶表皮细胞包含红色素。

19.根据权利要求18所述的菠菜叶，其中在近轴叶面和远轴叶面二者的叶脉之间的菠菜叶表皮细胞包含红色素。

20.食品，其包含权利要求18或19的菠菜叶、或其部分，其任选地处于经加工的形式。

21.容器，其包括在生长基质中的可根据权利要求1-13和15-17任一项获得的一种或多种菠菜植株，所述容器用于在居室环境中收获来自所述菠菜植株的叶。

22.可根据权利要求1-5和7任一项所述的植株或由权利要求9或10所定义的种子或权利要求16或17所定义的繁殖材料产生的植株作为在育种程序中的种质用于开发具有红色叶的菠菜植株的用途，其中红色叶源自包含红色素的在至少近轴叶面的叶脉之间的至少部分菠菜叶表皮细胞。

23.根据权利要求22所述的用途，其中在近轴叶面和远轴叶面二者的叶脉之间的菠菜叶表皮细胞包含红色素。

24.NCIMB保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955或NCIMB 41956的种子用于向另一菠菜植株传送给予如权利要求1中所定义的红色叶性状的在其种子保藏于NCIMB且保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956的菠菜植株中包含的遗传决定因子的用途。

25.菠菜植株作为农作物的用途，所述菠菜植株携带在其种子保藏于NCIMB且保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956的菠菜植株中包含的遗传决定因子，所述遗传决定因子给予如呈现在且可得到于用种子培植得到的菠菜植株中的红色叶性状，其中种子的NCIMB保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955或NCIMB 41956。

26.菠菜植株作为种子源的用途，所述菠菜植株携带在其种子保藏于NCIMB且保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956的菠菜植株中包含的遗传决定因子，所述遗传决定因子给予如呈现在菠菜植株中的如权利要求1所定义的红色叶性状。

27.根据权利要求26所述的用途，其中所述菠菜植株是用种子培植得到的菠菜植株，其中种子的NCIMB保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955或NCIMB 41956。

28.菠菜植株作为繁殖材料源的用途，所述菠菜植株携带在其种子保藏于NCIMB且保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956的菠菜植株中包含的遗传决定因子，所述遗传决定因子给予如呈现在菠菜植株中的如权利要求1所定义的红色叶性状。

29.根据权利要求28所述的用途，其中所述菠菜植株是用种子培植得到的菠菜植株，其中种子的NCIMB保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955或NCIMB 41956。

30.菠菜植株用于消费的用途，所述菠菜植株携带在其种子保藏于NCIMB且保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956的菠菜植株中包含的遗传决定因子，所述遗传决定因子给予如呈现在菠菜植株中的如权利要求1所定义的红色叶性状。

31.根据权利要求30所述的用途，其中所述菠菜植株是用种子培植得到的菠菜植株，其中种子的NCIMB保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955或NCIMB 41956。

32.携带作为呈现在种子中的在其种子保藏于NCIMB且保藏号为NCIMB 41954、NCIMB41955和NCIMB 41956的菠菜植株中包含的遗传决定因子的菠菜植株用于给予菠菜植株导致如权利要求1所定义的红色叶性状的遗传决定因子的用途，所述遗传决定因子给予如权利要求1所定义的红色叶性状，其中种子的NCIMB保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955或NCIMB 41956。

33.菠菜植株作为呈现在种子中的遗传决定因子的受体的用途，其中种子的NCIMB保藏号为NCIMB 41954、NCIMB 41955和NCIMB 41956。