CN105203467A - 一种通用无损的真菌的生长拟合方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种基于高光谱建立稻谷贮藏中主要腐败通用无损的真菌生长拟合曲线的方法，属于农产品质量安全快速检测和监测的无损技术。通过高光谱检测系统，分别获取真菌不同生长时间点的高光谱图像，提取400-1000nm全波段的光谱平均值，波峰709nm处的光谱值和全波段光谱值的主成分得分三种光谱特征，分别构建了五种稻谷贮藏中常见真菌的Fourier函数通用拟合模型，相关系数在0.9432-0.9996，有较好拟合效果。本发明为稻谷储藏真菌病害的准确检测和监测提供帮助。

Description

一种通用无损的真菌的生长拟合方法

技术领域

本发明是一种高光谱图像技术对稻谷贮藏中常见真菌污染的通用无损生长拟合的方法，如黑曲霉(Asp.Niger)、米曲霉(Asp.Oryzae)、杂色曲霉(Asp.Versicolor)、构巢曲霉(Asp.Nidulans)和桔青霉(P.Citrinum)，属于食品质量安全快速检测和监测的无损技术。

背景技术

稻谷是我国主要储备粮种。稻谷产量约占全国粮食总产量的38.3％。稻谷贮藏中的真菌危害是一种常见现象，稻谷在贮藏中的真菌共有十几种，主要属于曲霉类和青霉类。

国外有专家采用修正的Gompertz模型，在玉米提取液培养基上模拟了影响霉菌菌种生长因素的研究。Sautour等利用PDA培养基对几种霉菌的生长与水分活度之间的关系进行了模拟研究。Baert等建立了温度对苹果中青霉菌生长速率及迟滞期影响的模拟模型。青霉菌的模拟研究报道尚少，而且建立在高光谱基础上的稻谷贮藏真菌的生长模拟也没有报道，对多种真菌生长拟合的通用模型也没有见报道。

稻谷贮藏中污染微生物的鉴别是一项费时费力的工作，通过对微生物及其生化产物的理化及生化测定来鉴别微生物种类的传统方法较为繁琐，高光谱图像技术是20世纪80年代发展起来的新技术，把传统的成像技术与光谱技术有效结合，其光谱技术可以检测产品的物理结构和化学成分；图像技术可以反映外部特征，是用于农产品无损检测中快速、准确的技术之一，具有较大应用前景。

高光谱图像技术在遥感测量上有着成熟的应用背景，已在多领域取得了成功。近年来国内外的研究表明高光谱技术已被广泛应用于水果的无损检测中，Alan等运用该技术对苹果表面动物排泄物污染进行了检测，Juan等利用该技术对不同种苹果表面的损伤进行了检测，Qin等对腻斑病、溃烂果、虫害果、黑变病果及带疤痕果等210个柑橘样品进行了识别及分类。但高光谱图像在稻谷贮藏病害研究很少。

发明内容

技术问题

本发明旨在利用高光谱检测技术开发一种快速无损的稻谷贮藏中污染微生物的通用生长预测方法，以满足食品质量与安全控制的迫切需求。通过利用高光谱成像技术，获取微生物生长过程中的高光谱图像信息，提取响应的特征参数，构建基于光谱图像信息的微生物生长模型，为稻谷储藏真菌病害的准确检测和监测提供帮助。

技术方案

一种基于高光谱图像对腐败真菌通用无损的生长预测的方法(研究技术路线见图1)，其特征在于包括：(一)高光谱图像系统的搭建、(二)高光谱图像的测定、(三)真菌生长模型的构建，其中：

(一)高光谱成像系统的搭建

1)系统组成包括高光谱成像单元、移动平台、光源、计算机和图像采集软件组成，整个装置放置在密闭黑箱中。其中，高光谱成像单元由相机(Imperx，ICL-B1620，波段范围为400～1000nm，光谱分辨率为2.8nm)、光谱仪(Specim，ImSpector，V10E)和焦距可变镜头组成，可调光源为150W的卤素钨灯，由1个线性光纤导管完成传输，电脑型号为CPUE5800，3.2GHz，内存2G，显卡256MGeForceGT240；图像采集软件为自主开发的SpectralImage软件；

2)信号采集为反射模式，透镜离样本距离为30cm，光源离样本的距离为20.5cm，光源照射的强度为67.5W，照射角度为45°，采集曝光时间4ms，采集速度2.5mm/s，图像分辨率804×440像素。

(二)其检测步骤在于，

1)培养基平板，其特征在于，培养基构成为马铃薯浸粉5g、葡萄糖20g、NaCl5g、琼脂15g、氯霉素0.1g，水1000mL、pH5.8-6.2；每个培养皿含有的培养基体积为20±2mL，培养基厚度为2.5±0.5mm；

2)对稻谷中常见真菌如黑曲霉(Asp.Niger)、米曲霉(Asp.Oryzae)、杂色曲霉(Asp.Versicolor)、构巢曲霉(Asp.Nidulans)和桔青霉(P.Citrinum)进行接种培养；

3)将处于温度为28℃、相对湿度为85％条件下培养一段时间的培养基平板取出，放置于高光谱图像检测系统中，获取高光谱图像；

4)利用下述公式对获得的图像进行校正，获得校正后的高光谱图像：

$Rc=\frac{R_0-D}{W-D}---\left(1\right)$

其中，式(1)中，Rc为校正后的高光谱透射图像，R₀为原始高光谱透射图像，W为将反射率为99.99％的标准白色校正板，放置在光源正上方，扫描透射白板得到全白的标定图像，D为将镜头盖上镜头盖，采集全黑的标定图像；

5)提取校正后的高光谱图像特征，构建五种真菌的生长模型。

(三)构建的五种真菌生长模型，其特征在于：

1)菌种的初始接种浓度为10⁴CFU/mL，通过高光谱成像系统获得0h、8h、16h、24h、36h、48h、60h、84h和108h的高光谱图像，分别提取菌落生长部分1000个像素点的感兴趣区域，得到感兴趣区域在全波段400-1000nm内的光谱值，并求平均值，根据培养时间与光谱平均值的关系构建Fourier函数模型。

2)菌种的初始接种浓度为10⁴CFU/mL，通过高光谱成像系统获得0h、8h、16h、24h、36h、48h、60h、84h和108h的高光谱图像，分别提取菌落生长部分1000个像素点的感兴趣区域，得到感兴趣区域在波峰709nm处的光谱值，根据培养时间与光谱值的关系构建Fourier函数模型。

3)菌种的初始接种浓度为10⁴CFU/mL，通过高光谱成像系统获得0h、8h、16h、24h、36h、48h、60h、84h和108h的高光谱图像，分别提取菌落生长部分1000个像素点的感兴趣区域，得到感兴趣区域在400-1000nm波段内的光谱值，对光谱值进行主成分分析后，根据培养时间与第一主成分得分构建Fourier函数模型。

四、有益效果

本发明利用高光谱图像信息对微生物的响应，能够不破坏微生物或者检测样本的情况下，通过微生物在不同生长阶段的高光谱图像响应特性，在微生物生长期间的情况进行无损快速预测，能够为生产、加工、贮运、消费等各个环节提供微生物的生长信息，为食品质量和安全的及时检测、监测和控制提供技术支持。相对于传统的破坏性方法预测微生物的生长，该发明不仅节省时间，减少劳力，而且避免了化学试剂的使用。该技术和方法新颖，研究成果不仅可以用于实验室的快速分析和检测，而且可以通过开发在线检测设备和便携式仪器，用于工业自动化生产中的水果微生物生长情况预测和监测，也为其他类食品腐败微生物和致病微生物的生长预测提供有益的借鉴。

附图说明

图1：研究技术路线

图2：高光谱图像检测系统

图3：平均光谱值随时间变化曲线(以杂色曲霉为例)

图4：光谱值主成分分析第一主成分得分的Fourier模型拟合曲线

具体实施方式

1.材料与方法

黑曲霉(Asp.Niger)、米曲霉(Asp.Oryzae)、杂色曲霉(Asp.Versicolor)、构巢曲霉(Asp.Nidulans)和桔青霉(P.Citrinum)，由广东菌种保藏中心购入。

培养基为马铃薯琼脂培养基，构成为马铃薯浸粉5g、葡萄糖20g、NaCl5g、琼脂15g、氯霉素0.1g，水1000mL、pH5.8-6.2；每个培养皿含有的培养基体积为20±2mL，培养基厚度为2.5±0.5mm。

将保藏的5种菌种分别接种到PDA培养基上，28℃，75％湿度条件下活化7天，重新接种进行二次培养。一周后，对二次培养的菌种用无菌生理盐水反复冲洗，制成菌悬浮液，将一滴菌液滴到血球计数板上，在显微镜下计数。根据计数，进行换算得出菌液浓度，并稀释至浓度为4×10⁴的菌悬液，然后进行样本制备。

准备550个培养基，其中空白对照90个，记作CK。黑曲霉、米曲霉、杂色曲霉、桔青霉四种真菌的平板样本各90个，构巢曲霉平板样本100个。550个样本同时培养，每种菌及空白在0h、8h、16h、24h、36h、48h、60h、84h和108h各拿出10个进行高光谱检测(构巢曲霉生长较慢，培养时间增加至132h，即高光谱检测增加132h测定时间点)

2.高光谱数据采集

试验采用高光谱图像检测系统的反射模式进行对五种真菌进行检测。该系统主要包括高光谱成像单元、功率可调卤钨灯(0-150W)，移动平台，图像采集软件和计算机。高光谱图像单元包括一个CCD摄像机，一个成像光谱仪(分辨率2.8nm)，有效波长范围为400-1000nm。实验参数为：相机镜头和线光源距离样本分别为30cm和20.5cm，光照强度为67.5W、以45°对准样本，曝光时间为2.5ms、输送速度为2.4mm/sec。

实验共获得550个样本的高光谱图像数据。由于在相机的暗电流的存在和外界因素的影响，图像含有一定噪声，需要对高光谱图像进行白色和黑色的校正来采集实际的图像。用覆盖相机镜头的不透明盖完全可以得到黑色的反射图像，聚四氟乙烯白板(反射率99％)得到白色反射图像。最后根据式(1)计算出校正后的相对图像Rc。校正后的图像被用来提取光谱信息，选择有效的波段，建立最佳的校正模型和区分细菌的不同生长阶段。

$Rc=\frac{R_0-D}{W-D}---\left(1\right)$

其中，(1)式中，R₀为原始高光谱透射图像；D为全黑的标定图像；W为全白的标定图像；Rc为标定后高光谱透射图像。

3.数据处理

利用ENVI4.8软件，选择培养基中菌落生长的地方大小约1000个像素点的区域做感兴趣区域(ROI)，计算高光谱图像ROI区域平均光谱值。实验中采用3种方法提取高光谱图像特征信息，方法I为全波段400-1000nm光谱响应的平均值；方法II为波峰处的光谱值；方法III为400-1000nm波段内光谱值进行PCA主成分分析后的第一主成分的得分值。将每种菌各个检测时间点的10个样本取平均值进行建模拟合。通过MATLAB7.1统计工具箱中CurveFittingTool建立五种真菌光谱值随时间变化的生长曲线，根据拟合模型决定系数(R²)比较模型效果。

4.光谱信息分析

4.1不同生长阶段腐败真菌的光谱曲线

在400-1000nm的光谱范围内，五种菌的光谱值随时间的延长都是先呈上升趋势，达到最大光谱响应值后呈现下降趋势，最大反射光谱值出现在波长为709nm处的波峰。

4.2基于光谱值拟合真菌的生长模型

拟合用Fourier模型方程为：

f(x)＝a+b×cos(wx)+c×sin(wx)+d×cos(2wx)+e×sin(2wx)

(7)

基于数据处理中所述的三种方法建立的杂色曲霉的拟合模型的R²分别为0.9972、0.9967、0.9947，黑曲霉的R²分别为0.9641、0.9432、0.9749，桔青霉的R²分别为0.9621、0.9573、0.9721，米曲霉的R²分别为0.9642、0.9662、0.9863，桔青霉的R²分别为0.9903、0.9903、0.9996。所有拟合模型的R²范围在0.9432-0.9996，其中黑曲霉、米曲霉、杂色曲霉、桔青霉四种真菌利用方法III建立的拟合模型R²明显高于另两种方法。构巢曲霉采用方法III拟合的模型R²略低于方法I和II，但差值小于0.01。PCA主成分分析后的第一主成分得分除去了大量数据中的冗余信息，较好的代表了五种真菌的高光谱特征。

表1.三种高光谱参数的Fourier生长拟合模型R²比较

Table1.ComparisonofR²oftheFouriermodelfittingofHyper-spectralparameters

注：方法I，全波段400-1000nm光谱响应的平均值；方法II，波峰处的光谱值；方法III，400-1000nm波段内光谱值进行PCA主成分分析后的第一主成分的得分值)

构巢曲霉、黑曲霉、桔青霉、米曲霉、杂色曲霉主成分分析第一主成分得分Fourier函数拟合结果如下，

构巢曲霉模型为：

f(x)＝7.048×10¹⁰-1.057×10¹¹×cos(-0.00066×x)+4.108×10⁹×sin(-0.00066×x)+4.219×10¹⁰×cos(0.00132×x)-3.285×10⁹×sin(0.00132×x)

(2)

黑曲霉的模型为：

f(x)＝4.712×10¹¹-7.487×10¹¹×cos(-0.0022×x)+9.284×10¹⁰×sin(-0.0022×x)+3.666×10¹¹×cos(-0.0044×x)-9.233×10¹⁰×sin(-0.0044×x)

(3)

桔青霉的模型为：

f(x)＝2.129-4.288×cos(0.03077×x)-0.902×sin(0.03077×x)-1.358×cos(0.6154×x)-1.922×sin(0.6154×x)

(4)

米曲霉的模型为：

f(x)＝4.231×10¹⁰-7.01×10⁹×cos(-0.034×x)+8.209×10⁸×sin(-0.034×x)+3.174×cos(-0.068×x)-6.36×10⁸×sin(-0.068×x)

(5)

杂色曲霉的模型为：

f(x)＝4.263-2.53×cos(0.0631×x)-0.728×sin(0.0631×x)-4.28×cos(0.1262×x)-1.77×sin(0.1262×x)

(6)。

Claims (3)

1.一种通用无损的真菌生长拟合方法，其特征在于提取平板培养基上生长的真菌400-1000nm全波段光谱值的第一主成分得分，构建基于Fourier函数的通用生长拟合模型，分别为：

构巢曲霉生长模型为：

f(x)＝7.048×10¹⁰-1.057x10¹¹×cos(-0.00066×x)+4.108×10⁹×sin(-0.00066×x)+4.219×10¹⁰×cos(0.00132×x)-3.285×10⁹×sin(0.00132×x)

(2)

黑曲霉的生长模型为：

桔青霉生长模型为：

f(x)＝2.129-4.288×cos(0.03077×x)-0.902×sin(0.03077×x)-1.358×cos(0.6154×x)-1.922×sin(0.6154×x)

(4)

米曲霉：

f(x)＝4.231×10¹⁰-7.01×10⁹×cos(-0.034×x)+8.209×10⁸×sin(-0.034×x)+3.174×cos(-0.068×x)-6.36×10⁸×sin(-0.068×x)

(5)

杂色曲霉：

f(x)＝4.263-2.53×cos(0.0631×x)-0.728×sin(0.0631×x)-4.28×cos(0.1262×x)-1.77×sin(0.1262×x)

(6)

其中，x为生长时间，单位为小时。

2.如权利要求1所示的光谱值，是通过专门的高光谱图像系统获得，其特征在于，

1)系统组成包括含有相机、光谱仪和镜头的高光谱成像单元、移动平台、光源、计算机和图像采集软件组成，整个装置放置在密闭黑箱中，其中，相机为Imperx，ICL-B1620，波段范围为400～1000nm，光谱分辨率为2.8nm；光谱仪为ImSpectorV10E；镜头为焦距可变型；可调光源为150W的卤素钨灯，由1个线性光纤导管完成传输；电脑型号为CPUE5800，3.2GHz，内存2G，显卡256MGeForceGT240；图像采集软件为自主开发的SpectralImage软件；信号采集为反射模式，透镜离样本距离为30cm，光源离样本的距离为20.5cm，光源照射的强度为30W，照射角度为45°，采集曝光时间2.5ms，采集速度2.4mm/s，图像分辨率804x440像素；

2)检测步骤在于，首先对稻谷贮藏中常见的五种真菌，分别为黑曲霉(Asp.Niger)、米曲霉(Asp.Oryzae)、杂色曲霉(Asp.Versicolor)、构巢曲霉(Asp.Nidulans)和桔青霉(P.Citrinum)，二次活化后制成特定浓度菌悬液，平板涂布接种培养；其次将处于温度为28℃、相对湿度为85％条件下培养特定时间的培养基平板取出，放置于所述的高光谱图像检测系统中，获取高光谱图像；然后利用下述公式对获得的图像进行校正，获得校正后的高光谱图像：

$Rc=\frac{R_0-D}{W-D}---\left(1\right)$

其中，式(1)中，Rc为校正后的高光谱透射图像，R₀为原始高光谱透射图像，W为将反射率为99.99％的标准白色校正板，放置在光源正上方，扫描透射白板得到全白的标定图像，D为将镜头盖上镜头盖，采集全黑的标定图像；最后提取校正后的高光谱图像特征，构建五种真菌的Fourier模型。

3.如权利要求1所述的培养基为为马铃薯琼脂培养基(PDA培养基)，其特征在于，培养基构成为马铃薯浸粉5g、葡萄糖20g、NaC15g、琼脂15g、氯霉素0.1g，水1000mL、pH5.8-6.2；每个培养皿含有的培养基体积为20±2mL，培养基厚度为2.5±0.5mm。