CN105193779A - 共轭亚油酸促进骨折愈合的新用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种共轭亚油酸促进骨折愈合的新用途，整体动物和分子细胞水平的相关实验研究表明，共轭亚油酸能够通过提高大鼠骨折愈合骨痂的质量，进一步提高骨折愈合强度，达到促进骨折愈合。根据实验结果证明：①共轭亚油酸可以促进骨折愈合。②增强机体内成骨活动，提高ALP的活性。提示其具有开发性的促骨折愈合药物的前景。
Description
技术领域
本发明涉及共轭亚油酸促进骨折愈合的新用途，属于医药新用途技术领域。
背景技术
随着全球经济的不断发展、人类交际及流动范围的迅速扩大、延伸与频繁，拌之交通手段的快速发展，则创伤造成的骨折发生率逐年增高，因此有关骨折的修复一直是骨科学界研究的热点问题。骨折愈合受全身和外界因素等多因素的影响，目前相关研究多关注骨折内固定材料和手术方式，以及药物应用等方面对骨折愈合的影响，很少注意到营养物质代谢同样也是一个重要影响因素。
最近研究报道共轭亚油酸可以直接促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，促经骨形成。成骨细胞和破骨细胞的动态平衡在骨折愈合过程中具有重要的作用，那么共轭亚油酸是否对骨折愈合有促进的作用。
共轭亚油酸((conjugatedlinoleicacid.简写CLA))是一组含有共轭双键的亚油酸的同分异构体混合物，以双键在9和11(c9，t11-CLA)或10和12(t10，c12-CLA)位置上的同分异构体含量最多，属于多不饱和脂肪酸。已发现CLA的天然形式主要存在于反刍动物的肉类和奶制品。近年来的广泛研究证明，共轭亚油酸有多种生物学活性，例如减少动脉粥样硬化的严重程度，改善免疫不良刺激的影响，改善瘦素抵抗来发挥其降脂，CLA可以抑制肿瘤细胞繁殖、抑制肿瘤细胞向细胞外基质成分和纤维粘连蛋白粘附的作用。且具既无毒又无任何副作用的生物安全性。目前国内、外没有关于CLA对骨折愈合方面的相关研究，故设计本实验研究CLA对骨折愈合的影响，以期提高我们对营养物质代谢在骨折愈合中重要作用的认识，为我们今后对骨折愈合的治疗提供又一有效的方法和途径。
发明内容
本发明提供了共轭亚油酸的系列生物学实验，为开拓共轭亚油酸促进骨折愈合的新用途提供了依据。具体生物学实验研究结论包括以下方面：
通过建立骨折模型，从血样、影像学检查、力学测试、组织学检查等方面研究共轭亚油酸对模型动物的影响。血清碱性磷酸酶(ALP)活性在骨折后2周时两组对比有显著性差异(P<0.01)，X线摄片评价显示共轭亚油酸干预组4周骨折线模糊，骨折端骨痂体积大、骨痂数量多，三名骨折医生对骨折后6周进行评分较空白对照组具有明显统计学差异。根据实验结果推测：①共轭亚油酸可以促进骨折愈合。②增强机体内成骨活动，提高ALP的活性。提示其具有开发性的骨折药物的前景。
附图说明
图1：CLA组与空白两组在不同时间点对大鼠血清ALP浓度的测定对比结果，在2周时CLA干预组ALP浓度均明显高于生理盐水对照组(p＝0.0126)；
图2为CLA组与空白干预两组大鼠胫骨骨折断端在不同时间点最具有代表性的X光片对比；
图3为影像学对骨折愈合组织的分级评分结果示；
图4为CLA组与空白组大鼠胫骨骨折断端在不同时间点最具代表性的Micro-CT扫描图像对比(骨折愈合第4、6周)；
图5为CLA组与空白组在不同时间点的大鼠胫骨骨折断端ROI的BMD测定比较；
图6为CLA组与空白组在不同时间点的大鼠胫骨骨折断端横截面积(CSA)测定比较；
图7为CLA组与空白组在不同时间点的骨强度指数(BSI)的计算结果比较；
图8为CLA组与空白组在骨折愈合第6周最大弯曲应力测试比较；
图9CLA组与空白组为在骨折愈合第6周大鼠骨折骨痂HE染色比较。
具体实施方式
以下所列实施例，仅为帮助本领域技术人员更全面理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
<实施例1>共轭亚油酸对小鼠骨折模型的影响
1动物及主要材料
1.1实验动物
雌性Sprague-Dawley大鼠30只，清洁级，体质量(200±15)g
1.2试剂和仪器
共轭亚油酸(顺-9，反-11CLA，37.6％；反-10，顺-12CLA，39.3％；C18:1，10.1l％；c18:O，2.04％，青岛澳海生物有限公司)
2实验方法
2.1动物分组
将30只雌性SD大鼠骨折造模后随机分成2组，每组15只，A空白对照组(Control)：给予生理盐水灌胃，B给予共轭亚油酸(CLA)灌胃干预(10g/Kg·diet)，曾有报道应用该剂量研究共轭亚油酸对去势大鼠钙代谢和骨代谢的影响，实验过程中对动物的处置方法符合2006年科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。
2.2骨折大鼠骨折模型的建立与给药方法
用10％水合氯醛以3mL/kg进行腹腔注射麻醉，将大鼠仰卧，四肢固定于手术台上，各组大鼠行左侧胫骨中段纵形皮肤切口，长约2cm，沿胫前肌肌间隙钝性分离达胫骨干，固定胫骨，在胫骨干中段用线锯锯断成横行骨折，此过程注意保护神经和肌肉组织，再以直径为0.8mm的克氏针逆行穿入骨折近端且从胫骨结节穿出，复位骨折后再将其顺行穿入骨折远段髓腔，生理盐水冲洗，逐层关闭伤口。不包扎，不固定。术后在大鼠尾部标记，待麻醉醒后放入笼中喂养，自由取食、饮水。
按照SD大鼠生活习性，活动多集中在黄昏到清晨这段时间，白天常在闭目休息，所以选择每日的灌胃时间在晚上6-8点之间。并自动物骨折模型造模成功后第一天开始进行灌胃干预。每天18：00灌胃一次，灌胃剂量为：A组给予生理盐水灌胃，B组给予共轭亚油酸灌胃干预(10g/Kg·diet)，其他食物统一给标准鼠粮。各组大鼠均自由进食饮水，12h光照周期。
3标本的采集与检测
3.1血样采集与检测
血清碱性磷酸酶(ALP)测定：骨折造模后第2周、第4周和第6周，处死5只实验大鼠取1.5ml血，离心后取上清液测定。
3.2影像学检查
3.2.1X-Ray摄片
X射线检查大鼠胫骨骨痂的连续性及骨折愈合情况：在胫骨骨折造模后第2周、第4周和第6周将各组大鼠用10％水合氯醛以3mL/kg进行腹腔注射麻醉后计算机X射线摄相仪(DR)摄片，拍摄条件为50kV，2.5ms，观察大鼠胫骨骨痂的连续性及骨折愈合情况。
评价方法采用骨痂形成的影像学评分:每张片均由3名高年资的骨科医生分别评分，对骨折断端愈合组织具体评分标准：0-无骨痂形成；1-少量或者中等量骨痂形成；2-有丰富的骨痂形成；3-有连接骨膜骨痂形成，似“桥型连接”；4-成熟的连接骨痂；5-连接骨痂吸收完成，骨折完全连接。如表1所示：
3.2.2Micro-CT扫描
对大鼠胫骨骨折愈合第4周和第6周，进行MicroCT扫描，设定电压65KV，电流385mA，层间距17.51μm，以胫骨骨折线为中心，沿胫骨纵轴上下围绕骨痂周围各取200个扫描层面，共400个层面，建立三维兴趣区(ROI)以250ms的积分时间带有0.7°旋转对兴趣区进行扫描。对骨痂形态学参数分别测量和计算分析，测量以骨折断端为中心ROI的平均横截面积(CSA，cm2)和ROI骨密度(BMD)。观察及计算两组以骨折端为中心ROI骨段的力学强度指数(BSI)。骨强度指数可以客观的反应出骨折愈合情况，并能够提供具体的量值，具有很强的准确性和特异性。
骨强度指数(BSI)＝横截面积×骨密度，即(BSI＝CSA×BMD)
3.3力学测试
在大鼠骨折愈合第6周通过“三点力学”测试评估骨折愈合强度，通过骨折愈合强度能够有效的评估和说明骨折愈合程度。将大鼠无痛处死后注意保护骨折断端愈合的骨痂组织，将其周围的软组织完全剥离。将胫骨放置在生物力学测试仪上，以17mm为跨度，以5mm/min的速度下降加载负荷载力，直至胫骨断裂[13]，根据载荷-变形曲线得出骨折端最弯曲载荷力作为计量生物力学指标。
3.4组织学检查
3.4.1组织学标本的制备：
无痛处死大鼠，将大鼠左后侧胫骨分离，并注意保护骨折断端愈合的骨痂组织，将其周围的软组织完全剥离。标本于10％的福尔马林中浸泡固定120h，自来水冲洗24h，按组织学检查的要求以及术前造模，以相应骨折部位为标志，在向胫骨远端和近端延长0.5CM处(以确保能完整获取骨折愈合区域)用于脱钙组织学HE染色。
4.统计学分析：
采用SPSS17.0对数据进行分析，采用均数±标准差表示，若数据服从正态性及方差齐性采用两个独立样本的t检验，否则采用Wilcoxon秩和检验，检验水准α＝0.05，P<0.05为差异有统计学意义。
5实验结果
5.1血生化指标检测结果：碱性磷酸酶(ALP)测定
骨折2、4、6周后CLA干预组和空白对照组ALP浓度均有不同程度的升高，CLA干预组在2周时ALP浓度均明显高于生理盐水对照组(p＝0.0126)；骨折后4周、6周CLA干预组血清ALP浓度均高于生理盐水A组，无统计学意义，如图1所示。
图1：空白与CLA两组在不同时间点的大鼠血清ALP浓度测定对比结果，在第2周、4周、6周ALP的结果均比Control组高，其中在2周时CLA组ALP浓度均明显高于Control组(p＝0.0126)*P＜0.05。
5.2影像学检查结果：X线检查结果
X-Ray摄片：通过对CLA组和Control组X-Ray摄片的观察和分析，在骨折愈合第2周，未发现两组有明显区别，骨折断端变化不明显，骨折线清晰可见，未见骨痂组织形成。在骨折愈合第4周，发现两组均有骨痂形成，骨折线模糊，CLA组均有大量骨痂形成，而Control组部分有骨痂形成，部分骨折线模糊，但未见明显骨痂。在骨折愈合第6周，是发现CLA组骨折断端愈合，骨折线消失，多数外骨痂近于消失接近健康骨骼结构和外形，Control组均产生大量骨痂，骨折线消失，但无一例接近骨折完全愈合标准，见图2，CLA组与Control组大鼠胫骨骨折断端在不同时间点最具代表性的X-Ray摄片对比；
从图2结果可以看出：可以看出骨折愈合第2周两组变化不明显，第4周骨折断端均可见骨痂形成，第6周发现CLA组愈合接近完全愈合，Control组仍有外骨痂，并没有达到完全愈合标准。
X-Ray摄片评分：通过3名骨科医生依照“RadiographicGradingScaleofFractureCallusFormation”的标准评分分析，在骨折愈合第2周CLA组：1.08±0.16分；Control组：0.83±0.19分。在骨折愈合第4周CLA组：3.66±0.33分；Control组：3.0±0.33分。在骨折愈合第6周CLA组：4.43±0.57分；Control组：3.38±0.36分。在骨折第6周时CLA组的评分明显高于Control组，见图3。
从图3结果可以看出：骨折愈合第2周时X-Ray摄片分值很接近(P＝0.23)。骨折愈合第4周时，CLA组分值要高于Control组，但无统计学差异(P＝0.07)。骨折愈合第6周时，CLA组的评分明显高于Control组，并且有统计学差异(P＝0.002)。
Micro-CT扫描结果
Micro-CT扫描图像分析：骨折愈合第4周CLA组与Control组骨皮质不连续，内部骨小梁未全部形成连续性，骨折线清晰可见。骨折愈合第6周，CLA组骨皮质连续性存在，骨折断端未见透亮影，近似正常骨结构，Control组骨折线模糊，皮质骨大部分连续，仍可见骨痂存在，如图4所示。
骨密度(BMD)测定：Micro-CT骨形态学参数由大鼠胫骨骨折断端为中心测量而得。骨折愈合第4周，CLA组中大鼠胫骨骨折断端ROI的BMD(0.88±0.14g/cm3)，Control组中大鼠胫骨骨折断端ROI的BMD(0.85±0.07g/cm3)，CLA组与Control组之间的BMD差异无统计学意义(P＞0.05)。在骨折愈合第6周，CLA组中大鼠胫骨骨折断端ROI的BMD(0.98±0.05g/cm3)，Control组中大鼠胫骨骨折断端ROI的BMD(0.86±0.08g/cm3)，CLA组与Control组之间的BMD差异有统计学意义(P﹤0.05)。CLA组中大鼠胫骨骨折断端ROI的BMD明显高于Control组，如图5所示。
骨折断端横截面积(CSA)测定：Micro-CT骨形态学参数由大鼠胫骨骨折断端为中心测量而得。骨折愈合第4周，CLA组中大鼠胫骨骨折断端ROI的CSA(13.85±5.33mm2)，Control组中大鼠胫骨骨折断端ROI的CSA(9.13±3.32mm2)，CLA组与Control组之间的CSA差异无统计学意义(P＞0.05)。骨折愈合第6周，CLA组中大鼠胫骨骨折断端ROI的CSA(14.05±3.13mm2)，Control组中大鼠胫骨骨折断端ROI的CSA(9.38±1.87mm2)，CLA组与Control组之间的CSA差异有统计学意义(P＜0.05)。CLA组中大鼠胫骨骨折断端ROI的CSA明显高于Control组，如图6所示。
骨强度指数(BSI)的计算分析：骨折愈合第4周，CLA组中大鼠胫骨骨折断端ROI的BSI(12.32±5.71mg/mm)，Control组中大鼠胫骨骨折断端ROI的BSI(7.50±2.11mg/mm)。CLA组与Control组之间的BSI差异无统计学意义(P＞0.05)。骨折愈合第6周，CLA组中大鼠胫骨骨折断端ROI的BSI(13.73±2.67mg/mm)。Control组中大鼠胫骨骨折断端ROI的BSI(8.07±1.66mg/mm)，CLA组与Control组之间的BSI差异有统计学意义(P＜0.05)。CLA组中大鼠胫骨骨折断端ROI的BSI明显高于Control组，如图7所示。
5.3力学测试结果
本实验生物力学测试应用3点弯曲应力试验测试大鼠胫骨骨折断端愈合的力学强度。在骨折愈合第6周，比较CLA组与Control组之间的最大弯曲应力，CLA组(78.12±10.03N)，Control组(32.34±8.99N)，比较两组差异P＝0.03，具有统计学意义(P＜0.05)。CLA组3点弯曲应力高于Control组，如图8所示。
6组织学观察
根据HE染色，如图9所示，可以观察到，在骨折愈合第6周，CLA组骨痂中心有部分软骨细胞样类骨质，骨痂内软骨骨化明显，充满大量的骨样类骨质，形成编织骨，骨痂边缘骨桥形成完整，骨痂开始塑型；Control组骨痂中心仅为小部分肥大软骨细胞，骨痂内有较多软骨样类骨质，骨痂边缘部分骨桥形成。
7讨论：
骨折愈合是机体结缔组织的一种再生修复，涉及到细胞、生长因子、细胞外基质相互作用一个复杂的过程，在骨折修复过程中包括重叠的四个阶段：最初的炎症反应、软骨痂形成、硬骨痂形成、最后的骨重建的完成。在整个过程均需要有关骨折修复的各种细胞的增殖和相互作用，特别是成骨细胞发挥着重要的作用，成骨细胞分泌的ALP可以渗透入血液，因此血清ALP可作为成骨细胞活跃性的指标。
ALP被认为是骨形成的标志物之一。ALP能分解有机磷酸化合物，产生大量的无机磷酸盐离子，促使其与钙离子结合成磷酸钙而沉积于骨组织中，其含量变化可预示骨折愈合程度。本实验结果显示，应用CLA干预胫骨骨折大鼠，显著提高血清ALP的活性，说明成骨细胞活跃，也有研究报道有实验结果显示高浓度c9，t11-CLA及t10，c12-CLA均能显著提高成骨细胞系MG63细胞及SaOS2细胞的ALP活性，并增加细胞成熟过程中矿化结节的数量，这提示其对成骨过程有一定的促进作用。体外实验表明c9，t11-CLA能够促进体外培养的人骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化，同时不影响其向成骨细胞分化；而t10，c12-CLA能够促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化同时抑制其向脂肪细胞分化，这与本实验结果相一致。提示CLA能通过影响成骨细胞和破骨细胞的转化和相互作用，实现促进骨折愈合。
骨矿物质含量与骨力学强度密切相关，骨强度的80％可以用骨密度来判定。骨基质形成后需要骨盐沉积以完成愈合，骨折端组织的矿化导致局部骨量和骨密度的增加，骨痂趋于成熟骨化，使骨的力学强度迅速增加。故骨矿含量的变化也反映了骨折愈合[18]。本实验通过Micro-CT扫描测定骨折端骨密度，在骨折愈合第6周，CLA干预组的BMD明显高于Control组(P﹤0.05)。反映出CLA可能具有提高骨折愈合骨痂骨密度，促进骨折愈合质量。
力学强度恢复和结构完整是骨折愈合的观察终点，结合生物力学测试及Micro-CT扫描计算BSI对比，其中BSI作为骨折愈合定量评价的依据，准确率90.5％，能够精确反映骨折愈合与否。实验结果示CLA干预组骨折愈合强度优于Control组，暗示CLA可能通过提高骨折愈合质量，从而优化骨折愈合强度，能够促进骨折愈合。
综上所述，骨折愈合生物学过程复杂，影响骨折愈合因素是多方面的，通过本实验表明：CLA可能对骨折愈合具有促进的作用，补充CLA可能成为促进骨折愈合又一有效安全的方法。
本实验结果提示CLA对骨折愈合有促进作用。通过对骨折不同时间点观察血清ALP和放射学检查说明经过CLA干预后的大鼠骨折愈合明显优于空白对照组。血清ALP在骨折后2周明显高于空白对照组P＝0.0126，而且在术后第4、6周，CLA干预组的ALP均高于空白对照组，虽然两组对比无统计学意义，但是发现CLA干预组的ALP保持一定的水平，我们认为CLA可以提高ALP的活性，从而说明CLA有助于骨折早期愈合。放射学的检查同样证实这一点，选3名骨科医生对X线光片的评价，并应用统一的骨痂愈合评分标准，我们发现在术后第6周，CLA干预组的评分3.38±0.36分，空白对照组评分4.43±0.57分，CLA干预组明显优于空白对照组P<0.05，2、4周两组虽没有统计学意义，但是CLA干预组的评分均优于空白对照组。以上的结果说明CLA可以促进骨痂形成，有助于骨折愈合。
骨折愈合是机体结缔组织的一种再生修复，涉及到细胞、生长因子、细胞外基质相互作用一个复杂的过程，在骨折修复过程中包括重叠的四个阶段：最初的炎症反应、软骨痂形成、硬骨痂形成、最后的骨重建的完成在整个过程均需要有关骨折修复的各种细胞的增殖和相互作用，特别是成骨细胞发挥着重要的作用，成骨细胞分泌的ALP可以渗透入血液，因此血清ALP可作为成骨细胞活跃性的指标。
骨折愈合的过程影响生化骨代谢标记物变化，ALP被认为是骨形成的标志物之一。ALP能分解有机磷酸化合物，产生大量的无机磷酸盐离子，促使其与钙离子结合成磷酸钙而沉积于骨组织中，其含量变化可预示骨折愈合程度。本实验结果显示，应用CLA干预胫骨骨折大鼠，显著提高血清ALP的活性，说明成骨细胞活跃，也有研究报道有实验结果显示高浓度c9，t11-CLA及t10，c12-CLA均能显著提高成骨细胞系MG63细胞及SaOS2细胞的ALP活性，并增加细胞成熟过程中矿化结节的数量，这提示其对成骨过程有一定的促进作用。体外实验表明c9，t11-CLA能够促进体外培养的人骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化，同时不影响其向成骨细胞分化；而t10，c12-CLA能够促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化同时抑制其向脂肪细胞分化，这与本实验结果相符合。提示CLA可能通过影响成骨细胞和破骨细胞的转化和相互作用，实现促进骨折愈合。
本实验具有一定的局限性，骨折愈合是一个复杂的过程，通过血生化和放射学说明CLA对骨折具有积极有益的作用，根据实验结果证明：①共轭亚油酸可以促进骨折愈合。②增强机体内成骨活动，提高ALP的活性。提示其具有开发性的促骨折愈合药物的前景。
另外，共轭亚油酸结合物理方法(如紫外线照射、超声波等)治疗骨质疏松和促进骨折愈合，具有更好的疗效。
共轭亚油酸的摄入在促进骨折愈合和骨质疏松治疗中的作用应该与钙剂的补充受到同样的重视。
共轭亚油酸的补充通过减少脂肪组织，增加肌肉组织，为促进骨折愈合和治疗骨质疏松提供微应力环境。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.共轭亚油酸在制备促进骨折愈合、骨质疏松药物中的应用。
2.含共轭亚油酸为活性成分的药物组合在制备促进骨折愈合、骨质疏松药物中的应用。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108295305A (zh) * | 2018-03-21 | 2018-07-20 | 刘小勇 | 一种骨填充材料及其制备方法 |
| CN113361181A (zh) * | 2021-07-02 | 2021-09-07 | 哈尔滨理工大学 | 一种基于营养扩散以及力学环境的骨折愈合仿真方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1499965A (zh) * | 2001-03-30 | 2004-05-26 | 日清奥利友株式会社 | 骨代谢改善剂 |
| CN101440030A (zh) * | 2008-12-22 | 2009-05-27 | 吉林农业大学 | 超临界制取共轭亚油酸的方法 |
-
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1499965A (zh) * | 2001-03-30 | 2004-05-26 | 日清奥利友株式会社 | 骨代谢改善剂 |
| CN101440030A (zh) * | 2008-12-22 | 2009-05-27 | 吉林农业大学 | 超临界制取共轭亚油酸的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 单中书 等: "共轭亚油酸在干预大鼠胫骨骨折中对血生化的影响及放射学分析", 《医药前沿》 * |
| 李丽婷 等: "共轭亚油酸c9，t11-CLA及t10，c12-CLA对成骨细胞PPARγ2及骨代谢相关基因表达的影响", 《中国药物与临床》 * |
| 李凯 等: "共轭亚油酸生理功能研究进展", 《食品研究与开发》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108295305A (zh) * | 2018-03-21 | 2018-07-20 | 刘小勇 | 一种骨填充材料及其制备方法 |
| CN113361181A (zh) * | 2021-07-02 | 2021-09-07 | 哈尔滨理工大学 | 一种基于营养扩散以及力学环境的骨折愈合仿真方法 |
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