CN105181947A - 一种基于g-四聚体的检测方法 - Google Patents

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曾令文
林姣
王斗
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Abstract

本发明提出了一种基于G-四聚体的检测方法，利用G-四聚体进行铅离子的胶体金检测，本发明基于铅离子与核酸适配体反应形成G-四聚体的原理，设计的这种检测方法操作简便，检测结果使用肉眼就能观察到，因此被可广泛地应用于基层实验室中。

Description

一种基于G-四聚体的检测方法
技术领域
本发明涉及金属离子检测领域，特别是指一种基于G-四聚体的检测方法。
背景技术
核酸适配体是一小段经体外筛选得到的寡核苷酸序列,能与相应的配体进行高亲和力和强特异性的结合。G-四聚体是一段非常巧妙的、多功能的富G核酸序列，因其具有的适体特性及过氧化物酶活性能够使信号底物产生颜色、荧光等多种信号而被广泛用作核酸检测技术的信号报告分子。本发明中使用的核酸适配体有两段核酸组成：1、probe1；2、G-四聚体probe2，probe2能够与检测的物质形成G-四聚体，不能与probe3结合，T线不出线；当不存在检测物质的时候，核酸适配体就能够与probe3结合和probe4同时结合，T线呈现出红色。游离的NMM自身的荧光强度很弱，易于与G4链体结合后，荧光很强，荧光激发波长为399nm，最强发射峰波长在610nm左右，本发明利用NMM与G4聚体结合可稳定G4聚体的结构的特点。
铅及其化合物对人，特别是儿童的危害极大，其主要毒性效应是导致贫血、神经机能失调和肾损伤。铅广泛的存在于汽车尾气、塑料燃烧的烟气、油漆、劣质儿童玩具、铅酸蓄电池、工业电镀、冶炼产生的废水、食品中的爆米花、皮蛋、锡箔纸包装的食物等中，这些铅最终富积在水中并无法降解，从而被人体吸收。目前，环境水中痕量铅的检测方法有分光光度法、电感耦合等离子-原子发射光谱法和电化学法等。这些方法需要分离富集，操作繁琐费时或需配置大型仪器，不利于现场检测，因此，需要开发中一种简便的检测方法。
发明内容
本发明提出一种基于G-四聚体的检测方法，在进行铅离子的检测中，具有操作简便，易于观察，检测时间段，灵敏度高等的特点。
本发明的技术方案是这样实现的：一种基于G-四聚体的检测方法，利用G-四聚体进行铅离子的胶体金检测。
进一步，所述基于G-四聚体的检测方法包括以下步骤：制备反应液、制备胶体金、制备胶体金-核酸偶联物和检测。
进一步，制备反应液步骤包括：分别配置不同浓度的多种铅离子溶液，作为标准品溶液以绘制标准曲线；配置G-DNA并分别与等体积的样品溶液及标准品溶液混合，使其充分相互作用。
进一步，制备胶体金步骤包括：在圆底烧瓶中加入100ml0.01％的HAuCl4溶液，磁力搅拌加热至沸腾，并向上述溶液中加入4ml1％枸橼酸钠，溶液变为酒红色后，继续煮沸10分钟，停止加热继续搅拌15分钟，得到胶体金溶液，胶体金溶液4℃避光保存。
进一步，制备胶体金颗粒-核酸偶联物步骤包括：
(1)取10倍浓缩的金纳米颗粒900μL，加入100μL超纯水溶解的巯基修饰的DNA(DNAprobe4)，充分混匀；
(2)4℃反应24小时，已充分反应为准；
(3)选用10％的BSA进行封闭，逐滴加入10％的BSA约100μL，加边震荡，使BSA的终浓度为1％，充分混匀；
(4)4℃封闭3-5小时，优选为4小时，以封闭充分为准；
(5)加入1.5M的NaCl溶液和1％的SDS溶液，缓慢滴加，边加边震荡，使NaCl的终浓度为150mmol/L，SDS的终浓度为0.01％，充分混匀；
(6)4℃老化24小时，以老化充分为准；
(7)4℃离心，优选参数为12,000rpm，20分钟，弃上清，沉淀用金重悬液(含20mmol/LNa3PO4、3％BSA、0.25％Tween-20和10％的蔗糖，pH为7.5)重悬，重复离心2-3次，弃上清，留沉淀；
(8)用1mL金重悬液重悬核酸-金标记物沉淀，4℃保存备用；
进一步，检测步骤：将上述反应液加入2微升AuNP-核酸偶联物，转移到试纸条上，加入40微升的上样缓冲液，进行检测，检测反应时间为30-90min。
本发明基于铅离子与核酸适配体反应形成G-四聚体的原理，设计的这种检测方法操作简便，检测结果使用肉眼就能观察到，因此被可广泛地应用于基层实验室中。
与现有技术相比，上述技术方案的优点在于，其优点在于该检测方法操作简单，特异性好，不受反应体系中其它离子比如K+的影响；对样本的要求低，可以用于实际样品的定量检测；灵敏度高，对铅离子的检测限为20nM，达到FDA规定的饮用水中铅离子的最低检测限(72nM)；实验结果用肉眼就能观察到，定量检测不需要使用复杂的仪器，使用普通的读卡仪就能读数。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明所述的铅离子检测试剂盒和检测方法的原理图；
图2为本发明所述的铅离子检测试剂盒和检测方法的灵敏度实验结果图；
图3为本发明所述的铅离子检测试剂盒和检测方法的特异性实验结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：铅离子检测方法：
如图1所示，本发明所述的铅离子检测方法的原理是：
反应液的制备：一段是与AuNP-DNA结合，另外一段与检测的物质结合，形成G-四聚体。Pb2+可以与特定核酸probe2结合形成G-四聚体，从而不能与检测线结合出线。
核酸序列：
probe1TCGGGTGTGGGTGGGTGG
probe2GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG
probe3CGCCACCCACACCCGATTTTTTTTT
probe4CCACCACCACCACCACCACCACCA
probe5TGTCCGATGCTCCTGTCCGATGCTCC
金纳米(胶体金)溶液的制备：在500ml的圆底烧瓶中加入100ml0.01％的HAuCl4溶液，磁力搅拌加热至沸腾；然后向上述溶液中加入4ml1％枸橼酸钠，溶液变为酒红色后，继续煮沸10分钟，停止加热继续搅拌15分钟，得到金纳米(胶体金)溶液。胶体金溶液4℃避光保存，纳米金通过520nm最大吸光度值鉴定。
制备胶体金颗粒-核酸偶联物制备：
(1)取10倍浓缩的金纳米颗粒900μL，加入100μL超纯水溶解的巯基修饰的DNA(DNAprobe4)，充分混匀。4℃反应24小时后，逐滴加入10％的BSA约100μL，加边震荡，使BSA的终浓度为1％，充分混匀，4℃封闭4小时。加入1.5M的NaCl溶液和1％的SDS溶液，缓慢滴加，边加边震荡，使NaCl的终浓度为150mmol/L，SDS的终浓度为0.01％，充分混匀，4℃老化24小时。4℃离心，12,000rpm，20分钟，弃上清。沉淀用金重悬液(含20mmol/LNa3PO4、3％BSA、0.25％Tween-20和10％的蔗糖，pH为7.5重悬，重复离心2-3次，弃上清，留沉淀。最后用1mL金重悬液重悬核酸-金标记物沉淀，4℃保存备用
检测步骤：将上述反应液加入2微升AuNP-核酸偶联物，转移到试纸条上，加入40微升的上样缓冲液，进行检测，检测反应时间为30-90min。
结果肉眼可见，也可以在试纸条读数仪上进行进一步的结果扫描数值分析。
实施例二：对不同浓度的铅离子的检测：
配制一系列不同浓度的铅离子溶液，检测结果如图2所示。由图2可知，随着铅离子浓度的增加，检测线的红色线的亮度也随着降低。检测铅离子的线性范围4nM-100μM，检测限为2nM，达到了美国环境保护局(FDA)规定的饮用水中铅离子浓度的检测限(72nM)。
实施例三：特异性实验：
按照上述的铅离子浓度检测方法，分别配制10μM不同重金属离子的标准溶液，检测其OD值。实验结果如图3所示。
实验结果显示，与10μM的其他重金属离子相比，使用50nM的铅离子检测检测线就可以完全消失，说明该传感器选择性好，不容易受其他物质的干扰。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种基于G-四聚体的检测方法，其特征在于：利用G-四聚体进行铅离子的胶体金检测。
2.如权利要求1中所述基于G-四聚体的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：制备反应液、制备胶体金、制备胶体金-核酸偶联物和检测。
3.如权利要求2中所述基于G-四聚体的检测方法，其特征在于：制备反应液步骤包括：分别配置不同浓度的多种铅离子溶液，作为标准品溶液以绘制标准曲线；配置G-DNA并分别与等体积的样品溶液及标准品溶液混合，使其充分相互作用。
4.如权利要求2中所述基于G-四聚体的检测方法，其特征在于：制备胶体金步骤包括：在容器中加入HAuCl4溶液，搅拌加热至沸腾，并向上述溶液中加入枸橼酸钠，溶液变为酒红色后，继续煮沸8-15分钟，停止加热继续搅拌10-20分钟，得到胶体金溶液，胶体金溶液4℃避光保存。
5.如权利要求2中所述基于G-四聚体的检测方法，其特征在于：制备胶体金颗粒-核酸偶联物步骤包括：
(1)取浓缩的金纳米颗粒，与超纯水溶解的巯基修饰的DNA，充分混匀；
(2)4℃反应充分；
(3)用BSA进行封闭，逐滴加入BSA，加边震荡，使BSA的终浓度为1％，充分混匀；
(4)4℃封闭3-5小时；
(5)加入NaCl溶液和SDS溶液，使NaCl的终浓度为150mmol/L，SDS的终浓度为0.01％，充分混匀；
(6)4℃老化充分；
(7)4℃离心，弃上清，沉淀用金重悬液重悬，重复离心2-3次，弃上清，留沉淀；
(8)用1mL金重悬液重悬核酸-金标记物沉淀，4℃保存备用。
6.如权利要求5中所述基于G-四聚体的检测方法，其特征在于：所述金重悬液含20mmol/LNa3PO4、3％BSA、0.25％Tween-20和10％的蔗糖，pH为7.5。
7.如权利要求2中所述基于G-四聚体的检测方法，其特征在于：检测步骤包括：将上述反应液加入2微升AuNP-核酸偶联物，转移到试纸条上，加入40微升的上样缓冲液，进行检测，检测反应时间为30-90min。
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