CN105147666A - 一种治疗和缓解神经变性疾病的化合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗和缓解神经变性疾病的化合物，它涉及医学技术领域，该化合物为青蒿素（Artemisinin）衍生物，所述的青蒿素（Artemisinin）衍生物包含蒿甲醚（Artemether）、蒿乙醚（Arteether）、青蒿琥酯（Artesunatum）、双氢青蒿素（Dihydroartemisinin）和药学上可接受的辅料。它可以治疗早老性痴呆、帕金森氏综合征和亨廷顿病，毒副作用低，价格低廉，不产生赖药性，可长期服用，实用性强。

Description

一种治疗和缓解神经变性疾病的化合物

技术领域：

本发明涉及一种治疗和缓解神经变性疾病的化合物，属于医学技术领域。

背景技术：

随着世界人口的老龄化，阿尔茨海默病(Alzheimerdisease，AD)等神经变性疾病发病率呈明显上升趋势，已成为老年人中最常见的一种痴呆症，是仅次于心脑血管、肿瘤之后又一严重威胁老年人健康的疾病。神经变性疾病的病因和发病机制尚未完全弄清，缺乏完全模拟AD等神经变性疾病特征的理想动物模型，治疗AD等神经变性疾病缺乏有效药物。研究AD等神经变性疾病的病因和发病机制，开发治疗AD等神经变性疾病的有效药物，提高老年人健康质量成为当今生物医学研究领域的重大课题。

在真核生物中，自噬是高度保守的过程，它发生在细胞质中，细胞内过多或异常的细胞器或蛋白质被运输到溶酶体中被降解。在细胞内主要有三种类型的自噬:巨自噬(macroautophagy)，微自噬(microautophary)和分子伴侣介导的自噬(chaperonemedi-atedautophagy，CMA)。这些自噬过程都有一个共同点，即都是在溶酶体中实现蛋白质的降解。目前，巨自噬在神经退行性病变中的作用尤为受到关注。在自噬的活性调节中，mTOR是调节自噬信号途径的关键信号分子。mTOR信号途径在控制体内蛋白质平衡、维持正常神经功能过程中发挥必不可少的作用。mTOR信号途径可以调控许多形式的记忆和学习功能。在AD动物模型中，mTOR信号途径抑制剂雷帕霉素(“Rapamycin”，一种临床上的免疫抑制剂，目前临床上也用于治疗神经变性疾病)通过增强自噬来改善认知功能障碍，其机制与减轻AI3及tau蛋白的病理损伤作用相关。在转基因小鼠模型中，长期使用雷帕霉素抑制mTOR，可以阻止AD样认知功能障碍，降低AB水平。上述结果表明mTOR抑制剂可以通过增强自噬，降低AI3、改善认知功能，这为AD模型的改善认知功能障碍的治疗提供了可行的治疗路径。

另外，研究发现TAU蛋白(微管相关蛋白)、BACE1蛋白(淀粉蛋白前β位分解酶1)、Aβ蛋白(β-淀粉样蛋白)等分子与阿尔茨海默病、帕金森氏病和亨廷顿病等神经变性疾病有密切关系，这三种蛋白在这类神经变性疾病的病人中的表达量均增高，用于临床治疗的靶分子药物筛选也主要集中在包括mTOR在内的这四种靶蛋白上。能够有效抑制或下调mTOR、TAU蛋白、BACE1蛋白、Aβ蛋白的药物均能够在临床上有效缓解AD、PD和HD等神经变性疾病。

目前临床常用的干预药物主要有雷帕霉素，但这种化合物有极大的毒副作用，不可能长期服用。所以，筛选有效低毒的抗神经变性疾病的药物或化合物一直是研发临床用药的难题和重点。

同时，大量的研究已证实mTOR与动物的寿命相关，调低mTOR的表达量可延长细胞和动物体的衰老周期。

发明内容：

针对上述问题，本发明要解决的技术问题是提供一种治疗和缓解神经变性疾病的化合物。

本发明的一种治疗和缓解神经变性疾病的化合物，该化合物为青蒿素(Artemisinin)衍生物，所述的青蒿素(Artemisinin)衍生物包含蒿甲醚(Artemether)、蒿乙醚(Arteether)、青蒿琥酯(Artesunatum)、双氢青蒿素(Dihydroartemisinin)和药学上可接受的辅料。

本发明的有益效果为：它可以治疗早老性痴呆、帕金森氏综合征和亨廷顿病，毒副作用低，价格低廉，不产生赖药性，可长期服用，实用性强。

附图说明：

为了易于说明，本发明由下述的具体实施及附图作以详细描述。

图1为本发明所述药物组与对照组细胞中靶基因蛋白的凝胶电泳图，

图2为本发明所述药物组与对照组各组细胞中靶基因蛋白表达情况。

具体实施方式：

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面通过附图中示出的具体实施例来描述本发明。但是应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。

如图1所示，本具体实施方式采用以下技术方案：该化合物为青蒿素(Artemisinin)衍生物，所述的青蒿素(Artemisinin)衍生物包含蒿甲醚(Artemether)、蒿乙醚(Arteether)、青蒿琥酯(Artesunatum)、双氢青蒿素(Dihydroartemisinin)和药学上可接受的辅料。

进一步的，药学上可接受的辅料包含异丙醇、乙醇、苯甲醇、肉豆寇酸异丙酯、正丙醇、丙三醇、二甘醇、三乙酸甘油酯、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜(DMSO)、三甘醇、油酸乙酯等。

进一步的，该化合物还包含其临床制剂。

本具体实施方式通过细胞试验显示：青蒿素衍生物可作用于引起早老性痴呆和帕金森氏综合征的相关靶蛋白，同时也作用于与衰老相关的靶蛋白。明显下调了引起上述疾病的靶分子浓度和与衰老相关的靶分子浓度。青蒿素衍生物在小鼠口服的半数致死量(LD50)为895～977mg/kg，大鼠肌内注射油剂的LD50为597mg/kg，并已被用于临床治疗疟疾和肿瘤，是一类安全有效的药物分子。动物脑胶质瘤原位抑制实验和恶性疟引起的脑型疟临床用药显示青蒿素及其衍生物可透过血脑屏障进入大脑。

青蒿素(Artemisinin)衍生物包括蒿甲醚(Artemether)、蒿乙醚(Arteether)、青蒿琥酯(Artesunatum)和双氢青蒿素(Dihydroartemisinin)等药物已在临床上用于治疗疟疾，更为重要的是利用该药或化合物具有透过血脑屏障的特性，用于治疗脑型疟疾并具有显著疗效。近年的研究发现，青蒿素及其衍生物如蒿甲醚在体内外有明显的抗肿瘤和抑制肿瘤细胞生长的作用，且不产生赖药性及不良反应。本研究发现青蒿素及其衍生物具有下调和降低TAU蛋白(微管相关蛋白)、BACE1蛋白(淀粉蛋白前β位分解酶1)、Aβ蛋白(β-淀粉样蛋白)和mTOR蛋白表达浓度的活性，其主要的作用机制如下所述：

1、下调神经元外的β-淀粉样蛋白(β-amyloidprotein，Aβ)的浓度：在细胞水平上青蒿素及其衍生物能够明显下调神经元外的β-淀粉样蛋白(β-amyloidprotein，Aβ)的浓度和表达量，且具剂量依赖性。

2、下调TAU蛋白(微管相关蛋白)的浓度：在细胞水平上青蒿素及其衍生物能够明显下调TAU蛋白(微管相关蛋白)的浓度和表达量，且具剂量依赖性。

3、下调BACE1蛋白(淀粉蛋白前β位分解酶1)的浓度：在细胞水平上青蒿素及其衍生物能够明显下调BACE1蛋白(淀粉蛋白前β位分解酶1)的浓度和表达量，且具剂量依赖性。

4、下调mTOR蛋白的浓度：在细胞水平上青蒿素及其衍生物能够明显下调mTOR的浓度和表达量，且具剂量依赖性。

青蒿素及其衍生物用于治疗脑型疟和脑胶质瘤的优势在于该药能够透过血脑屏障，杀死疟原虫和诱导脑胶质瘤细胞凋亡。神经变性疾病的病灶也主要集中于大脑，青蒿素及其衍生能够透过血脑屏障进入大脑为该类药物或化合物发挥作用提供了前提条件，加之体外研究的结果已证实青蒿素及其衍生能够显著下调和降低与阿尔茨海默病、帕金森氏病和亨廷顿病等神经变性疾病有密切相关的TAU蛋白、BACE1蛋白、Aβ蛋白和mTOR等分子表达量和浓度。该类药物或化合物具有毒副作用低，价格低廉，不产生赖药性，可长期服用等优点。

通过对IC50(半数抑制率)的研究，其用量可为10-150mg/kg/。

试验研究结果显示：青蒿素及其衍生物对体外培养的N2a细胞株中的mTOR、TAU蛋白、BACE1蛋白、Aβ蛋白(Beta)表达浓度均能够有效抑制或明显下调，且具剂量依赖性。

测定蒿甲醚对N2a小鼠神经母细胞瘤的抑制作用。

实验试剂：DMEMF12培养基购自美国GIBCO公司；胎牛血清购自美国GIBCO公司，噻唑蓝(MTT)购自美国SIGMA公司，DMSO购自美国SIGMA公司。

主要仪器：二氧化碳培养箱(美国Forma公司)；酶标仪(美国Bio-Rad公司)；无菌操作台(美国Forma公司)。

细胞株及细胞培养：小鼠神经母细胞瘤细胞株N2a用含10％胎牛血清的DMEMF12细胞培养基于37℃，5％CO2恒温培养箱中常规培养。

药物：蒿甲醚(昆明制药集团股份有限公司，50mg)。

试验方法：

1.四甲基偶氮唑盐法(MTT法)：

取对数生长期N2a细胞，调整细胞悬液为1×105个/mL。取三个96孔板，在细胞μ板的外周各孔均加入200μL的新鲜培养基，其它各孔每孔用移液器加入细胞浓度为1×105个/mL的细胞悬液200μL，使每孔细胞数2.0×104个，其中设置空白对照组1个包括6个复孔、实验组9个在此后的实验中依次用于加入不同浓度的药液(800、400、200、100、50、25、12.5μg/mL)，每个浓度的药物组均设6个复孔，置37℃、5％CO2培养箱中培养24h；取出96孔板，用移液器小心吸去上清液，实验组每孔分别加入用完全培养液配制的相应浓度的药物溶液200μL，每个浓度6个复孔。空白对照组加200μL的完全培养液，置37℃，5％CO2培养箱中分别培养24h、48h、72h；称取50mgMTT溶于5mLPBS中，过滤，避光保存；取出已培养到相应时间的培养板，用5mL注射器吸干孔内的液体，每孔加入20μLMTT溶液，放入培养箱内继续孵育4h，去除MTT，每孔加入150μLDMSO，暗处振荡15min，450型ELISA-Reader酶标仪(Bio-Rad公司)490nm主波长，630nm副波长检测吸光度。以对照组细胞活力为100％，按公式计算不同浓度蒿甲醚对N2a细胞增殖的抑制率：细胞抑制率(％)＝(1－药物组吸光度/对照组吸光度)×100％。借助SPSS17.0软件求的IC50值。

2.蛋白印迹法(Westernblot)检测靶基因蛋白量

2.1单层贴壁细胞总蛋白提取

取出已加药处理48h的小鼠神经母瘤细胞，去除培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液(或将瓶直立放置一段时间，使残余培养液流到瓶底，然后再用移液器将其吸走)，再按照以下步骤进行操作：

每瓶细胞加3mL4℃预冷的PBS(0.01MpH＝7.2～7.3)。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，清洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。

按1mL裂解液加10μLPMSF(100mM)，摇匀置于冰上(PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。)

每瓶细胞加400μL含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。

裂解完后，用干净的刮棒迅速将细胞刮于培养瓶的一侧，然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5mL离心管中。(整个操作尽量在冰上进行。)

于4℃下12000rpm离心5min。(提前开离心机预冷)

将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中置于-20℃保存。

2.2BCA法蛋白定量

实验前，将试剂A与试剂B按50:1的比例混匀成为BCA反应液，避免光照。然后将冰箱中试剂盒内的BSA标准液和样本融化。准备酶标板，做好相应的标记，稀释BSA标准蛋白，准备20μg/mL到25μg/mL一系列的BSA标准蛋白浓度。轻轻摇动酶标板，混匀反应物。随后，取25μL标准蛋白或样品分别于200μL反应液混合置于酶标板中，轻轻摇动酶标板，混匀反应物，37℃暗室孵育30min，冷却至室温，即刻放入分光光度酶标仪里进行测定，562nm处读取吸收值。绘制蛋白质浓度标准曲线：纵坐标为吸光值，横坐标为蛋白浓度。根据上述标准曲线，测出待测样品的实际浓度。

2.3SDS-PAGE凝胶的配制

根据目的蛋白分子量的大小确定SDS-PAGE分离胶浓度为10％，最佳分离范围为20～80kDa。确定分离胶所需凝胶溶液体积，按表1给出数据在一小烧杯中按所需溶液浓度配制一定体积的分离胶溶液，依次混匀各成分。一旦加入TEMED，马上开始聚合，立即快速旋动混合物并进入后续操作。

表1：SDS-PAGE分离胶的配制规格

Tab.1:ThepreparationspecificationsofSDS-PAGEseparationgel

资料来源：SDS-PAGE凝胶配制试剂盒说明书，Maibio。

按表2所给数据，在一个小烧杯中按所需溶液浓度配制一定体积的分离胶溶液，并依次混匀各成分。

表2：SDS-PAGE浓缩胶的配制规格

Tab.2:ThepreparationspecificationsofSDS-PAGEspacergel

资料来源：SDS-PAGE凝胶配制试剂盒说明书，Maibio。

2.4SDS-PAGE电泳

首先，一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸稍许洗衣粉轻轻擦洗。两面擦洗，随后用自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗干净后立晾干。随后，按照下列操作进行：

玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后将其垂直卡在架子上准备灌胶。

配好分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时可用10mL枪吸取5mL胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封胶。

当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝固。放置3min使胶充分凝固，倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。

配5％的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。待到浓缩胶凝固后，将梳子竖直向上轻轻取出。

用水冲洗浓缩胶，将其放入电泳槽中。

测完蛋白含量后，计算含20～50μg蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品至200μl的EP管中，加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×。上样前要将样品于沸水中煮5～10min使蛋白变性。

加入足够的电泳液后准备上样。用微量加样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。

进行电泳，电泳时间一般4～5h，电压为40V较好，也可用60V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。

2.5转膜(湿转法)

转一张膜需要准备6张7.0～8.3cm的滤纸和1张7.3～8.6cm的硝酸纤维素膜。切滤纸和膜时需要戴手套(因为手上的蛋白会污染膜)。将切好的硝酸纤维素膜置于水上浸泡2h待用。在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜所需的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以消除气泡。在垫子上垫三层滤纸，一手固定滤纸，一手用玻棒擀去其中的气泡。将玻璃板撬掉后进行剥胶，撬的时候动作要轻，需在两个边上轻轻的反复撬。待玻璃板松动后，直到撬去玻板。除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去，要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，盖满整个胶并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。将夹子放入转移槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用60V转移2h或40V转移3h。转完后将膜用考马斯亮蓝染液染5min(于脱色摇床上摇)。然后用水冲洗掉膜上的染液就可看到膜上的蛋白。将膜晾干备用。

2.6免疫反应

将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。将一抗用TBST稀释至适当浓度(在1.5mL离心管中)；撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡；室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min，进行化学发光反应。

2.7化学发光、显影及定影

把A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触；1min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-光片夹中。在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X-光片，用切纸刀剪裁适当大小(比膜的长和宽均需大1cm)；打开X-光片夹，把X-光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为1～2min(20～25℃)，温度过低时(低于16℃)需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为5～10min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。利用Syngene凝胶成像系统扫描目的条带的灰度值，以目的蛋白条带灰度值与内参照β-actin蛋白条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达水平，实验重复3次。

实验结果：

1，不同浓度蒿甲醚作用效应：随着药物浓度增加对细胞抑制率也增加，结果见表3。

表3：不同浓度的蒿甲醚药物对细胞的抑制率

Tab.3Theinhibitionratiosofdifferentconcentrationsofartemetherdrugonthecells

通过分析比较，蒿甲醚浓度为200ug/ml时能够达到N2a细胞的半数抑制率。

2.各组细胞靶基因蛋白的表达情况

对各组细胞进行蛋白质印记试验的结果显示如图1与图2，药物处理48h后，和正常组相比较，实验组的4个靶蛋白都有明显下调趋势，差异显著(P<0.05)，且具统计学意义。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (1)

1.一种治疗和缓解神经变性疾病的化合物，其特征在于：该化合物为青蒿素（Artemisinin）衍生物，所述的青蒿素（Artemisinin）衍生物包含蒿甲醚（Artemether）、蒿乙醚（Arteether）、青蒿琥酯（Artesunatum）、双氢青蒿素（Dihydroartemisinin）和药学上可接受的辅料。