CN105132438A - 鱼类病毒性出血性败血症病毒g基因的真核表达方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鱼类病毒性出血性败血症病毒G基因的真核表达方法，包括下列步骤：（1）密码子优化的主要抗原域的基因合成；（2）重组杆状病毒转移载体的构建；（3）穿梭质粒的构建；（4）重组Bacmid的转染及表达产物的分析鉴定。本发明实现了G蛋白抗原域的在Bac-to-Bac杆状病毒系统中的高效表达；经Western？blotting对其活性进行初步鉴定分析证实，该表达蛋白具备免疫原性，这为进一步进行表位疫苗的开发和VHSV的分子诊断技术的建立提供了基础。

Description

鱼类病毒性出血性败血症病毒G基因的真核表达方法
技术领域：
本发明涉及一种鱼类病毒性出血性败血症病毒G基因的真核表达方法，属于生物基因工程领域。
背景技术：
病毒性出血性败血症病毒(viralhemorrhagicsepticemiavirus，VHSV)是引起鲑鳟鱼类和多种海水鱼类呈暴发性流行的烈性传染病，属弹状病毒科，粒外弹状病毒属的成员。病毒基因组从3'端至5'端依次包含N(核蛋白)-P(磷蛋白)-M(基质蛋白)-G(糖蛋白)-NV(非结构蛋白)-L(聚合酶蛋白)6个基因。
表面糖蛋白基因G是其重要抗原，也是各类免疫学检测试验优选的抗体制备材料。然而由于不同物种密码子的偏爱性不同，未经改造的野生型G基因在体外表达时往往不理想，阻碍了VHSVG基因编码蛋白抗体的获得。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种鱼类病毒性出血性败血症病毒G基因主要抗原域的真核表达方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
在进行真核表达之前，需要对鱼类病毒性出血性败血症病毒G基因的主要抗原域的进行预测。运用NCBIConservedDomains查找工具分析发现该基因氨基酸序列含有的保守结构域(图1所示)。利用丹麦科技大学生物序列分析中心(CBS)网站在线程序SignalP4.1对VHSVG蛋白的氨基酸序列作信号肽预测(图2所示)，并避开信号肽区域。采用OptimumAntigenTM分析软件预测蛋白的优势抗原肽段，应用亲水性、表面特性、柔韧性和二级结构4种参数联合的Jameson-Wolf法综合预测蛋白的抗原指数(表1、图3所示)，并根据其结果选取主要抗原域(Mainantigenicdomains,MAD)40-435肽段，命名为GM。
本发明提供的密码子优化后的鱼类病毒性出血性败血症病毒GM基因序列，序列如如SEQIDNO.1所示。
本发明还提供一种含有上述基因的重组表达载体。
进一步的，本发明提供的鱼类病毒性出血性败血症病毒G基因的真核表达方法，其特征在于，包括下列步骤：
(1)密码子优化的基因合成
利用http：//gcua.schoedl.de/服务器的密码子分析软件，分析VHSV-H株基因序列(GenBank登录号KJ768664)在昆虫细胞中的使用频率，结果发现，G基因中有17种密码子在昆虫细胞中使用频率低于20％。将选取的G基因40-435氨基酸肽段中低频率密码子进行优化，优化后的基因序列如上所示。
同时为便于纯化，在40-435氨基酸序列区域N端加6×His标签。因此，拟设计表达的蛋白序列如下：
MHHHHHHTPLYTHPSNCREDSFVPIRPAQLRCPHEFEDINKGLVSVPTRIIHLPLSVTSVSAVASGHYLHRVTYRVTCSTSFFGGQTIEKTILEAKLSRQEATNEASKDHEYPFFPEPSCIWMKNNVHKDITHYYKTPKTVSVDLYSRKFLNPDFIEGVCTTSPCQTHWQGVYWVGATPTAHCPTSETLEGHLFTRTHDHRVVKAIVAGHHPWGLTMACTVTFCGTEWIKTDLGDLIQVTGPGGARKLTPKKCVNTDIQMRGATDDFSYLNHLITNMAQRTECLDAHSDITASGKISSFLLSKFRPSHPGPGKAHYLLEGQIMRGDCDYEAVVSINYNSAQYKTVNNTWKSWKRVNNNTDGYDGMIFGDKLIIPDIEKYQSVYDSGMLVQRNLVEVPHLSIVF
随后将设计的40-435氨基酸区域进行密码子优化的核酸序列，并交由南京金斯瑞生物技术有限公司进行基因合成并克隆至pUC57中。
(2)重组杆状病毒转移载体的构建
双酶切pUC57-GM质粒及转座质粒pFsatBacdual，酶切产物胶回收后用T4DNA连接酶连接，转化E.coliDH5α感受态细胞。经氨苄抗性筛选挑取单菌落，同时进行双酶切鉴定，鉴定正确的转移载体命名为pFBd-GM。
(3)穿梭质粒的构建
将重组pFBd-GM质粒转化含有Bacmid的感受态细胞DH10Bac，Bacmid与pFBd-GM在DH10Bac细胞中发生同源重组，经三抗(庆大霉素7μg/mL、卡那霉素50μg/mL和四环素10μg/mL)抗性筛选及蓝白斑筛选，挑取白色菌落，重组Bacmid用M13F/M13R通用引物进行PCR鉴定，扩增条件如下：93℃预变性3min，94℃30s，55℃45s，72℃5min，30个循环，72℃7min。鉴定正确的穿梭质粒命名为rBacmid-GM。pFastBacdual质粒经相同处理得到rBacmid-N作为阴性对照。
(4)重组Bacmid的转染及表达产物的分析鉴定
用脂质体法将重组rBacmid-GM和rBacmid-N分别转染sf9昆虫细胞(9×l05个/mL)，28℃培养，出现细胞病变时收集细胞培养液上清，在sf9细胞上传3代。用细胞基因组DNA提取试剂盒提取感染rBacmid-GM和rBacmid-N的细胞的病毒基因组，按照Bac-to-Bac说明书推荐程序进行PCR鉴定。鉴定正确后，收集转染后第3代细胞培养物，裂解液裂解细胞后超声破碎，离心取上清，进行SDS-PAGE电泳，并用相同的方法处理正常sf9细胞作为阴性对照。将SDS-PAGE电泳产物转印至PVDF膜，3％BSA进行封闭，1:100稀释VHSV羊抗阳性血清，37℃孵育1h，用1:5000稀释的兔抗羊HRP-IgG(辣根过氧化物酶标记)37℃孵育1h，最后进行显色鉴定。
本发明的有益效果：
本发明对G蛋白采取了B细胞表位多参数预测与主要抗原域的截段表达相结合的策略，通过密码子的优化和合成基因可以显著的提高蛋白产量；实现了G蛋白抗原域的在Bac-to-Bac杆状病毒系统中的高效表达。经Westernblotting对其活性进行初步鉴定分析证实，该表达蛋白具备免疫原性，这为进一步进行表位疫苗的开发和VHSV的分子诊断技术的建立提供了基础。
本发明表明利用真核表达系统可获得与VHSV中G蛋白空间结构更为接近的重组蛋白，并为进一步开展G基因功能奠定下良好的基础。
附图说明：
图1是VHSVG蛋白氨基酸序列的结构域CDD分析结果。
图2是NeuralNetworks(NN)对VHSVG氨基酸序列的信号肽预测结果。
图3是VHSVG蛋白氨基酸序列的抗原指数分析结果。
图4是穿梭质粒的PCR鉴定结果，M:DNAmarkerDL15000；以rBacmid-GM为模板的PCR产物
图5是重组杆状病毒细胞破碎后上清Ni柱纯化结果；M：蛋白Marker；1:用盐酸胍溶解的沉淀；2：纯化后流出；3:20mM咪唑洗脱；4-8：250mM咪唑洗脱。
图6是Ni柱纯化后Western-blot分析；M1蛋白Marker(120、80、60、40、30、20、10)；M2蛋白Marker(120、85、60、40、22)；BSA(2.0μg)；纯化后G蛋白(1.95μg)；VHSV-GM(羊抗血清)。
具体实施方式：
1材料和方法
1.1菌株、细胞系与质粒
VHSV-H株由本实验室分离并保存。E.coliDH5α菌株、pFastBacdual转座质粒以及DH10BacTMCompetentCells感受态细胞购自南京金斯瑞生物有限公司提供。Sf9昆虫细胞由青岛蔚蓝生物，骨髓瘤细胞SP2/0由本实验室保存。
1.2试剂
胎牛血清、CellfectinⅡReagent、昆虫细胞培养基sf900-ⅡSFM、Grace培养基及Lipofectaminetmreagent购自Gibco公司，RazoalRNA提取试剂盒购自Promega公司；M-MLV反转录酶、ExTaqDNA扩增用酶、限制性内切酶购自TaKaRa公司；T4连接酶和RNA提取试剂盒购自Promage公司；胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒购自Tiangen公司；6×His蛋白质纯化树脂Ni-NTA购自QIAGEN公司；兔抗羊HRP-IgG、羊抗鼠HRP-IgG购自Jackson公司；羊抗鼠FITC-IgG、PEG4000、HAT等购自Sigma公司；BALB/c购自山东大学实验动物中心。VHSV羊抗阳性血清由中国检验检疫科学研究院惠赠保存。
1.3利用生物信息学分析工具对主要抗原域的预测
运用NCBIConservedDomains查找工具分析发现该基因氨基酸序列含有的保守结构域。利用丹麦科技大学生物序列分析中心(CBS)网站在线程序SignalP4.1对VHSVG蛋白的氨基酸序列作信号肽预测。采用OptimumAntigenTM分析软件预测蛋白的优势抗原肽段，应用亲水性、表面特性、柔韧性和二级结构4种参数联合的Jameson-Wolf法[2]综合预测蛋白的抗原指数，并根据其结果选取主要抗原域(Mainantigenicdomains,MAD)命名为GM。
利用NCBIConservedDomains查找工具分析发现该基因氨基酸序列含有1个保守结构域，属弹状病毒衣壳糖蛋白家族成员。如图1。
利用丹麦科技大学生物序列分析中心(CBS)网站在线程序SignalP4.1对VHSVG蛋白的氨基酸序列作信号肽预测，结果如图2。由图可见，VHSVG蛋白序列中所有位点预测到在20-21aa位点处存在信号肽切割位点，含有信号肽。因此在后续表达中拟剔除或避开该信号肽段。
采用OptimumAntigenTM分析软件预测结果显示，此株G蛋白的大多数区域的抗原指数都比较高，尽管这些区域多分布在亲水性区域和可塑性区域，但一般认为抗原表位还必须存在于溶剂可及性区域。其中氨基酸序列中蓝色区段的抗原性指数较高，可能是B细胞表位优势区域(详见表1、图3)，因此选取全基因中的40-435AA的肽段，且避开了信号肽，将包含抗原指数最高的区域进行后续表达。同时为便于纯化，我们还在40-435氨基酸序列区域N端加上了6×His标签。
表1VHSVG蛋白抗原表位分析
1.4密码子优化的基因合成
利用http：//gcua.schoedl.de/服务器的密码子分析软件，分析VHSV-H株基因序列(GenBank登录号KJ768664)在昆虫细胞中的使用频率，并将G基因中低频率密码子使用密集区域的密码子进行优化，随后将设计的添加了6×His标签的40-435氨基酸区域的核酸序列，交由南京金斯瑞生物技术有限公司进行基因合成并克隆至pUC57中。
1.5重组杆状病毒转移载体的构建
双酶切pUC57-GM质粒及转座质粒pFsatBacdual，酶切产物胶回收后用T4DNA连接酶连接，转化E.coliDH5α感受态细胞。经氨苄抗性筛选挑取单菌落，同时进行双酶切鉴定，鉴定正确的转移载体命名为pFBd-GM。
1.6穿梭质粒的构建
将重组pFBd-GM质粒转化含有Bacmid的感受态细胞DH10Bac，Bacmid与pFBd-GM在DH10Bac细胞中发生同源重组，经三抗(庆大霉素7μg/mL、卡那霉素50μg/mL和四环素10μg/mL)抗性筛选及蓝白斑筛选，挑取白色菌落，重组Bacmid用M13F/M13R通用引物进行PCR鉴定，扩增条件如下：93℃预变性3min，94℃30s，55℃45s，72℃5min，30个循环，72℃7min。鉴定正确的穿梭质粒命名为rBacmid-GM。pFastBacdual质粒经相同处理得到rBacmid-N作为阴性对照。
将合成GM基因片段和6His组氨酸标签克隆入pFastBacdual，经筛选鉴定获得了重组转移载体pFastBacdualGM，转化DH10Bac后进行筛选，获得的重组质粒经PCR扩增鉴定，穿梭质粒rBacmid-GM的扩增产物片段大小为3769bp，均与预期一致，证明获得了正确质粒(见图4)。
1.7重组Bacmid的转染及表达产物的分析鉴定
用脂质体法将重组rBacmid-GM和rBacmid-N分别转染sf9昆虫细胞(9×l05个/mL)，28℃培养，出现细胞病变时收集细胞培养液上清，在sf9细胞上传3代。用细胞基因组DNA提取试剂盒提取感染rBacmid-GM和rBacmid-N的细胞的病毒基因组，按照Bac-to-Bac说明书推荐程序进行PCR鉴定。鉴定正确后，收集转染后第3代细胞培养物，裂解液裂解细胞后超声破碎，离心取上清，进行SDS-PAGE电泳，并用相同的方法处理正常sf9细胞作为阴性对照。将SDS-PAGE电泳产物转印至PVDF膜，3％BSA进行封闭，1:100稀释VHSV羊抗阳性血清，37℃孵育1h，用1:5000稀释的兔抗羊HRP-IgG(辣根过氧化物酶标记)37℃孵育1h，最后进行显色鉴定。
重组杆状病毒接种sf9细胞，72h收获。用含蛋白酶抑制剂的裂解溶液裂解，经超声波破碎后进行离心。离心后上清和沉淀分别用Ni柱进行纯化，SDS-PAGE分析纯化的不同组分，结果(见图5)显示在45kd处有预测目的条带出现。Westernblotting检测结果显示，在目的条带处出现一条棕色反应带，表明His-GM可被羊抗VHSV多克隆血清识别(图6)。
核苷酸序列表
<110>山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120>鱼类病毒性出血性败血症病毒G基因的真核表达方法
<160>1
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>1209
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>primer_bind
<222>(1)..(1209)
<223>密码子优化后的鱼类病毒性出血性败血症病毒G基因主要抗原域序列
<400>1
1ATGCACCACCACCATCATCATACCCCACTCTACACACACCCGAGCAACTGCCGTGAGGAT
61TCGTTCGTTCCCATCAGACCAGCACAGCTCAGGTGCCCCCACGAGTTCGAAGACATCAAC
121AAGGGCTTGGTCAGTGTTCCAACCAGAATCATTCACCTCCCGTTGTCTGTTACTTCTGTG
181TCAGCTGTCGCCTCAGGACACTACCTGCATCGCGTCACTTACCGTGTTACCTGCAGTACT
241TCGTTCTTCGGTGGCCAGACAATCGAGAAGACGATTCTCGAAGCCAAATTGAGTAGGCAA
301GAGGCTACAAACGAAGCCTCGAAGGACCACGAGTACCCTTTCTTCCCTGAACCCTCATGT
361ATCTGGATGAAGAACAACGTCCACAAAGATATTACCCATTACTACAAGACACCCAAAACG
421GTGTCCGTCGACTTGTACAGCAGAAAGTTCCTGAACCCAGATTTCATCGAGGGAGTGTGC
481ACCACTTCCCCGTGTCAGACCCACTGGCAAGGAGTTTACTGGGTGGGTGCAACACCTACG
541GCACACTGCCCAACCAGCGAGACTCTGGAAGGTCATCTCTTCACCAGGACTCACGACCAT
601AGAGTGGTCAAGGCAATCGTTGCGGGCCACCATCCATGGGGACTGACAATGGCATGCACA
661GTGACGTTCTGTGGCACAGAGTGGATCAAGACGGACCTGGGAGATCTCATTCAGGTCACG
721GGTCCTGGAGGTGCTCGCAAACTCACACCCAAGAAATGCGTGAACACGGACATCCAGATG
781CGTGGTGCTACTGACGATTTCTCCTACTTGAACCACCTGATCACCAACATGGCCCAACGC
841ACTGAATGTCTGGACGCTCATTCTGATATCACTGCCTCAGGCAAGATTTCCAGCTTCCTG
901CTCAGTAAATTCAGACCATCGCACCCAGGACCAGGAAAGGCTCATTACTTGCTGGAGGGT
961CAGATCATGCGTGGCGACTGTGATTACGAAGCAGTTGTGTCCATTAACTACAACAGCGCG
1021CAATACAAGACCGTGAACAACACTTGGAAGTCTTGGAAACGTGTCAACAACAACACAGAC
1081GGTTACGATGGCATGATCTTCGGTGACAAGCTGATCATCCCTGATATCGAAAAGTACCAA
1141TCAGTCTACGACAGCGGAATGTTGGTTCAGAGAAACTTGGTTGAGGTCCCCCACTTGAGC
1201ATCGTCTTC

Claims (7)

1.密码子优化后的鱼类病毒性出血性败血症病毒G基因主要抗原域核酸序列，其特征在于序列如SEQIDNO.1所示。
2.一种含有如权利要求1所述基因的重组表达载体。
3.鱼类病毒性出血性败血症病毒G基因的真核表达方法，其特征在于，包括下列步骤：
（1）密码子优化的G基因主要抗原域核酸片段的合成，核酸序列如权利要求1所示
（2）重组杆状病毒转移载体的构建
（3）穿梭质粒的构建
（4）重组Bacmid的转染及表达产物的分析鉴定。
4.根据权利要求3所述的真核表达方法，其特征在于，所述的密码子优化的基因合成具体步骤为：
将G基因中低频率密码子进行优化，并在G基因抗原域C端加上接头及6×his序列。
5.根据权利要求3所述的真核表达方法，其特征在于，所述的重组杆状病毒转移载体的构建具体步骤为：
双酶切pUC57-GM质粒及转座质粒pFsatBacdual，酶切产物胶回收后用T4DNA连接酶连接，转化E.coliDH5α感受态细胞；经氨苄抗性筛选挑取单菌落，同时进行双酶切鉴定，鉴定正确的转移载体命名为pFBd-GM。
6.根据权利要求3所述的真核表达方法，其特征在于，所述的穿梭质粒的构建具体步骤为：将重组pFBd-GM质粒转化含有Bacmid的感受态细胞DH10Bac，Bacmid与pFBd-GM在DH10Bac细胞中发生同源重组，经三抗：庆大霉素7μg/mL、卡那霉素50μg/mL和四环素10μg/mL的抗性筛选及蓝白斑筛选，挑取白色菌落，重组Bacmid用M13F/M13R引物进行PCR鉴定，扩增条件如下：93℃预变性3min，94℃30s，55℃45s，72℃5min，30个循环，72℃7min；鉴定正确的穿梭质粒命名为rBacmid-GM；pFastBacdual质粒经相同处理得到rBacmid-N作为阴性对照。
7.根据权利要求3所述的真核表达方法，其特征在于，所述的重组Bacmid的转染及表达产物的分析鉴定具体步骤为：
用脂质体法将重组rBacmid-GM和rBacmid-N分别转染sf9昆虫细胞，28℃培养，出现细胞病变时收集细胞培养液上清，在sf9细胞上传3代；用细胞基因组DNA提取试剂盒提取感染rBacmid-GM和rBacmid-N的细胞的病毒基因组，进行PCR鉴定；
鉴定正确后，收集转染后第3代细胞培养物，裂解液裂解细胞后超声破碎，离心取上清，进行SDS-PAGE电泳，并用相同的方法处理正常sf9细胞作为阴性对照；将SDS-PAGE电泳产物转印至PVDF膜，3%BSA进行封闭，1:100稀释VHSV羊抗阳性血清，37℃孵育1h，用1:5000稀释的兔抗羊HRP-IgG(辣根过氧化物酶标记)37℃孵育1h，最后进行显色鉴定。
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