CN105102608A - 稳定由小球藻属的微藻产生的氧化敏感性代谢物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种稳定微藻生物质的方法，该生物质含有选自下组的氧化敏感性代谢物，该组由以下各项单独地或一起地组成：类胡萝卜素(叶黄素等)、单不饱和和多不饱和脂肪酸(棕榈油酸、油酸、亚油酸等)、叶绿素色素(叶绿素A和B等)和维生素(维生素B9和B12等)，更具体地是类胡萝卜素，所述方法包括在异养条件下使所述生物质发酵。
Description
本发明涉及一种稳定由微藻、更特别地是小球藻属(Chlorella)产生的氧化敏感性代谢物的方法。
最熟知的氧化敏感性代谢物包含，例如，类胡萝卜素。
类胡萝卜素是通常为橙色或黄色且广泛存在于诸多活有机体中的色素。它们具有脂溶性，由此通常易于由有机体同化。
它们属于类萜的化学种类，形成自具有脂肪族或脂环族结构的异戊二烯单元的聚合。通常假设它们遵循类似于脂质的代谢路径。
它们是由所有绿色植物和许多真菌、细菌(包含蓝细菌)和所有微藻合成的。
它们由动物从其食物吸收。
已研究将类胡萝卜素用于预防癌症和其他人类疾病，这是因为其具有突出的抗氧化剂性质。
另外，抗氧化剂性质使得类胡萝卜素对氧化尤其敏感，正如所属领域技术人员熟知一种抗氧化剂物质必须自身可易于氧化以执行此作用。
类胡萝卜素的代表性实例包括α-胡萝卜素、β-胡萝卜素和番茄红素。
番茄红素和β-胡萝卜素通常是以一种游离、未组合形式存在，该形式包含于植物细胞的叶绿体内。
叶黄质是通过添加氧原子(醇、酮、环氧基和其他官能团)从胡萝卜素衍生的黄色分子。它们属于类胡萝卜素种类。
叶黄质富含于某些黄色或橙色水果和蔬菜(例如桃子、芒果、木瓜、李子、南瓜和柑橘)中。
它们还存在于植物细胞的叶绿体或有色体中，尤其是某些黄色、橙色或红色花的花瓣中和藻类(例如褐藻(褐藻纲(Phaeophyceae)))中，它们在其中遮蔽叶绿素。
叶黄质是尤其有助于眼睛健康的抗氧化剂。
叶黄质的实例包括叶黄素、虾青素、角黄素、玉米黄素、隐黄质等。
游离形式的类胡萝卜素允许当其在食品中或以一种食物补充物形式消费时被更好地吸收。
叶黄素是一种具有式4[18-(4-羟基-2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)-3,7,12,16-四甲基十八-1,3,5,7,9,11,13,15,17-九烯-1-基]-3,5,5-三甲基环己-2-烯-1-醇的叶黄质色素，其以高浓度发现于眼睛黄斑和视网膜中心部分中。
其中，它在过滤紫外波长的光以避免伤害眼睛晶状体和黄斑中具有重要作用。
另外，叶黄素具有抗氧化剂性质，这也会保护富含多不饱和脂肪酸的黄斑免受光诱导自由基的伤害。
叶黄素不能由机体产生且因此必须在饮食中供应。
因此，叶黄素越来越多地用于食物补充物中以预防和/或治疗由年龄相关性黄斑变性(或ARMD)、白内障和色素性视网膜炎所致的视力损失。
已提出将缪里尔藻属(Muriellopsissp.)、阿尔默瑞栅藻(Scenedesmusalmeriensis)、祖芬氏小球藻(Chlorellazofingiensis)、耐热性小球藻(Chlorellasorokiniana)和原壳小球藻(Chlorellaprotothecoides)类型的微藻作为潜在叶黄素源。
从调控观点出发，叶黄素是通过溶剂提取从可食用品种的水果和蔬菜以及草、紫花苜蓿与万寿菊(Tageteserecta)获得的。
还可存在不同量的胡萝卜素。
叶黄素可含有天然存在于原始植物材料中的脂肪物质和蜡。
仅允许将下列溶剂用于提取：甲醇、乙醇、丙醇-2、己烷、丙酮、甲基乙基酮和二氧化碳。
叶黄素的某些商业制剂是以具有“5％或10％叶黄素”的形式出售。这些制剂实际上为以5％到15％的比例添加到一种惰性稳定剂中以使其稳定的经纯化叶黄素(酯化或游离)。
因为它对光和氧化敏感，因此必须储存于一个抵抗光和氧的密封容器中，并且储存在凉爽、干燥的地方。尽管有这些防范措施，但并不保证这些化合物的稳定性。
另外，这些储存和处置条件一点也不容易。
叶黄素以高比例存在于某些微藻(例如小球藻)中；因此，优选选择这种微生物源来研发用于有益地获得较大量叶黄素的生产工艺，并且补偿此类分子的脆性固有的损失。
另外，小球藻属的微藻含有独特范围的组分，除上述类胡萝卜素外这些组分还包含所有必需氨基酸、饱和和不饱和脂肪酸、大量维生素、矿物质和痕量元素，以及高浓度的有价值的组分(包含叶绿素)。
微藻还是一种富含蛋白质和其他必需营养素的有吸引力的潜在食物源；在干燥时，其通常代表供应约45％蛋白质、20％脂肪物质、20％碳水化合物、5％纤维和10％矿物质和维生素。
然而，正如类胡萝卜素一样，这些不饱和脂肪酸随着其不饱和度增加而对氧化具有甚至更高的敏感性；因此，多不饱和亚油酸比油酸和棕榈油酸类型的单不饱和酸对氧化更为敏感。
这同样适用于叶绿素色素，其对光氧化的敏感性已为所属领域技术人员所熟知。
因此，已知叶绿素的可溶性盐的抗氧化剂活性比黄嘌呤大超过1000倍，并且比白藜芦醇(存在于某些水果(例如葡萄、桑椹等)中的均二苯乙烯种类的多酚)大20倍。
因此，叶绿素补充物是以液体形式、作为片剂或作为胶囊出售。叶绿素通常以粉末形式包含于绿色食品配方中。
对于维生素来说，水溶性B维生素(例如维生素B9或维生素B12)具有天然脆性(对光、热和氧化敏感)。
维生素A、C和E作为抗氧化剂在活有机体的生物化学中的重要性也已充分记载。
为增加所有这些营养素的抗性，需要保护它们免受“外部侵袭因素”(也就是光和氧)影响。
现在，制备这些化合物的经典途径是通过从其基础生物介质对其进行提取/纯化，且然后将它们包封于密封容器中。
因此，推荐抗氧化添加剂和惰性气氛下的储存条件。然而，除了实际上这些技术实施起来复杂且昂贵以外，它们并非极其有效，并且从营养和健康的角度考虑并非完全令人满意。
一种替代技术方案特别呈现于美国专利2005/0186298中，该方案是由稳定产生类胡萝卜素的微藻生物质中的类胡萝卜素组成。
在此情形下，更特别地是指稳定产生虾青素的雨生红球藻(Haemotococcuspluvialis)的生物质。
然而，这种技术方案推荐：
-产生干燥生物质(通常在光营养条件中实施–在存在光和CO2下生长–但还可在异养中产生–在黑暗中在含有可同化碳的来源存在下发酵)，且然后
-组合这种生物质与至少两种生育酚类型的抗氧化剂的混合物。
因此，本发明待解决的潜在问题在于提出一种替代方法，该方法通过一种简单方法在无需添加化学物质(例如抗氧化剂或稳定剂)的情况下稳定氧化敏感性代谢物，且更特别地是通过微藻所产生的那些、尤其是小球藻属所产生的那些。
为了研发一种比现有技术中已知的那些方法更为有效的方法，申请人进行了自己的研究并且成功改进在异养中产生微藻的技术以实现此目的。
已知以一般方式在异养条件中培养绿藻且更特别地是小球藻以用于制备富含所关注代谢物(包含叶黄素)的生物质。
因此，从20世纪60年代以来已假设，甚至可能获得产量远高于使用更传统地在照明营养缺陷条件中培养相同微藻所获得的色素。
如上所述，这种异养产生途径的选择具体地旨在产生叶黄素的最高可能含量，由此补偿其因氧化降解所致的损失。
在其于2007年于综述世界微生物学与生物技术期刊(WorldJ.Microbiol.Biotechnol.)，第23卷，第1233-1238页中出版的论文中，吴(Wu)等人由此对通过以分批模式和进料-分批模式异养发酵培养来产生叶黄素进行建模，以优化叶黄素的产生。
然而，就申请人所知，并无现有技术文件描述或提出使用在异养条件中产生的生物质本身作为一种稳定所关注代谢物的载体。
恰恰相反，推荐添加抗氧化剂以实现此结果。
因此，本发明涉及一种稳定或储存选自下组的氧化敏感性代谢物的方法，该组由以下各项单独地或组合地组成：类胡萝卜素(例如叶黄素)、单不饱和和多不饱和脂肪酸(例如棕榈油酸、油酸或亚油酸)、叶绿素色素(例如叶绿素A和B)和维生素(例如维生素B9和B12)，更特别地是类胡萝卜素，所述方法包括：
-在异养条件下使微藻生物质发酵，该异养条件包括缺乏营养因子的培养阶段；并且
-储存干燥生物质，在该干燥生物质中这些氧化敏感性代谢物是稳定的。
“稳定代谢物”意指在储存超过一年的一个时段之后保证所关注代谢物的质量，这尤其反映为保护这些代谢物免受氧化降解影响。值得注意的是，储存可在室温和非惰性气氛下实施。该储存步骤持续至少12、18或24个月，优选地在室温下进行。
由小球藻属的微藻产生的“所关注的氧化敏感性代谢物”意指选自下组的化合物，该组由以下各项组成：类胡萝卜素(包含叶黄素)、单不饱和和多不饱和脂肪酸(包含棕榈油酸、油酸和亚油酸)、叶绿素色素(例如叶绿素A和B)和维生素(包含维生素B9和尤其是维生素B12)、更特别地是类胡萝卜素。
“缺乏营养因子”的培养阶段意指如下培养阶段：其中微藻的至少一种营养因子是以不足以允许其正常生长的量供应。应注意，“不足以……的量”不应理解为不供应这种营养因子。那么这个营养缺乏期会减缓(限制)，但并不完全抑制细胞代谢。
例如，培养是在使得以低于微藻在无限制的情况下可实现的消耗速率的速率将这些营养因子中的一种供应到培养基中的条件实施。
这还反映为在培养基中不存在残余营养因子，这是因为微藻随着这种营养因子的供应而将其消耗。
优选地，该营养因子为含碳源，且更特别地为葡萄糖。
因此，本发明尤其适于稳定代谢物(例如类胡萝卜素)，这些代谢物对氧化的极端敏感性为所属领域技术人员所熟知。
在本发明的更特定背景中，类胡萝卜素的稳定由此还保证稳定由微藻产生的其他代谢物，所述代谢物易于通过氧化发生降解。
更特别地是，将氧化敏感性代谢物储存于生物质中所含微藻的细胞中。
根据本发明的方法使得无需添加用于保存氧化敏感性代谢物的外源性抗氧化剂或稳定剂。因此，优选地，该方法并不包括向所述干燥生物质中添加外源性抗氧化剂或稳定剂。
因此，本发明提供一种含有保证含量的所关注代谢物(例如色素)的天然生物质。
在本文中，微藻生物质意指微藻、更特别地是小球藻属，例如耐热性小球藻。在一个极特定实施例中，耐热性小球藻的菌株为菌株UTEX1663-美国得克萨斯大学奥斯汀分校藻类培养物保藏中心(TheCultureCollectionofAlgaeattheUniversityofTexasatAustin–USA)。
更特别地是，待稳定的所关注代谢物(如在本文所给出的实例中)将为总类胡萝卜素，包含叶黄素、叶绿素和维生素。在一个优选实施例中，待稳定的所关注代谢物为叶黄素。
将维生素B12(其并非在异养中培养时由微藻天然产生)添加到培养基中并且由后者同化。
在根据本发明的方法的一个优选实施例中，发酵是在特定异养培养条件中实施，所述条件保证关于稳定由微藻产生的所关注氧化降解敏感性代谢物的最优效率。
因此，该方法包括在异养条件中发酵微藻的生物质，具有使该生物质生长的第一步骤和在缺乏营养因子的情况下进行培养的第二步骤。
因此，生物质的产生包括：
o以分批模式进行发酵的第一步骤，
o以进料-分批模式进行发酵的第二步骤，在含碳源由微藻完全消耗时该第二步骤涉及以低于微藻在无限制的情况下可实现的消耗速率的速率连续供应所述含碳源。
申请人推荐在适当产生生物质的步骤之前实施预培养(通过以分批模式进行发酵)的第一步骤，然后允许产生适当接种生产发酵罐所需量的微藻生物质。
举例来说，如果决定培养小球藻的一种菌株(例如耐热性小球藻)，则在这个预培养的第一步骤之后获得其值介于50与60之间的细胞密度(通常通过600nm下的光学密度来测量)，如下文给出的实例中所展示。
就微藻生物质的产生来说，其因此包括以分批模式进行发酵的第一步骤，其中培养基(例如)与该预培养步骤中所采用的相同。
在含碳源由微藻完全消耗时(此时：培养基中之残余葡萄糖＝0g/l)，以低于由该微藻消耗的速率的速率连续添加所述含碳源。在一个优选实施例中，缺乏的营养因子为葡萄糖。
因此，申请人推翻了一种技术推测，这是因为通常假设，为优化小球藻的叶黄素产生(上文所引用的吴等人的论文)，如果高葡萄糖浓度抑制生长和叶黄素的产生，那么在通过蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)产生叶黄素的情形下，推荐优先选择介于5g/l与24g/l之间的最小葡萄糖浓度。
因此，本发明所推荐的培养条件与那些通常在现有技术中假设用于优化叶黄素产生者不相容。
在耐热性小球藻的情形下，申请人推荐以高于1g/l/h的速率添加葡萄糖，从而将残余葡萄糖维持于0g/l。举例来说，葡萄糖供应速率可介于1g/l/h与5g/l/h之间，更特别地是介于2g/l/h与4g/l/h之间。这个速率是以使得培养基中的残余葡萄糖为0g/l的方式来选择。这个速率可基于在不存在限制下葡萄糖的消耗速率来界定。因此，葡萄糖供应速率可为在不存在限制下葡萄糖的这个消耗速率的90％、80％、70％、60％或50％。
因此，在进料-分批操作开始时将这个速率设定为约2g/l/h，并且在培养结束时其可增加到4g/l/h。
优选地选择缺乏的营养因子的供应速率以降低或减缓细胞生长速率，同时维持以非零速率生长。值得注意的是，提出将生长速率相对于无葡萄糖限制的生长速率降低10％到60％，尤其相对于无葡萄糖限制的生长速率降低10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或55％。优选地，使生长速率降低15％到55％。
举例来说，对于耐热性小球藻的菌株来说，申请人推荐选择使得生长μ至少为0.04h-1、例如介于0.06h-1与0.09h-1之间的葡萄糖供应速率。
因此，营养因子的供应速率应使得其允许细胞生长μ至少为0.04h-1，例如介于0.06h-1与0.09h-1之间。
缺乏营养因子、尤其葡萄糖的培养阶段的持续时间为至少1h、优选地至少10h、更优选地至少20h并且尤其介于30h与60h之间。
在达到生物质的所需量(例如介于30g/l与80g/l之间)时，停止发酵(停止葡萄糖供应)。
出于研究与在光营养条件中产生的一种生物质相比，通过在异养条件中发酵所获得生物质中的类胡萝卜素(叶黄素)、维生素(B9并且更特别地是B12)和总脂肪酸的含量进展的目的，实施稳定性研究(14个月和23个月)。
如将在实例中所展示，在根据本发明的优选方法在异养条件中制备生物质时，由小球藻产生的代谢物的稳定性显著更佳。
因此，举例来说，在一个光生物反应器中获得的生物质在储存14个月之后实际上已损失其叶黄素浓度的80％，而在异养条件中制备的生物质的叶黄素浓度不变。
本发明还涉及在异养条件(包括缺乏营养因子的培养阶段)中产生的微藻生物质用于稳定其氧化敏感性代谢物的用途。优选地，这些微藻是选自小球藻属、更特别地是耐热性小球藻的微藻组。优选地，限制性营养因子为含碳源、特别是葡萄糖。
本发明还涉及一种根据本发明的方法获得的小球藻属、更特别地是耐热性小球藻的微藻的生物质，其特征在于在不向干燥生物质中添加外源性抗氧化剂或稳定剂的情况下，在室温下储存至少12、18或24个月之后，其含有至少1g叶黄素/kg所述生物质。
从下文所给出的实例将更好地理解本发明，这些实例意为阐释性和非限制性的。
实例
实例1.根据本发明的优选实施例在异养条件中培养的耐热性小球藻的生物质的制备
阶段1.预培养
预培养允许再活化菌株和接种生产发酵罐。
预培养是在圆锥形烧瓶中实施，从具有耐热性小球藻的一种菌株(菌株UTEX1663-美国得克萨斯大学奥斯汀分校藻类培养物保藏中心)与600ml培养基的冷冻管开始，该培养基的组成如下表1中所呈现：
表1.
在灭菌之前通过添加8NNaOH来将pH调节到7。
孵育在28℃±1℃下进行，并且以110rpm搅拌(伊孚森莫特顿(INFORSMultitron)搅拌器)72小时。
根据在600nm下的OD测量，在每一圆锥形烧瓶的孵育结束时所获得生物质的最终浓度为约50-60。
阶段2.生产
用于实施发酵的参数呈现于下表2中。
表2.
| 体积 | 在接种之后13.5L–最终为16L到20L |
| 温度 | 28℃-30℃ |
| pH | 6.5-6.6，使用28％w/w NH3 |
| pO2 | >20％(通过搅拌维持) |
| 搅拌 | 300rpm |
| 气流速率 | 15L/min |
步骤1：以分批模式进行发酵
用于分批模式的培养基与用于预培养的培养基(表1)相同，但不含酵母提取物，并且用NH4Cl代替尿素(下表3)。
表3.
步骤2：以进料-分批模式进行发酵
在分批阶段中还以0.47μg/l培养基的速率添加维生素B12，从而将其以约400μg/100g干燥生物质的值储存于生物质中。
在进料-分批阶段中，完整培养基的供应以低于菌株所允许的消耗速率的速率提供葡萄糖的连续进料，从而使培养基中的残余含量为零。
这个葡萄糖供应速率在“进料-分批”开始时为约2g/LAI/h(AI＝在接种之后)，并且在培养结束时其可增加到4g/LAI/h。这个步骤期间的生长μ介于0.07h-1与0.08h-1之间。
进料溶液中的葡萄糖浓度范围可从400g/L到800g/L。
连续、单独或与葡萄糖混合来供应盐。
第一次添加必须在该批次结束后尽快进行，但这些盐不能只供应一次，以避免抑制菌株生长。
下表4给出每100g葡萄糖的盐要求：
表4.
在细胞密度达到80g/l时，停止葡萄糖进料。从而停止培养。
将生物质雾化为干物质>95％。
实例2.由耐热性小球藻产生的氧化敏感性代谢物的室温稳定性研究
出于研究从在异养(通过发酵)或在自养(光生物反应器)中所获得生物质提取的类胡萝卜素、叶黄素、维生素B9并且更特别地是维生素B12的含量进展的目的，在室温下实施稳定性研究持续14个月和23个月的一个时段。
此研究显示小球藻培养方法对这些氧化敏感性代谢物的稳定性的效应。
比较以下两种生物质：
-第一生物质是根据实例1的条件产生的，
-第二生物质是在一个光生物反应器(例如PBR4000)中于常规条件中产生(普尔兹(Pulz)等人，2000，雷姆H.-J.(RehmH.-J.)、里德G.(ReedG.)(编辑)，生物技术(Biotechnology)，第10卷，第二版，韦因海姆(Weinheim)，105-136)。
对100g在这两种操作条件下产生的DM(干物质)大于95％的生物质执行测量。
总萝卜素和叶黄素的含量进展(通过HPLC执行测定)
在异养下获得的生物质中，总类胡萝卜素的稳定性较高。
针对叶黄素观察到相同趋势；经发酵的生物质为叶黄素提供抵抗降解的更佳保护。
维生素的含量进展(根据方法AOAC952.20–维生素B12执行分析)
异养下由培养基供应的维生素B12由耐热性小球藻的生物质充分同化；在此情形下，其含量为约363μg/100g干燥生物质。
nd表示未测定。
在这两种情形的研究中始终观察到维生素B12的稳定性。对于在异养下产生的生物质，这些值在约300μg/100g附近变化，并且对于在自养下产生的生物质，这些值在约105μg/1400g附近变化。
叶绿素的含量进展(通过分光光度法测定)
叶绿素B的含量在两种操作条件中保持稳定，但叶绿素A的含量并非如此，而是在通过发酵产生的生物质中的稳定性显著更佳。
总而言之，由微藻产生的代谢物在通过发酵产生的生物质中更稳定(这反映了它们针对其所敏感的氧化降解的更佳保护)。
这个现象对于叶黄素含量来说更为明显，叶黄素含量在经发酵的生物质中显著更稳定(而在自养下产生的生物质中降解80％以上)。
Claims (13)
1.一种稳定或储存选自下组的氧化敏感性代谢物的方法，该组由以下各项单独地或组合地组成：诸如叶黄素等类胡萝卜素、诸如棕榈油酸、油酸或亚油酸等单不饱和和多不饱和脂肪酸、诸如叶绿素A和B等叶绿素色素、以及诸如维生素B9和B12等维生素，更特别地是类胡萝卜素，所述方法包括：
-在异养条件下使微藻生物质发酵，该异养条件包括缺乏营养因子的培养阶段；并且
-储存干燥生物质，在该干燥生物质中这些氧化敏感性代谢物是稳定的。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于这些微藻是选自小球藻(Chlorella)属、更特别地是耐热性小球藻(Chlorellasorokiniana)的微藻组。
3.根据权利要求1和2中任一项所述的方法，其特征在于该方法不包括向所述干燥生物质中添加外源性抗氧化剂或稳定剂。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其特征在于该缺乏的营养因子为含碳源。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其特征在于在异养条件下产生该微藻生物质的方法包括：
о以分批模式进行发酵的第一步骤，
о以进料-分批模式进行发酵的第二步骤，在该含碳源由微藻完全消耗时该第二步骤涉及以比由这些微藻消耗所述含碳源的速率低的速率连续供应所述含碳源。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的方法，其特征在于该缺乏的营养因子为葡萄糖，并且特征在于以高于1g/l/h的速率、优选地以介于1g/l/h与5g/l/h之间、更特别地介于2g/l/h与4g/l/h之间的速率将该缺乏的营养因子供应到该培养物中。
7.根据权利要求1到6中任一项所述的方法，其特征在于该缺乏性培养阶段的持续时间为至少1h、优选地至少10h、更优选地至少20h、尤其介于30h与60h之间。
8.根据权利要求1到7中任一项所述的方法，其特征在于该储存步骤在室温下持续至少12、18或24个月。
9.根据权利要求1到8中任一项所述的方法，其特征在于该氧化敏感性代谢物为叶黄素。
10.一种在异养条件下产生的微藻生物质用于稳定其氧化敏感性代谢物的用途，该异养条件包括缺乏营养因子的培养阶段。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于这些微藻是选自小球藻属、更特别地是耐热性小球藻的微藻组。
12.根据权利要求10或11所述的用途，其中该缺乏的营养因子为含碳源。
13.一种通过如权利要求1到9中任一项所述的方法获得的小球藻属、更特别地是耐热性小球藻的微藻生物质，其特征在于在不向所述干燥生物质中添加外源性抗氧化剂或稳定剂的情况下，在室温下储存至少12、18或24个月之后，其含有至少1g叶黄素/kg生物质。
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Patent Citations (1)
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Non-Patent Citations (5)
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