CN105092552A - 一种小分子标记探针及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物的检测和成像领域，具体的说是一种小分子标记探针及其应用。荧光探针的识别单元为糖类活性功能的小分子标记。利用所述小分子标记探针使其与微生物细胞特异性的结合，通过识别小分子标记转运通道进行运转和吸收，进而能够对微生物特异性的分析和成像。相对于传统的酶联免疫反应吸附的测量或基于抗体的识别技术，利用这类糖类活性小分子信号系统来快速检测和分析生物分子具有显著的特异性，同时准确性高。利用糖类活性功能小分子标记荧光信号系统来快速检测和分析微生物，具有稳定性好、灵敏度高，不容易失活，价格便宜等优势；同时，这类糖类活性功能小分子还可以在哺乳动物体内进行活体成像。
Description
技术领域
本发明涉及微生物的检测和成像领域，具体的说是一种小分子标记探针及其应用。
背景技术
在环境安全检测和人体健康的监控中，许多生物靶点分子的含量非常低。很多生物信号分子、有害微生物或肿瘤细胞在初期浓度非常低，需要对靶点物质进行信号放大才可以检测分析。目前，研究者们已经发现了集中几种信号放大的技术来检测低丰度靶点，包括银增加强反应、酪氨酸信号放大、酶金属矿化和滚环放大报告系统。银增强反应基于纳米金催化沉淀银，从而来检测核酸、蛋白质和微生物等有害物质(Wan,Y.,Wang,Y.,Wu,J.,Zhang,D.,2011b.AnalyticalChemistry83(3),648-653；Taton,T.A.,Mirkin,C.A.,Letsinger,R.L.,2000.Science289(5485),1757-1760.)。相对银增强的技术来说，替代的方案用过氧化物酶来催化银的沉淀，这种方法叫酶矿化技术(R.,Powell,R.D.,Hainfeld,J.F.,Fritzsche,W.,2005.NanoLetters5(7),1475-1482)。最近出现一种超灵敏的技术，结合氢化酶标记的酶联免疫反应来控制纳米金生成过程，产生肉眼可见的信号(delaRica,R.,Stevens,M.M.,2012.NatureNanotechnologydoi:10.1038/nnano.2012.186)，来分析生物靶点物质。酪氨酸信号放大系统结合生物沉淀和荧光标记来增强标准免疫反应的灵敏度(Clutter,M.R.,Heffner,G.C.,Krutzik,P.O.,Sachen,K.L.,Nolan,G.P.,2010.CytometryPartA77A(11),1020-1031)。滚环放大技术是一种恒温核酸扩增方法，在RCA反应中，DNA目标链可沿环形探针顶替扩增，实现高灵敏度的检测；同时环形探针的链接成环对DNA单碱基错配有很高的特异性，适合单核苷酸突变的分析检测。
发明内容
本发明目的在于提供一种小分子标记探针及其应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种小分子标记探针，荧光探针的识别单元为糖类活性功能的小分子标记。
所述具有糖类活性功能的小分子标记为棉籽糖、水苏糖、海藻糖或花蕊糖。
将所述小分子标记与量子点、磁性颗粒、荧光素或纳米金交联即得探针。
所述量子点为核壳结构量子点(CdSe-Au核壳结构)、稀土元素掺杂的量子点或羧基修饰的量子点。
所述荧光素为罗丹明类、细胞色素c类、AlexaFluor系列染料或异氰酸荧光素类。
磁性颗粒为通过磁性弛豫信号来检测磁场的信号，而非利用磁性纳米颗粒的磁分离信号所述的信号探针对于微生物检测具有选择性成像、检测功能。微生物的生理活动能够显著的增强信号，其信号的放大是通过微生物吸收利用糖类小分子探针而累积的。
一种小分子标记探针的应用，利用所述小分子标记探针使其与微生物细胞特异性的结合，通过识别小分子标记转运通道进行运转和吸收，进而能够对微生物特异性的分析和成像。
本发明所具有的优点：
本发明利用棉籽糖类活性小分子标记的荧光信号系统来快速检测和分析微生物,比如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、爱德华迟缓菌、费氏弧菌、炭疽杆菌等，用其检测能够控制微生物浓度和显著的信号放大成像。相对于传统的酶联免疫反应吸附的测量，利用棉籽糖类信号标记系统来快速检测和分析微生物具有显著的特异性，同时准确性高。利用棉籽糖类活性功能小分子标记信号系统来快速检测和分析生物分子，具有稳定性好、灵敏度高，不容易失活，价格便宜等优势。
本发明基于棉籽糖的荧光探针对微生物的成像比其他的方法高两个数量级，其方法检测微生物是通过微生物主动吸收荧光探针的特异性机制，微生物细胞特异性的棉籽糖转运通道能够快速主动的转运吸收荧光探针。荧光探针能够选择性积累，其浓度能够达到mmol浓度，是哺乳动物细胞的10倍。
附图说明
图1为本发明实施例提供的棉籽糖荧光探针的合成路线图。
图2为本发明实施例提供的六种微生物对棉籽糖荧光探针的利用情况比较图，其中(A)、细菌和细胞的失活情况对于棉籽糖荧光探针的情况对比(B)、大肠功能对于棉籽糖的吸收动力学情况(C)、葡萄糖和棉籽糖对于棉籽糖荧光探针的竞争结合实验(D)。
图3为本发明实施例提供的大肠杆菌和爱德华迟缓细菌不同微生物的检测状态图。
图4(a)和(c)分别为迟缓爱德华菌破碎前后的照片；(b)和(d)分别为大肠杆菌破碎前后的照片。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步说明。
实施例1：
棉籽糖荧光聚合物：
2,7-二溴芴(2.7-dibromofluorene1.62g)、氨基丙基溴(tert-butyl-3-bromopropanoate2.30g)、NaOH(40％，12mL)、Bu4NBr(0.16g)和甲苯(25mL)于85℃反应12h。分液萃取保留有机相，用水清洗，并用无水MgSO4干燥，旋转蒸发有机溶剂，固体物质用硅胶柱色谱纯化(CH2Cl2)。
2,7-二溴-9,9-二甲基芴，单体A(0.4mM,0.232g)；4,7-二溴-[1,2,5]噻二唑并[3,4-C]吡啶，单体B(0.6mM,0.176g)；9,9-二辛基芴-2,7-二硼酸二(1,3-丙二醇)酯，单体C(1mM,0.56g)分别溶解在20mL甲苯，然后再加入Bu4NBr(12.5mg)和Na2CO3(2M,12mL),溶液体系脱气/氩气连续四次，加入Pd(PPh3)4(40mg)，溶液体系脱气/氩气连续四次，反应物于90度搅拌40h，再加入苯硼酸(100mg溶于1mlTHF)反应2h，再加入1ml溴苯反应3h，再加入100ml甲醇沉淀有机物，然后用甲醇、水和丙酮清洗。粗产物溶于15mLCH2Cl2,用0.2微米微孔滤膜过滤，然后用100mL甲醇沉淀，再在100mL丙酮中搅拌2小时，过滤，真空中干燥，得到荧光聚合物。
上述制备得到的聚合物(100mg)溶解在20mLCH2Cl2,再加入1.5ml三氟乙酸，避光反应12h，用10％NaOH(30ml)清洗三次，再用小量醋酸酸化，萃取分液保留有机相，用水清洗有机相并分离，旋转蒸发浓缩到5mL,加入50ml甲醇沉淀，过滤用丙酮清洗。用超声沉淀法制备聚合物量子点：0.2ml固体聚合物溶解在四氢呋喃中PFBT(1mgmL-1)注射到10ml水中，超声处理10min，在氩气条件下，加热到90℃挥发四氢呋喃。用0.2μm的滤膜过滤。即可得到聚合物量子点。
再用EDC交联剂制备抗生素功能化的半导体量子点：具体的说，0.1ml聚乙二醇(5％)、0.1mlHEPES缓冲液(1molL-1)加入到5ml的Pdots中。再加入0.5ml氨基化的棉籽糖(5mgmL-1)，反应体系搅拌混匀。再加入0.1ml新鲜配置的EDC(5mgmL-1)，反应2h，用透析膜透析24小时，获得棉籽糖铰链的荧光聚合物。
大肠杆菌对于棉籽糖荧光聚合物的吸收利用情况
大肠杆菌菌斑重悬浮到30ml的PBS缓冲液中，紫外分光光度计(波长为600nm)测量其OD值为0.5。而后将大肠杆菌悬浮液转移到10ml离心管中，每个离心管加入5ml的菌悬液，然后加入100μL棉籽糖荧光聚合物(1mM)，最终荧光探针的浓度为20μM。
大肠杆菌在30度条件下，摇床的转速为250rpm，培养1小时。同时，取50μL菌液测量微生物浓度上述培育1小时后的细菌然后在8000rp离心10min，再用5mlPBS分别清洗三次。清洗过得细菌菌斑在冰浴条件下，超声16分钟。超声的输出功率为200瓦，100个循环操作过程。微生物被破碎之后，用离心机8000rp离心10min。上清液的荧光强度用日立荧光光谱仪测量。棉籽糖荧光探针在上清液中的浓度通过其标准曲线测量。
用叠氮化钠处理大肠杆菌(Escherichiacoli，EC)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)。5mlLB培养基中的微生物的OD600＝0.5，加入50μL的叠氮化钠(1M),在摇床中培育1小时，其用PBS清洗三次，失活细菌用于荧光探针的的对照控制实验。
由图3展示的可见从10cfuml-1到108cfuml-1用棉籽糖荧光探针探针的信号强度变化，荧光光谱的分析状况。
实施例2：金黄色葡萄球菌对于棉籽糖荧光探针的吸收利用情况棉籽糖标记的荧光素探针
微生物荧光分析探针基于棉籽糖与FITC荧光素分子的交联(图1)，棉籽糖荧光探针的合成过程，包括氨化和铰链。具体上讲，棉籽糖(0.3g，0.5mmol)溶解在7.5ml超纯水中，加入半乳糖氧化酶(5.2U)，辣根过氧化物歧化酶(45U)以及氢化酶(11150U)，室温下搅拌12小时，热水浴中沸腾5min，使酶失活。高速离心(10000rpm)除去失活的酶，冷冻干燥获得氧化的棉籽糖。
氧化棉籽糖(0.2g，0.35mmol)，溶解在10ml水中，加入己二胺(0.11g，1mmol)，再用冰乙酸把溶液Ph调整到5，反应4小时。加入氰基硼氢化钠(0.06g，1mmol)，反应1小时，旋转去除水。用葡聚糖凝胶LH-20纯化分离，获得氨基修饰的棉籽糖。
氨基修饰的棉籽糖(100mg，0.15mmol)溶解在3ml的碳酸缓冲液(pH9.0)，加入FITC(60mg，0.15mmol)，室温下避光反应，搅拌反应4小时，用TLC分离，获得棉籽糖标记的荧光素探针。
金黄色葡萄球菌对于棉籽糖荧光探针的吸收利用情况
金黄色葡萄球菌菌斑重悬浮到30ml的PBS缓冲液中，紫外分光光度计(波长为600nm)测量其OD值为0.5。而后将金黄色葡萄球菌悬浮液转移到10ml离心管中，每个离心管加入5ml的菌悬液，然后加入100μL棉籽糖荧光探针(1mM)，最终荧光探针的浓度为20μM。
金黄色葡萄球菌在30度条件下，摇床的转速为250rpm，培养1小时。同时，取50μL菌液测量微生物浓度上述培育1小时后的细菌然后在8000rp离心10min，再用5mlPBS分别清洗三次。清洗过得细菌菌斑在冰浴条件下，超声16分钟。超声的输出功率为200瓦，100个循环操作过程。微生物被破碎之后，用离心机8000rp离心10min。上清液的荧光强度用日立荧光光谱仪测量。棉籽糖荧光探针在上清液中的浓度通过其标准曲线测量。
用叠氮化钠处理大肠杆菌(Escherichiacoli，EC)。5mlLB培养基中的微生物的OD600＝0.5，加入50μL的叠氮化钠(1M),在摇床中培育1小时，其用PBS清洗三次，失活细菌用于荧光探针的的对照控制实验。
图2展示了用大肠杆菌(Escherichiacoli，EC)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)、费氏弧菌(Vibriofischeri，VF)、迟缓爱德华菌(Edwardsiellatarda，ET)、硫酸盐还原菌(Sulfate-reducingbacteria，SRB)研究其对棉籽糖荧光探针的吸收利用情况，展示棉籽糖荧光聚合物检测铜绿假单胞菌(1.0×105cfumL-1)存在很低的荧光强度变化，而检测金黄色葡萄球菌(1.0×105cfumL-1)能导致其荧光强度呈现两倍的增强。
实施例3：爱德华迟缓菌对于棉籽糖荧光探针的吸收利用情况
爱德华迟缓菌菌斑重悬浮到30ml的PBS缓冲液中，紫外分光光度计(波长为600nm)测量其OD值为0.5。而后将爱德华迟缓菌悬浮液转移到10ml离心管中，每个离心管加入5ml的菌悬液，然后加入100μL上述获得棉籽糖荧光聚合物(1mM)，最终荧光探针的浓度为20μM。
爱德华迟缓菌在30度条件下，摇床的转速为250rpm，培养1小时。同时，取50μL菌液测量微生物浓度上述培育1小时后的细菌然后在8000rp离心10min，再用5mlPBS分别清洗三次。清洗过得细菌菌斑在冰浴条件下，超声16分钟。超声的输出功率为200瓦，100个循环操作过程。微生物被破碎之后，用离心机8000rp离心10min。上清液的荧光强度用日立荧光光谱仪测量。棉籽糖荧光探针在上清液中的浓度通过其标准曲线测量。
用叠氮化钠处理大肠杆菌(Escherichiacoli，EC)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)。5mlLB培养基中的微生物的OD600＝0.5，加入50μL的叠氮化钠(1M),在摇床中培育1小时，其用PBS清洗三次，失活细菌用于荧光探针的的对照控制实验。
实施例4：铜绿假单胞菌对于棉籽糖荧光探针的吸收利用情况
铜绿假单胞菌菌斑重悬浮到30ml的PBS缓冲液中，紫外分光光度计(波长为600nm)测量其OD值为0.5。而后将铜绿假单胞菌悬浮液转移到10ml离心管中，每个离心管加入5ml的菌悬液，然后加入100μL棉籽糖荧光探针(1mM)，最终荧光探针的浓度为20μM。
铜绿假单胞菌在30度条件下，摇床的转速为250rpm，培养1小时。同时，取50μL菌液测量微生物浓度上述培育1小时后的细菌然后在8000rp离心10min，再用5mlPBS分别清洗三次。清洗过得细菌菌斑在冰浴条件下，超声16分钟。超声的输出功率为200瓦，100个循环操作过程。微生物被破碎之后，用离心机8000rp离心10min。上清液的荧光强度用日立荧光光谱仪测量。棉籽糖荧光探针在上清液中的浓度通过其标准曲线测量。
用叠氮化钠处理大肠杆菌(Escherichiacoli，EC)。5mlLB培养基中的微生物的OD600＝0.5，加入50μL的叠氮化钠(1M),在摇床中培育1小时，其用PBS清洗三次，失活细菌用于荧光探针的的对照控制实验。
实施例5：费氏弧菌对于棉籽糖荧光探针的吸收利用情况
费氏弧菌菌斑重悬浮到30ml的PBS缓冲液中，紫外分光光度计(波长为600nm)测量其OD值为0.5。而后将费氏弧菌悬浮液转移到10ml离心管中，每个离心管加入5ml的菌悬液，然后加入100μL棉籽糖荧光探针(1mM)，最终荧光探针的浓度为20μM。
费氏弧菌在30度条件下，摇床的转速为250rpm，培养1小时。同时，取50μL菌液测量微生物浓度上述培育1小时后的细菌然后在8000rp离心10min，再用5mlPBS分别清洗三次。清洗过得细菌菌斑在冰浴条件下，超声16分钟。超声的输出功率为200瓦，100个循环操作过程。微生物被破碎之后，用离心机8000rp离心10min。上清液的荧光强度用日立荧光光谱仪测量。棉籽糖荧光探针在上清液中的浓度通过其标准曲线测量。
用叠氮化钠处理大肠杆菌(Escherichiacoli，EC)。5mlLB培养基中的微生物的OD600＝0.5，加入50μL的叠氮化钠(1M),在摇床中培育1小时，其用PBS清洗三次，失活细菌用于荧光探针的的对照控制实验。
实施例6：硫酸盐还原菌对于棉籽糖荧光探针的吸收利用情况
硫酸盐还原菌菌斑重悬浮到30ml的PBS缓冲液中，紫外分光光度计(波长为600nm)测量其OD值为0.5。而后将硫酸盐还原菌悬浮液转移到10ml离心管中，每个离心管加入5ml的菌悬液，然后加入100μL棉籽糖荧光探针(1mM)，最终荧光探针的浓度为20μM。
硫酸盐还原菌在30度条件下，摇床的转速为250rpm，培养1小时。同时，取50μL菌液测量微生物浓度上述培育1小时后的细菌然后在8000rp离心10min，再用5mlPBS分别清洗三次。清洗过得细菌菌斑在冰浴条件下，超声16分钟。超声的输出功率为200瓦，100个循环操作过程。微生物被破碎之后，用离心机8000rp离心10min。上清液的荧光强度用日立荧光光谱仪测量。棉籽糖荧光探针在上清液中的浓度通过其标准曲线测量。
用叠氮化钠处理大肠杆菌(Escherichiacoli，EC)。5mlLB培养基中的微生物的OD600＝0.5，加入50μL的叠氮化钠(1M),在摇床中培育1小时，其用PBS清洗三次，失活细菌用于荧光探针的的对照控制实验。
实施例7：水苏糖标记荧光探针对于大肠杆菌检测
大肠杆菌菌斑重悬浮到30ml的PBS缓冲液中，紫外分光光度计(波长为600nm)测量其OD值为0.5。而后将大肠杆菌悬浮液转移到10ml离心管中，每个离心管加入5ml的菌悬液，然后加入100μL水苏糖标记荧光探针(水苏糖标记荧光探针合成方式与上述棉籽糖荧光探针一样)(1mM)，最终荧光探针的浓度为20μM。
大肠杆菌在30度条件下，摇床的转速为250rpm，培养1小时。同时，取50μL菌液测量微生物浓度上述培育1小时后的细菌然后在8000rp离心10min，再用5mlPBS分别清洗三次。清洗过得细菌菌斑在冰浴条件下，超声16分钟。超声的输出功率为200瓦，100个循环操作过程。微生物被破碎之后，用离心机8000rp离心10min。上清液的荧光强度用日立荧光光谱仪测量。水苏糖荧光探针在上清液中的浓度通过其标准曲线测量。
用叠氮化钠处理大肠杆菌(Escherichiacoli，EC)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)。5mlLB培养基中的微生物的OD600＝0.5，加入50μL的叠氮化钠(1M),在摇床中培育1小时，其用PBS清洗三次，失活细菌用于荧光探针的的对照控制实验。
实施例8.海藻糖标记荧光探针对于大肠杆菌检测
大肠杆菌菌斑重悬浮到30ml的PBS缓冲液中，紫外分光光度计(波长为600nm)测量其OD值为0.5。而后将大肠杆菌悬浮液转移到10ml离心管中，每个离心管加入5ml的菌悬液，然后加入100μL海藻糖标记荧光探针(海藻糖标记荧光探针合成方式与上述棉籽糖荧光探针一样)(1mM)，最终荧光探针的浓度为20μM。
大肠杆菌在30度条件下，摇床的转速为250rpm，培养1小时。同时，取50μL菌液测量微生物浓度上述培育1小时后的细菌然后在8000rp离心10min，再用5mlPBS分别清洗三次。清洗过得细菌菌斑在冰浴条件下，超声16分钟。超声的输出功率为200瓦，100个循环操作过程。微生物被破碎之后，用离心机8000rp离心10min。上清液的荧光强度用日立荧光光谱仪测量。海藻糖荧光探针在上清液中的浓度通过其标准曲线测量。
用叠氮化钠处理大肠杆菌(Escherichiacoli，EC)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)。5mlLB培养基中的微生物的OD600＝0.5，加入50μL的叠氮化钠(1M),在摇床中培育1小时，其用PBS清洗三次，失活细菌用于荧光探针的的对照控制实验。
实施例9.海藻糖标记磁性纳米颗粒探针对于大肠杆菌检测
海藻糖标记磁性纳米颗粒探针合成：0.1g氨基铰链的海藻糖与0.1g羧基修饰的磁性颗粒混合，然后加入N-羟基琥珀酰亚胺(40mM)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(10mM),反应两个小时，用磁铁分离清洗三次，既可以得到海藻糖标记磁性纳米颗粒探针。
大肠杆菌菌斑重悬浮到30ml的PBS缓冲液中，紫外分光光度计(波长为600nm)测量其OD值为0.5。而后将大肠杆菌悬浮液转移到10ml离心管中，每个离心管加入5ml的菌悬液，然后加入100μL海藻糖标记磁性纳米颗粒探针(1mM)，最终荧光探针的浓度为20μM。
大肠杆菌在30度条件下，摇床的转速为250rpm，培养1小时。同时，取50μL菌液测量微生物浓度上述培育1小时后的细菌然后在8000rp离心10min，再用5mlPBS分别清洗三次。清洗过得细菌菌斑在冰浴条件下，超声16分钟。超声的输出功率为200瓦，100个循环操作过程。微生物被破碎之后，用离心机8000rp离心10min。上清液的荧光强度用日立荧光光谱仪测量。海藻糖标记磁性纳米颗粒探针在上清液中的浓度通过其标准曲线测量。
用叠氮化钠处理大肠杆菌(Escherichiacoli，EC)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)。5mlLB培养基中的微生物的OD600＝0.5，加入50μL的叠氮化钠(1M),在摇床中培育1小时，其用PBS清洗三次，失活细菌用于荧光探针的的对照控制实验。
Claims (6)
1.一种小分子标记探针，其特征在于：荧光探针的识别单元为糖类活性功能的小分子标记。
2.按权利要求1所述的小分子标记探针，其特征在于：所述具有糖类活性功能的小分子标记为棉籽糖、水苏糖、海藻糖或花蕊糖。
3.按权利要求1所述的小分子标记探针，其特征在于：将所述小分子标记与量子点、磁性颗粒、荧光素或纳米金交联即得探针。
4.按权利要求3所述的小分子标记探针，其特征在于：所述量子点为核壳结构量子点(CdSe-Au核壳结构)、稀土元素掺杂的量子点或羧基修饰的量子点。
5.按权利要求3所述的小分子标记探针，其特征在于：所述荧光素为罗丹明类、细胞色素c类、AlexaFluor系列染料或异氰酸荧光素类。
6.一种权利要求1所述的小分子标记探针的应用，其特征在于：利用所述小分子标记探针使其与微生物细胞特异性的结合，通过识别小分子标记转运通道进行运转和吸收，进而能够对微生物特异性的分析和成像。
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2015
- 2015-08-24 CN CN201510522356.6A patent/CN105092552B/zh active Active
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Also Published As
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