CN105087595A - 人NF-kB的核酸适配体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人NF-kB的核酸适配体及其应用，其序列如SEQ？ID？NO：1所示。通过设计NF-kB的核酸适配体，能够实现对NF-kB的抑制，进而能够有效抑制肿瘤细胞增殖。

Description

人NF-kB的核酸适配体及其应用

技术领域

本申请涉及一种人NF-kB的核酸适配体及其应用。

背景技术

因子kB(NF-kB)是一种广泛存在于体内多种细胞的核转录因子，同时也是一种具有多向性调节作用的蛋白质分子。目前已发现NF-kB调节着100多种靶基因的表达，包括细胞因子、趋化因子、生长因子、黏附分子、某些急性期反应蛋白以及参与免疫识别的受体和抗原递呈的蛋白质等。这些分子大多数在免疫调控、炎症、应激反应及细胞凋亡中起重要作用。NF-kB的过度活化会激活、增强机体的非特异及特异性免疫反应，造成组织损伤和器官功能紊乱。NF-kB还可上调CyclinD1(CCNDI)等致癌基因的表达，促进细胞生长。NF-kB激活对肿瘤的增殖、转移和侵袭具有明显的促进作用。因此，对肿瘤细胞内NF-kB信号强度的计算和调控，将有利于实现对细胞恶性表型的检测和逆转。

核酸适配体(aptamer)由约50bp寡核苷酸组成的DNA或RNA序列，一般经过体外系统进化技术筛选而得到。核酸适配体能形成特定的三维空间结构与靶分子特异性得相结合。Aptamer的靶分子广泛，可以是蛋白质、核酸、短肽、氨基酸、化合物、代谢小分子等，甚至可以是细胞。核酸适配体已在高灵敏分析、疾病诊断和癌症治疗等方面显示出重要的应用前景。有研究提示，如果将核酸适配体的序列插入至一些目的基因的5’非翻译区内，当与配体相结合时，可在局部形成非常稳定的二级结构，并抑制核糖体小亚基的结合或滑动，从而可以有效抑制目的基因的翻译起始和表达。

发明内容

本发明提供一种新的人NF-kB的核酸适配体及其应用。

本发明提供一种人NF-kB的核酸适配体，其序列如SEQIDNO：1所示。

所述的核酸适配体作为NF-kB抑制剂的应用。

所述的核酸适配体在制备抑制肿瘤细胞增殖的产品中的应用。

所述肿瘤包括膀胱癌、前列腺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、子宫内膜癌和黑色素瘤。所述肿瘤细胞为膀胱癌细胞系T24和UM-UC-3。

所述的核酸适配体在调控肿瘤细胞中NF-kB信号强度的应用。

检测时，可以将核酸适配体表达载体转染入膀胱癌细胞系T24。

本发明的有益效果是：通过设计NF-kB的核酸适配体，能够实现对NF-kB的抑制，进而能够有效抑制肿瘤细胞增殖。

附图说明

图1是本实施方式人NF-kB的核酸适配体的构建示意图；

图2是显示NF-kB监控系统能够产生对细胞内源性NF-kB信号的有效应答的检测图，其中，**表示与对照组相比，p值小于0.01，A指阴性对照，B指NF-kB监控系统，C指阴性对照+NF-kBsiRNA，D指NF-kB监控系统+NF-kBsiRNA，E指NF-kB监控系统+siRNA对照；

图3是显示NF-kB监控系统能够有效降低NF-kB下游靶基因的表达的检测图，其中，**表示与对照组相比，p值小于0.01，黑色长条指阴性对照，白色长条指NF-kB监控系统；

图4是显示NF-kB监控系统能够有效抑制了膀胱癌细胞系T24的增殖的检测图，其中，**表示与对照组相比，p值小于0.01，上面的线条表示阴性对照，下面的线条表示实验组(NF-kB监控系统)；

图5是显示NF-kB监控系统能够有效诱导了膀胱癌细胞系T24的凋亡的检测图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。

技术与方法

1.细胞培养

膀胱癌细胞系T24和UM-UC-3购自AmericanTypeCultureCollection(ATCC,Manassas,USA)，细胞培养液由90％的DMEM(Invitrogen,CA)，10％的胎牛血清(Invitrogen)，1％-2％的谷氨酰胺和0.5％-1％的双抗配成。

2.NF-kB监控系统的构建

体外化学合成NF-kB的核酸适配体序列两个拷贝。中间以连接序列分开。引入酶切位点StuI和NheI于该元件的上下游，同时用酶切psiCHECKTM-2双荧光素酶表达载体。经T4DNA连接酶将二者连接6小时，连接产物转化入感受态细胞，摇菌、涂板、挑选阳性克隆，并提纯质粒。

3.细胞转染

转染前一天，4-5×10⁴个细胞接种在24孔板上，加入0.5ml培养基，放在37℃、5％CO₂培养箱内。生长24小时后，细胞汇合度达到70％，在50ul的无血清培养基内加入1ug重组质粒，柔和混匀。在50ul无血清培养基内加入1ulLipofectamin2000(Invitrogen,CA)试剂，轻轻混匀，室温放置5min。将稀释好的质粒和Lipo2000轻柔混匀，室温放置20分钟，以便形成质粒/lipofectamin复合物。将质粒/lipofectamin混合物加入24孔板内，轻柔摇晃24孔板。放入培养箱内，4-6小时后更换培养基，48小时后收集细胞，准备下一步实验。

4.总RNA提取

使用美国nvitrogen公司的Trizol试剂提取总RNA。使用紫外分光光度计和2％琼脂糖凝胶检测提取的总RNA质量。定量后于-80℃储存备用。

5.实时定量PCR

使用美国Fermentas的RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit把上述总RNA逆转录为cDNA。根据说明书步骤如下：取总RNA2ug，加入oligo(dT)18(0.5ug/ul)，加DEPC处理的水至12ul。65℃反应5分钟，取出后立即置冰上。加5×reactionbuffer4ul，RNA酶抑制剂(20u/ul)1ul，dNTP(10mM)2ul，混匀，瞬时离心。37℃反应5分钟，取出后立即置冰上。加MMLV逆转录酶(200u/ul)1ul至20ul。42℃反应60分钟。85℃10分钟终止反应后，立即置于冰上冷却，逆转录所得的cDNA储存于-80℃。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。实时定量PCR引物序列如下:HIF-1α正向引物(SEQIDNO：3):5′-CCATTAGAAAGCAGTTCCGC-3′,反向引物(SEQIDNO：4):5′-TGGGTAGGAGATGGAGATGC-3′；VEGF正向引物(SEQIDNO：5):5′-AGCCTTGCCGCCTTGCTGCTCTA-3′,反向引物(SEQIDNO：6):5′-GTGCTGGCCTTGGTGAGG-3′；Bcl-XL正向引物(SEQIDNO：7):5′-GGTCGCATTGTGGCCTTCTT-3′,反向引物(SEQIDNO：8):5′-GCAGGTCTGCTGACCTCACT-3′；GAPDH正向引物(SEQIDNO：9):5′-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3′,反向引物(SEQIDNO：10):5′-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3′.GAPDH用作内参。PCR总反应体系为20μl,包括10μl2×All-in-One^TMqPCRMix(GeneCopoieaInc,美国),0.4μl正向引物,0.4μl反向引物,1μlFirst-StrandcDNA,50×ROXReferenceDye0.4μl和7.8μl双蒸水。使用ABIPRISM7000FluorescentQuantitativePCRSystem(AppliedBiosystems,美国)进行定量PCR反应。PCR反应设置3个重复。PCR扩增参数如下:先95℃预变性10min；之后40个循环,其中每个循环包括95℃变性15s,55℃退火20s,70℃延伸30s。使用取3个重复的中值计算相对mRNA表达量(ΔCt＝Ct_medianmRNA﹣Ct_{medianmRNAGAPDH})。表达倍数用2^-ΔΔCt法。

6.荧光素酶活性检测

用Promega公司的Dual-LuciferaseReporterAssaySystem检测样品Luciferase活性。按上述转染方法转染细胞。转染48h后，吸去旧培养基，用PBS清洗两次，每孔细胞加入100μl的PassiveLysisBuffer(PLB)，室温轻微振摇15min。收集细胞裂解液于1.5mlEppendorf管中；向Eppendorf管中加入100μl的LuciferaseAssayReagentII(LARII)；将细胞裂解液12,000g离心1min，取上清50μl加入1.5mlEppendorf管中并吹打均匀：用阅读仪测量可见光强度l0s(此时所读光为psiCHECK-2载体上转录翻译产生的萤火虫Luciferase所发出的)；取出Eppendorf管，加入100μlStop&GloReagent，吹打均匀；用阅读仪测量可见光强度10s(此时所读光为psiCHECK2载体上转录翻译出的海肾Luciferase所发出的)将所得到的数据，标准化后进行分析。

7.细胞增殖检测

使用3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide(MTT)，即3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐检测细胞增殖。用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔5000个细胞接种到96孔板，每孔体积200μl。分别于转染后24,48和72h，取相应的孔做检测。每个样本设3个复孔。每孔加MTT溶液(5mg/ml)10μl。孵育4h，终止培养，吸弃孔内培养上清液。每孔加100μlDMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。选择490nm波长，用酶标仪(Bio-Rad,美国)测定各孔吸光值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

8.细胞凋亡检测

贴壁细胞经轻吹打收集到10ml的离心管中，没脱壁的细胞用0.02％的EDTA消化使之脱壁，每样本细胞数为(1～5)×10⁶，500～1000r/min离心5min弃去培养液。用孵育缓冲液洗1次，500～1000r/min离心5min。用100μl的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10～15min。500～1000r/min离心5min沉淀细胞，孵育缓冲液洗1次。加入荧光溶液4℃下孵育20min，避光并不时振动。流式细胞仪(EPICS,XL-4,Beckman,CA,USA)分析细胞凋亡率。

9.统计学分析

数据分析使用SPSS17.0统计软件，正态分布的数据采用x±s表示。两组间比较，采用独立样本t检验。检验水准以P<0.05表示差别具有统计学意义。

实验结果

1.NF-kB监控系统的构建

化学合成NF-kB核酸适配体的序列，再在两个序列之间加入连接序列，最终构成2个拷贝的检测元件。另外设置对照组：2个拷贝长度为52bp的重复序列,此序列不与任何已知的蛋白结合，序列以接头相连。在检测元件两端分别加入酶切位点，定向亚克隆到psiCHECK^TM-2质粒hRluc基因下游，如图1所示。相关序列请见表1。

表1NF-kB检测元件(核酸适配体)及其阴性对照的cDNA序列

表1中，加粗划线部分为连接序列。

2.psicheck-2载体荧光素酶相对表达活性在膀胱癌细胞中明显降低

将构建好的NF-kB监控系统及其阴性对照载体分别转染入膀胱癌细胞系T24，48小时后检测荧光素酶相对表达活性：相比于阴性对照组，NF-kB监控系统转染组的荧光素酶表达受到了明显的限制，如图2所示，而使用siRNA-NF-kB敲减细胞内NF-kB的信号强度后，NF-kB监控系统转染组的荧光素酶相对表达活性得到了有效的提升。说明该荧光素酶报告系统对细胞内源性的NF-kB信号产生了有效的应答。

3.NF-kB监控系统有效降低NF-kB信号下游基因的表达

将构建好的NF-kB监控系统及其阴性对照载体分别转染入膀胱癌细胞系T24，48小时后用荧光定量PCR和western-blot分别检测NF-kB靶基因HIF-1a、VEGF、Bcl-XL在mRNA和蛋白水平的表达变化：相比于阴性对照组，NF-kB监控系统转染组的靶基因表达受到了明显的抑制，如图3所示，这说明该信号系统能够有效拦截NF-kB信号，阻断其下游靶基因的转录激活。

4.NF-kB监控系统可以有效抑制膀胱癌细胞系的增殖

将构建好的NF-kB监控系统表达载体及其阴性对照载体分别转染入膀胱癌细胞系T24，24、48、72小时后检测细胞的增殖活力：相比于阴性对照组，NF-kB监控系统转染组的细胞增殖受到了明显的抑制，如图4所示，说明该元件可以通过控制致癌性NF-kB信号来有效抑制癌细胞的生长。

5.NF-kB监控系统可以有效诱导膀胱癌细胞系的凋亡

为了进一步证实NF-kB监控系统抑制膀胱细胞生长是通过促进细胞凋亡实现的，将构建好的NF-kB监控系统表达载体及其阴性对照载体分别转染入膀胱癌细胞系T24，48小时后检测细胞的凋亡率：相比于阴性对照组，NF-kB监控系统转染组的细胞凋亡率明显增加，如图5所示，说明该元件可以通过控制致癌性NF-kB信号来有效诱导癌细胞的凋亡。

一种人NF-kB的核酸适配体，其序列如SEQIDNO:1所示。该核酸适配体能够作为NF-kB抑制剂。该核酸适配体能够用于制备抑制肿瘤细胞增殖的产品中。该核酸适配体能够用于调控肿瘤细胞中NF-kB信号强度。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims (6)

1.一种人NF-kB的核酸适配体，其特征在于，其序列如SEQIDNO：1所示。

2.如权利要求1所述的核酸适配体作为NF-kB抑制剂的应用。

3.如权利要求1所述的核酸适配体在制备抑制肿瘤细胞增殖的产品中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括膀胱癌、前列腺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、子宫内膜癌和黑色素瘤。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞为膀胱癌细胞系T24。

6.如权利要求1所述的核酸适配体在调控肿瘤细胞中NF-kB信号强度的应用。