CN105076117B - 一种种子抗老化剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种种子抗老化剂、其制备方法及利用该种子抗老化剂处理种子的方法，本发明方法制备的种子抗老化剂包括环孢霉素A，本发明的抗老化剂能有效的保持种子活力，显著防止种子的衰老，对延缓高温、潮湿引起的种子老化效果极显著，能有效延长种子保存期限。
Description
技术领域
本发明涉及一种能延缓种子老化的药理学试剂，具体为抗老化种子处理剂。可用于濒危植物种子贮藏。
背景技术
种子活力在种子的发育过程中形成，但种子自成熟后便要经历活力下降的不可逆劣变过程，即种子的老化。种子老化劣变是自然界的普遍现象，也是种质资源保存时所面临的一个严重问题。如何有效延长种子贮藏寿命，提高种子活力是国民经济的重要问题。
七十年代中期，Heydeekert等首先用PEG引发洋葱种子试验，获得出苗整齐的效果。宋红和王丹虹等(1993)研究指出H2O2浸种能提高樟子松和兴安落叶松种子的萌发速率和胚根生长量，缩短萌发时间提高发芽的整齐性。王广印(1995)用适宜浓度的H2O2浸泡无籽西瓜种子后也得到相同的结论。张国盛等(1995)对经过贮藏的小叶锦鸡儿种子进行了预浸、回干处理,结果表明,经6h预浸后立即回干的种子活力明显增加,进一步增加预浸时间就会产生损伤效应。陈健和宋松泉(1995)报道了低浓度的钙离子对玉米种子的发芽率和活力均有提高作用。邢广萍(1996)选用丙酮作为赤霉酸的渗入剂,试验表明使用有机溶剂使生物活性物质的溶解度加大,加快生物活性物质渗入种子的速度，能够提高刺槐种子的活力。胡哲森(1997)应用一定浓度的ZnSO4和H3BO3及其与NAA的组合药剂浸种处理，可以提高柳杉种子活力。朱世威(2004)根据电场强度、处理时间、浸种时间3个因素处理马尾松种子，表明电场强度对马尾松种子的活性有显著的影响。虽然国内外关于提高种子活力方面的研究不少，但主要集中在对已老化种子的活力修复方面。而对于如何延长林木种子寿命则缺乏简便、快速、低成本、易用的方法。种子含水量和贮藏温度是影响种子在贮藏期间生活力和活力保持的关键因素。所以目前延长种子贮藏寿命的方法都是围绕着这两个方面进行，如超干燥贮藏和超低温保存。但由于不同物种种子的特性不同，两种方法都有一定的局限性。如何有效提高种子种子贮藏寿命，是国民经济的重要问题。
目前有关CsA研究主要集中在生物体发育过程相关机理的阐述，在生物体逆境胁迫耐受力方面还未见报道。在植物中的研究也集中在模式植物凋亡信号转导的通路以及网草植物中叶片镂空机制，其在植物抗逆方面潜在的应用价值尚待发掘。
发明内容
本发明的目的是针对现有保持种子活力，防止种子在贮存过程中存在老化的技术问题，提供一种延缓种子老化的种子抗老化剂以及应用该抗老化剂防止种子衰老的方法，本发明方法的这种抗老化剂能有效防止种子的衰老，对延缓高温、潮湿引起的种子老化效果极显著，能有效延长种子保存期限。
为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种种子抗老化剂，包括环孢霉素A。
其中，所述种子抗老化剂为含有环孢霉素A的溶液。
特别是，所述种子抗老化剂中所述环孢霉素A的浓度为50-200μM，优选为90-200μM。
本发明另一方面提供一种种子抗老化剂的制备方法，包括将环孢霉素A溶于水或渗透调节液。
其中，所述渗透调节液按照如下方法制备而成：首先将聚乙二醇与蒸馏水混合均匀，制得聚乙二醇-水溶液，然后再与无水丙酮混匀。
特别是，所述聚乙二醇的重量与蒸馏水的体积之比为5-20：50，即每5-20g聚乙二醇与50ml蒸馏水混合均匀或每500-2000g聚乙二醇与5L蒸馏水混合均匀。
特别是，所述聚乙二醇-水溶液与无水丙酮的体积之比为1：1。
特别是，还包括将环孢霉素A首先溶于二甲亚砜中，制成环孢霉素A母液后再溶于水或渗透调节液。
其中，所述环孢霉素A母液的浓度为50-150mM，优选为75mM。
特别是，所述环孢霉素A母液与水或渗透调节液的体积之比为1：375-1500，优选为1：375-800。
尤其是，制备的种子抗老化剂的中环孢霉素A的浓度为50-200μM，优选为90-200μM。
本发明又一方面提供一种种子抗老化处理的方法，包括将种子浸泡于上述的种子抗老化剂中。
其中，浸泡的时间为4-24h，优选为4-20h，进一步优选为12h；浸泡温度为0-10℃，优选为4℃。
本发明再一方面提供一种种子抗老化处理的方法，包括如下顺序进行的步骤：
1)将环孢霉素A溶于二甲亚砜中，制成浓度为50-150mM的环孢霉素A母液；
2)将环孢霉素A母液与水或渗透调节液混合均匀，制成浓度为100-200μM的抗老化剂；
3)将种子浸泡于步骤2)制备的抗老化剂中，进行抗老化处理，其中抗老化处理时间为4-24h。
其中，步骤1)中所述环孢霉素A母液的浓度优选为75mM；步骤2)中所述抗老化剂浓度优选为90-200μM；步骤3)中抗老化处理时间优选为4-20h，进一步优选为12h。
特别是，步骤3)中所述抗老化处理的温度为0-10℃，优选为4℃。
特别是，还包括步骤4)将抗老化处理后的种子晾干后再与克菌丹混合，进行灭菌处理。
本发明又一方面提供一种种子抗老化处理的方法，包括如下顺序进行的步骤：
1)将环孢霉素A溶于二甲亚砜中，制成浓度为50-150mM的环孢霉素A母液；
2)将环孢霉素A母液与水或渗透调节液混合均匀，制成浓度为50-200μM的抗老化剂；
3)将种子浸泡于步骤2)制备的抗老化剂中，然后抽真空，对种子进行抗老化处理，其中抗老化处理时间为0.5h-6h。
其中，步骤1)中所述环孢霉素A母液的浓度优选为75mM；步骤2)中所述抗老化剂浓度优选为90-200μM；步骤3)中抗老化处理时间优选为0.5-1h。
特别是，步骤3)中所述抗老化处理的温度为0-10℃，优选为4℃。
其中，步骤3)中抽真空过程中保持绝对压力<0.1MPa，优选为0-0.095MPa，进一步优选为0.005-0.09MPa。
特别是，还包括步骤4)将抗老化处理后的种子晾干后再与克菌丹混合，进行灭菌处理。
尤其是，所述种子与克菌丹的重量份配比为1000：1。
本发明的种子抗老化剂具有如下优点：
1、本发明的新型种子抗老化剂环孢霉素A作用于种子线粒体，调节通透性转换孔上的亲环素D蛋白，阻止线粒体透性转换孔的开放，抑制线粒体内容物的外流，显著提高种子的抗老化能力，延缓种子的衰老。
本发明在人工控制老化研究过程中发现环孢霉素A(别名环孢多肽A，环孢素等；简写CsA)结合渗透调节液低温浸种能显著提高种子抗老化能力，延缓种子衰老。CsA作用机理是作用于线粒体通透性转换孔(MPTP)上的亲环素D蛋白，阻止MPTP开放，抑制线粒体内容物外流，保护线粒体机能。应用于延缓种子老化效果极佳，显著提高了种子活力，降低染菌率，使种子发芽率大大提高。
2、采用本发明的种子抗老化剂处理后的种子的发芽率比不采用抗老化剂处理的种子的发芽率提高了至少2倍以上，甚至达到27倍以上。
3、环孢霉素A(CsA)是真菌产生的环状11肽活性物质，是一种新型高效免疫抑制剂。在临床方面，多用于降低脏器移植后的排异率，效果显著。近年来，多篇文献报道CsA在植物细胞程序化死亡具有显著的抑制效果，其结合到线粒体蛋白环孢霉素受体D以后阻断细胞色素C释放被认为是该抑制反应的本质。本发明种子抗老化剂的制备方法工艺简单，效率高，耗能低，环保，操作工艺条件容易控制，质量可控性强。
4、本发明新型生物活性种子抗老化剂处理种子的方法简单，处理效率高，可以大批量处理种子，并且操作工艺条件温和，容易控制，适宜规模化处理种子。同时，环孢霉素A本质为真菌微生物代谢产物，不会影响种苗生长周围有益微生物与田间病原菌的竞争。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1
将每年新采收的榆树、沙棘、油菜、梭梭、紫花苜蓿、侧柏、中间锦鸡儿、沙冬青、合欢的种子置于发芽床上进行发芽处理，发芽床为直径为12cm的培养皿，其底部垫双层滤纸，用水湿润，每个皿放50粒种子，4个重复；将发芽床置于光照培养箱内，于温度为25±1℃，光照强度为80Lux，光暗时间各为12h进行种子的发芽处理，每天记录发芽率至无萌发为止，分别获得榆树、沙棘、油菜、梭梭、紫花苜蓿、侧柏、中间锦鸡儿、沙冬青、合欢种子的原始发芽率，原始发芽率的计算结果如表1-9所示。
实施例2
1、种子灭菌处理
将种子(榆树)首先浸泡在质量百分比浓度为0.1％的HgCl2溶液中10min，进行消毒处理，然后取出，室温(20-30℃)晾干至原始含水量为7.8％后，备用。
2、抗老化剂的制备
2-1)将75mmol的环孢霉素A(简称CsA)加入到1L的二甲基亚砜(DMSO)中，搅拌均匀，制成浓度为75mM的CsA-DMSO溶液，即抗老化剂母液，然后置于-20℃冻存，备用；
本发明抗老化剂母液的浓度除了75mM之外，浓度为50-150mM的CsA-DMSO溶液也适用于本发明。
2-2)将抗老化剂母液与渗透调节液混合，其中抗老化剂母液与渗透调节液的体积之比为1：500，搅拌均匀制成浓度为150μM的抗老化剂，即如果配制10ml抗老化剂，则抗老化剂母液的用量为20μl，渗透调节液的用量为10ml；其中所述渗透调节液按照如下方法配制而成：
将聚乙二醇与蒸馏水混合后溶解均匀，制得聚乙二醇-水溶液，然后在加入无水丙酮而成，其中，聚乙二醇的重量与蒸馏水的体积之比为20：50，即每20g聚乙二醇与50ml蒸馏水混合均匀或每2kg聚乙二醇与5L蒸馏水混合均匀，制成聚乙二醇-水溶液；聚乙二醇-水溶液与无水丙酮的体积之比为1：1。
制成的渗透调节液在常温下密闭保存。
3、种子抗老化处理
3-1)取4ml抗老化剂溶液置于垫有2层定性滤纸(厚度20mm)的培养皿(半径：90mm)中，接着在每个培养皿中均匀排列50粒种子，四次重复，然后于4℃条件下进行浸种处理12小时；
3-2)浸种12h后取出种子，用蒸馏水快速冲洗4～5次，接着用干净的滤纸吸干种子表面水分；然后于25℃晾干至原始含水量7.8％。
种子抗老化处理期间未见胚根伸出。
3-3)由于榆树种子为含内生菌种子，为了降低种子的染菌率，提高种子抗老化能力，将经过CsA抗老化处理的种子与克菌丹粉混合均匀，其中种子与克菌丹粉的重量配比为1000：1，然后在振荡器中搅拌15-20min。
对含内生菌的种子采用灭菌丹粉进行灭菌时，必须在抗老化处理后再进行。
4、种子老化处理
4-1)将玻璃干燥器用酒精擦洗灭菌，或直接放入紫外灯下直接灭菌，然后将装有无菌水(放置于干燥器的底部)的玻璃干燥器放入恒温培养箱内；
4-2)将抗老化处理后的种子置于恒温恒湿箱内的玻璃干燥器的上部，进行人工老化处理，放置24h后，开始计算老化天数，其中，老化处理的温度为37℃，相对湿度为100％，种子在恒温恒湿箱内老化6天后取出。
5、种子发芽
将老化处理后的种子置于发芽床上进行发芽处理，发芽床为直径为12cm的培养皿，其底部垫双层滤纸，用水湿润，每个皿放50粒种子，4个重复；
将发芽床置于光照培养箱内，于温度为25℃，光照强度为80Lux，光暗时间各为12h进行种子的发芽处理，每天记录发芽率至无萌发为止。发芽率的试验结果如表1所示。
实施例3
除了“种子抗老化处理”步骤中采用蒸馏水浸种之外，其余与实施例2相同，种子发芽率计算结果如表1所示。
实施例4
除了“抗老化剂制备”步骤中将抗老化剂母液与蒸馏水混合均匀之外，其余与实施例2相同，种子发芽率计算结果如表1所示。
表1 榆树种子人工老化处理(37℃、100％湿度(RH))对发芽率的影响
实施例5
1、种子灭菌处理
除了采用沙棘种子并且沙棘种子的原始含水率为8.1％之外，其余与实施例2相同；
2、抗老化剂的制备
将50mmol的环孢霉素A(简称CsA)加入到1L的二甲基亚砜(DMSO)中，搅拌均匀，制成浓度为50mM的CsA-DMSO溶液，即抗老化剂母液，然后置于-20℃冻存，备用；
2-2)将抗老化剂母液与渗透调节液混合，其中抗老化剂母液与渗透调节液的体积之比为1：750，搅拌均匀制成浓度为100μM的抗老化剂，即如果配制10ml抗老化剂，则抗老化剂母液的用量为13μl，渗透调节液的用量为10ml；其中所述渗透调节液按照如下方法配制而成：
将聚乙二醇与蒸馏水混合后溶解均匀，制得聚乙二醇-水溶液，然后在加入无水丙酮而成，其中，聚乙二醇的重量与蒸馏水的体积之比为5：50，即每5g聚乙二醇与50ml蒸馏水混合均匀或每500g聚乙二醇与5L蒸馏水混合均匀，制成聚乙二醇-水溶液；聚乙二醇-水溶液与无水丙酮的体积之比为1：1。
制成的渗透调节液在常温下密闭保存。
3、种子抗老化处理
3-1)取4ml抗老化剂溶液置于垫有2层滤纸的培养皿中，接着在每个培养皿中均匀排列50粒种子，四次重复，然后于4℃条件下进行浸种处理12小时；
3-2)浸种12h后取出种子，用蒸馏水快速冲洗4～5次，接着用干净的滤纸吸干种子表面水分；然后于25℃晾干至原始含水量8.1％。
种子抗老化处理期间未见胚根伸出。
3-3)由于沙棘种子为含内生菌种子，为了降低种子的染菌率，提高种子抗老化能力，将经过CsA抗老化处理的种子与克菌丹粉混合均匀，其中种子与克菌丹粉的重量配比为1000：1，然后在振荡器中搅拌15-20min。
4、种子老化处理
4-1)将玻璃干燥器用酒精擦洗灭菌，或直接放入紫外灯下直接灭菌，然后将装有无菌水(放置于干燥器的底部)的玻璃干燥器放入恒温培养箱内；
4-2)将抗老化处理后的种子置于恒温恒湿箱内的玻璃干燥器的上部，进行人工老化处理，放置24h后，开始计算老化天数，其中，老化处理的温度为37℃，相对湿度为100％，种子在恒温恒湿箱内老化10天后取出。
5、种子发芽
将老化处理后的种子置于发芽床上进行发芽处理，发芽床为直径为12cm的培养皿，其底部垫双层滤纸，用水湿润，每个皿放50粒种子，4个重复；
将发芽床置于光照培养箱内，于温度为25℃，光照强度为80Lux，光暗时间各为12h进行种子的发芽处理，每天记录发芽率至无萌发为止。发芽率的试验结果如表2所示。
实施例6
除了“种子抗老化处理”步骤中采用蒸馏水浸种之外，其余与实施例5相同，种子发芽率计算结果如表1所示。
实施例7
除了“抗老化剂制备”步骤中将抗老化剂母液与蒸馏水混合均匀之外，其余与实施例5相同，种子发芽率计算结果如表2所示。
表2 沙棘种子人工老化处理(37℃、100％湿度(RH))对发芽率的影响
实施例8
1、种子灭菌处理
除了采用油菜种子并且油菜种子的原始含水率为7.1％之外，其余与实施例2相同；
2、抗老化剂的制备
将150mmol环孢霉素A(简称CsA)加入到1L的二甲基亚砜(DMSO)中，搅拌均匀，制成浓度为150mM的CsA-DMSO溶液，即抗老化剂母液，然后置于-20℃冻存，备用；
2-2)将抗老化剂母液与渗透调节液混合，其中，抗老化剂母液与渗透调节液的体积之比为1：375，搅拌均匀制成浓度为200μM的抗老化剂，即如果配制10ml抗老化剂，则抗老化剂母液的用量为25μl，渗透调节液的用量为10ml；即其中所述渗透调节液按照如下方法配制而成：
将聚乙二醇与蒸馏水混合后溶解均匀，制得聚乙二醇-水溶液，然后在加入无水丙酮而成，其中，聚乙二醇的重量与蒸馏水的体积之比为10：50，即每10g聚乙二醇与50ml蒸馏水混合均匀或每1kg聚乙二醇与5L蒸馏水混合均匀，制成聚乙二醇-水溶液；聚乙二醇-水溶液与无水丙酮的体积之比为1：1。
制成的渗透调节液在常温下密闭保存。
3、种子抗老化处理
3-1)取4ml抗老化剂溶液置于垫有2层定性滤纸的培养皿中，接着在每个培养皿中均匀排列50粒种子，四次重复，然后于4℃条件下进行浸种处理18小时；
3-2)浸种18h后取出种子，用蒸馏水快速冲洗4～5次，接着用干净的滤纸吸干种子表面水分；然后于25℃晾干至原始含水量7.1％。
种子抗老化处理期间未见胚根伸出。
4、种子老化处理
4-1)将玻璃干燥器用酒精擦洗灭菌，或直接放入紫外灯下直接灭菌，然后将装有无菌水(放置于干燥器的底部)的玻璃干燥器放入恒温培养箱内；
4-2)将抗老化处理后的种子置于恒温恒湿箱内的玻璃干燥器的上部，进行人工老化处理，放置24h后，开始计算老化天数，其中，老化处理的温度为37℃，相对湿度为100％，种子在恒温恒湿箱内老化25天后取出。
5、种子发芽
将老化处理后的种子置于发芽床上进行发芽处理，发芽床为直径为12cm的培养皿，其底部垫双层滤纸，用水湿润，每个皿放50粒种子，4个重复；
将发芽床置于光照培养箱内，于温度为25℃，光照强度为80Lux，光暗时间各为12h进行种子的发芽处理，每天记录发芽率至无萌发为止。发芽率的试验结果如表3所示。
实施例9
除了“种子抗老化处理”步骤中采用蒸馏水浸种之外，其余与实施例8相同，种子发芽率计算结果如表1所示。
实施例10
除了“抗老化剂制备”步骤中将抗老化剂母液与蒸馏水混合均匀之外，其余与实施例8相同，种子发芽率计算结果如表3所示。
表3 油菜种子人工老化处理(37℃、100％湿度(RH))对发芽率的影响
实施例11
1、种子灭菌处理
除了采用梭梭种子并且梭梭种子的原始含水率为6.8％之外，其余与实施例2相同；
2、抗老化剂的制备
将75mmol环孢霉素A(简称CsA)加入到1L的二甲基亚砜(DMSO)中，搅拌均匀，制成浓度为75mM的CsA-DMSO溶液，即抗老化剂母液，然后置于-20℃冻存，备用；
2-2)将抗老化剂母液与渗透调节液混合，其中抗老化剂母液与渗透调节液的体积之比为1：375，搅拌均匀制成浓度为200μM的抗老化剂，即如果配制10ml抗老化剂，则抗老化剂母液的用量为25μl，渗透调节液的用量为10ml；其中所述渗透调节液按照如下方法配制而成：
将聚乙二醇与蒸馏水混合后溶解均匀，制得聚乙二醇-水溶液，然后在加入无水丙酮而成，其中，聚乙二醇的重量与蒸馏水的体积之比为20：50，即每20g聚乙二醇与50ml蒸馏水混合均匀或每2kg聚乙二醇与5L蒸馏水混合均匀，制成聚乙二醇-水溶液；聚乙二醇-水溶液与无水丙酮的体积之比为1：1。
制成的渗透调节液在常温下密闭保存。
3、种子抗老化处理
3-1)取4ml抗老化剂溶液置于垫有2层定性滤纸的培养皿中，接着在每个培养皿中均匀排列50粒种子，四次重复，然后于4℃条件下进行浸种处理4小时；
3-2)浸种4h后取出种子，用蒸馏水快速冲洗4～5次，接着用干净的滤纸吸干种子表面水分；然后于25℃晾干至原始含水量6.8％。
种子抗老化处理期间未见胚根伸出。
3-3)由于梭梭种子为含内生菌种子，为了降低种子的染菌率，提高种子抗老化能力，将经过CsA抗老化处理的种子与克菌丹粉混合均匀，其中种子与克菌丹粉的重量配比为1000：1，然后在振荡器中搅拌15-20min。
4、种子老化处理
4-1)将玻璃干燥器用酒精擦洗灭菌，或直接放入紫外灯下直接灭菌，然后将装有无菌水(放置于干燥器的底部)的玻璃干燥器放入恒温培养箱内；
4-2)将抗老化处理后的种子置于恒温恒湿箱内的玻璃干燥器的上部，进行人工老化处理，放置24h后，开始计算老化天数，其中，老化处理的温度为37℃，相对湿度为100％，种子在恒温恒湿箱内老化4天后取出。
5、种子发芽
将老化处理后的种子置于发芽床上进行发芽处理，发芽床为直径为12cm的培养皿，其底部垫双层滤纸，用水湿润，每个皿放50粒种子，4个重复；
将发芽床置于光照培养箱内，于温度为25℃，光照强度为80Lux，光暗时间各为12h进行种子的发芽处理，每天记录发芽率至无萌发为止。发芽率的试验结果如表4所示。
实施例12
除了“种子抗老化处理”步骤中采用蒸馏水浸种之外，其余与实施例11相同，种子发芽率计算结果如表4所示。
实施例13
除了“抗老化剂制备”步骤中将抗老化剂母液与蒸馏水混合均匀之外，其余与实施例11相同，种子发芽率计算结果如表4所示。
表4 梭梭种子人工老化处理(37℃、100％湿度(RH))对发芽率的影响
实施例14
1、种子灭菌处理
除了采用紫花苜蓿种子并且紫花苜蓿种子的原始含水率为8.7％之外，其余与实施例2相同；
2、抗老化剂的制备
将75mmol环孢霉素A(简称CsA)加入到1L的二甲基亚砜(DMSO)中，搅拌均匀，制成浓度为75mM的CsA-DMSO溶液，即抗老化剂母液，然后置于-20℃冻存，备用；
2-2)将抗老化剂母液与渗透调节液混合，其中抗老化剂母液与渗透调节液的体积之比为1：750，搅拌均匀制成浓度为100μM的抗老化剂，即如果配制10ml抗老化剂，则抗老化剂母液的用量为13μl，渗透调节液的用量为10ml；其中所述渗透调节液按照如下方法配制而成：
将聚乙二醇与蒸馏水混合后溶解均匀，制得聚乙二醇-水溶液，然后在加入无水丙酮而成，其中，聚乙二醇的重量与蒸馏水的体积之比为20：50，即每20g聚乙二醇与50ml蒸馏水混合均匀或每2kg聚乙二醇与5L蒸馏水混合均匀，制成聚乙二醇-水溶液；聚乙二醇-水溶液与无水丙酮的体积之比为1：1。
制成的渗透调节液在常温下密闭保存。
3、种子抗老化处理
3-1)取4ml抗老化剂溶液置于垫有2层定性滤纸的培养皿中，接着在每个培养皿中均匀排列50粒种子，四次重复，然后于4℃条件下进行浸种处理20小时；
3-2)浸种20h后取出种子，用蒸馏水快速冲洗4～5次，接着用干净的滤纸吸干种子表面水分；然后于25℃晾干至原始含水量8.7％。
种子抗老化处理期间未见胚根伸出。
3-3)由于紫花苜蓿种子为含内生菌种子，为了降低种子的染菌率，提高种子抗老化能力，将经过CsA抗老化处理的种子与克菌丹粉混合均匀，其中种子与克菌丹粉的重量配比为1000：1，然后在振荡器中搅拌15-20min。
4、种子老化处理
4-1)将玻璃干燥器用酒精擦洗灭菌，或直接放入紫外灯下直接灭菌，然后将装有无菌水(放置于干燥器的底部)的玻璃干燥器放入恒温培养箱内；
4-2)将抗老化处理后的种子置于恒温恒湿箱内的玻璃干燥器的上部，进行人工老化处理，放置24h后，开始计算老化天数，其中，老化处理的温度为37℃，相对湿度为100％，种子在恒温恒湿箱内老化4天后取出。
5、种子发芽
将老化处理后的种子置于发芽床上进行发芽处理，发芽床为直径为12cm的培养皿，其底部垫双层滤纸，用水湿润，每个皿放50粒种子，4个重复；
将发芽床置于光照培养箱内，于温度为25℃，光照强度为80Lux，光暗时间各为12h进行种子的发芽处理，每天记录发芽率至无萌发为止。发芽率的试验结果如表5所示。
实施例15
除了“种子抗老化处理”步骤中采用蒸馏水浸种之外，其余与实施例14相同，种子发芽率计算结果如表5所示。
实施例16
除了“抗老化剂制备”步骤中将抗老化剂母液与蒸馏水混合均匀之外，其余与实施例14相同，种子发芽率计算结果如表5所示。
表5 紫花苜宿种子人工老化处理(37℃、100％湿度(RH))对发芽率的影响
实施例17
1、种子灭菌处理
除了采用侧柏种子并且侧柏种子的原始含水率为8.0％之外，其余与实施例2相同；
2、抗老化剂的制备
将50mmol环孢霉素A(简称CsA)加入到1L的二甲基亚砜(DMSO)中，搅拌均匀，制成浓度为50mM的CsA-DMSO溶液，即抗老化剂母液，然后置于-20℃冻存，备用；
2-2)将抗老化剂母液与渗透调节液混合，其中抗老化剂母液与渗透调节液的体积之比为1：750，搅拌均匀制成浓度为100μM的抗老化剂，即如果配制10ml抗老化剂，则抗老化剂母液的用量为13μl，渗透调节液的用量为10ml；其中所述渗透调节液按照如下方法配制而成：
将聚乙二醇与蒸馏水混合后溶解均匀，制得聚乙二醇-水溶液，然后在加入无水丙酮而成，其中，聚乙二醇的重量与蒸馏水的体积之比为10：50，即每10g聚乙二醇与50ml蒸馏水混合均匀或每1kg聚乙二醇与5L蒸馏水混合均匀，制成聚乙二醇-水溶液；聚乙二醇-水溶液与无水丙酮的体积之比为1：1。
制成的渗透调节液在常温下密闭保存。
3、种子抗老化处理
3-1)取灭菌处理后的种子和抗老化剂溶液置于100ml的烧杯，抗老化剂浸没种子，接着将烧杯置于密闭罐中，开启真空泵，进行抽真空浸种处理，抽真空过程中绝对压力为0.005MPa，处理0.5h后取出烧杯；
3-2)将抽真空浸种0.5h后的种子用蒸馏水快速冲洗4～5次，接着用干净的滤纸吸干种子表面水分；然后于25℃晾干至原始含水量8.0％。
种子抗老化处理期间未见胚根伸出。
3-3)由于侧柏种子为含内生菌种子，为了降低种子的染菌率，提高种子抗老化能力，将经过CsA抗老化处理的种子与克菌丹粉混合均匀，其中种子与克菌丹粉的重量配比为1000：1，然后在振荡器中搅拌15-20min。
4、种子老化处理
4-1)将玻璃干燥器用酒精擦洗灭菌，或直接放入紫外灯下直接灭菌，然后将装有无菌水(放置于干燥器的底部)的玻璃干燥器放入恒温培养箱内；
4-2)将抗老化处理后的种子置于恒温恒湿箱内的玻璃干燥器的上部，进行人工老化处理，放置24h后，开始计算老化天数，其中，老化处理的温度为50℃，相对湿度为100％，种子在恒温恒湿箱内老化40天后取出。
5、种子发芽
将老化处理后的种子置于发芽床上进行发芽处理，发芽床为直径为12cm的培养皿，其底部垫双层滤纸，用水湿润，每个皿放50粒种子，4个重复；
将发芽床置于光照培养箱内，于温度为25℃，光照强度为80Lux，光暗时间各为12h进行种子的发芽处理，每天记录发芽率至无萌发为止。发芽率的试验结果如表6所示。
实施例18
除了“种子抗老化处理”步骤中采用蒸馏水浸种之外，其余与实施例17相同，种子发芽率计算结果如表6所示。
实施例19
除了“抗老化剂制备”步骤中将抗老化剂母液与蒸馏水混合均匀之外，其余与实施例17相同，种子发芽率计算结果如表6所示。
表6 侧柏种子人工老化处理(50℃、100％湿度(RH))对发芽率的影响
实施例20
1、种子灭菌处理
除了采用中间锦鸡儿种子并且种子的原始含水率为7.7％之外，其余与实施例2相同；
2、抗老化剂的制备
将150mmol环孢霉素A(简称CsA)加入到1L的二甲基亚砜(DMSO)中，搅拌均匀，制成浓度为150mM的CsA-DMSO溶液，即抗老化剂母液，然后置于-20℃冻存，备用；
2-2)将抗老化剂母液与渗透调节液混合，其中抗老化剂母液与渗透调节液的体积之比为1：800，搅拌均匀制成浓度为90μM的抗老化剂，即如果配制10ml抗老化剂，则抗老化剂母液的用量为12μl，渗透调节液的用量为10ml；其中所述渗透调节液按照如下方法配制而成：
将聚乙二醇与蒸馏水混合后溶解均匀，制得聚乙二醇-水溶液，然后在加入无水丙酮而成，其中，聚乙二醇的重量与蒸馏水的体积之比为5：50，即每5g聚乙二醇与50ml蒸馏水混合均匀或每500g聚乙二醇与5L蒸馏水混合均匀，制成聚乙二醇-水溶液；聚乙二醇-水溶液与无水丙酮的体积之比为1：1。
制成的渗透调节液在常温下密闭保存。
3、种子抗老化处理
3-1)取灭菌处理后的中间锦鸡儿种子和抗老化剂溶液置于100ml的烧杯，抗老化剂浸没种子，接着将烧杯置于密闭罐中，开启真空泵，进行抽真空浸种处理，抽真空过程中绝对压力为0.05MPa，处理1h后取出烧杯；
3-2)将抽真空浸种1h后的种子用蒸馏水快速冲洗4～5次，接着用干净的滤纸吸干种子表面水分；然后于25℃晾干至原始含水量7.7％。
种子抗老化处理期间未见胚根伸出。
3-3)由于中间锦鸡儿种子为含内生菌种子，为了降低种子的染菌率，提高种子抗老化能力，将经过CsA抗老化处理的种子与克菌丹粉混合均匀，其中种子与克菌丹粉的重量配比为1000：1，然后在振荡器中搅拌15-20min。
4、种子老化处理
4-1)将玻璃干燥器用酒精擦洗灭菌，或直接放入紫外灯下直接灭菌，然后将装有无菌水(放置于干燥器的底部)的玻璃干燥器放入恒温培养箱内；
4-2)将抗老化处理后的种子置于恒温恒湿箱内的玻璃干燥器的上部，进行人工老化处理，放置24h后，开始计算老化天数，其中，老化处理的温度为50℃，相对湿度为100％，种子在恒温恒湿箱内老化48天后取出。
5、种子发芽
将老化处理后的种子置于发芽床上进行发芽处理，发芽床为直径为12cm的培养皿，其底部垫双层滤纸，用水湿润，每个皿放50粒种子，4个重复；
将发芽床置于光照培养箱内，于温度为25℃，光照强度为80Lux，光暗时间各为12h进行种子的发芽处理，每天记录发芽率至无萌发为止。发芽率的试验结果如表7所示。
实施例21
除了“种子抗老化处理”步骤中采用蒸馏水浸种之外，其余与实施例20相同，种子发芽率计算结果如表7所示。
实施例22
除了“抗老化剂制备”步骤中将抗老化剂母液与蒸馏水混合均匀之外，其余与实施例20相同，种子发芽率计算结果如表7所示。
表7 中间锦鸡儿种子人工老化处理(50℃、100％湿度(RH))对发芽率的影响
实施例23
1、种子灭菌处理
除了采用沙冬青种子并且沙冬青种子的原始含水率为7.6％之外，其余与实施例2相同；
2、抗老化剂的制备
将75mmol环孢霉素A(简称CsA)加入到1L的二甲基亚砜(DMSO)中，搅拌均匀，制成浓度为75mM的CsA-DMSO溶液，即抗老化剂母液，然后置于-20℃冻存，备用；
2-2)将抗老化剂母液与渗透调节液混合，其中抗老化剂母液与渗透调节液的体积之比为1：800，搅拌均匀制成浓度为90μM的抗老化剂，即如果配制10ml抗老化剂，则抗老化剂母液的用量为12μl，渗透调节液的用量为10ml；其中所述渗透调节液按照如下方法配制而成：
将聚乙二醇与蒸馏水混合后溶解均匀，制得聚乙二醇-水溶液，然后在加入无水丙酮而成，其中，聚乙二醇的重量与蒸馏水的体积之比为20：50，即每20g聚乙二醇与50ml蒸馏水混合均匀或每2kg聚乙二醇与5L蒸馏水混合均匀，制成聚乙二醇-水溶液；聚乙二醇-水溶液与无水丙酮的体积之比为1：1。
制成的渗透调节液在常温下密闭保存。
3、种子抗老化处理
3-1)取灭菌处理后的沙冬青种子和抗老化剂溶液置于100ml的烧杯，抗老化剂浸没种子，接着将烧杯置于密闭中，开启真空泵，进行抽真空浸种处理，抽真空过程中绝对压力为0.03MPa，处理0.5后取出烧杯；
3-2)将抽真空浸种0.5h后的种子用蒸馏水快速冲洗4～5次，接着用干净的滤纸吸干种子表面水分；然后于25℃晾干至原始含水量7.6％。
种子抗老化处理期间未见胚根伸出。
3-3)由于沙冬青种子为含内生菌种子，为了降低种子的染菌率，提高种子抗老化能力，将经过CsA抗老化处理的种子与克菌丹粉混合均匀，其中种子与克菌丹粉的重量配比为1000：1，然后在振荡器中搅拌15-20min。
4、种子老化处理
4-1)将玻璃干燥器用酒精擦洗灭菌，或直接放入紫外灯下直接灭菌，然后将装有无菌水(放置于干燥器的底部)的玻璃干燥器放入恒温培养箱内；
4-2)将抗老化处理后的种子置于恒温恒湿箱内的玻璃干燥器的上部，进行人工老化处理，放置24h后，开始计算老化天数，其中，老化处理的温度为50℃，相对湿度为100％，种子在恒温恒湿箱内老化50天后取出。
5、种子发芽
将老化处理后的种子置于发芽床上进行发芽处理，发芽床为直径为12cm的培养皿，其底部垫双层滤纸，用水湿润，每个皿放50粒种子，4个重复；
将发芽床置于光照培养箱内，于温度为25℃，光照强度为80Lux，光暗时间各为12h进行种子的发芽处理，每天记录发芽率至无萌发为止。发芽率的试验结果如表8所示。
实施例24
除了“种子抗老化处理”步骤中采用蒸馏水浸种之外，其余与实施例23相同，种子发芽率计算结果如表8所示。
实施例25
除了“抗老化剂制备”步骤中将抗老化剂母液与蒸馏水混合均匀之外，其余与实施例23相同，种子发芽率计算结果如表8所示。
表8 沙冬青种子人工老化处理(50℃、100％湿度(RH))对发芽率的影响
实施例26
1、种子灭菌处理
除了采用合欢种子并且合欢种子的原始含水率为7.5％之外，其余与实施例2相同；
2、抗老化剂的制备
将75mmol环孢霉素A(简称CsA)加入到1L的二甲基亚砜(DMSO)中，搅拌均匀，制成浓度为75mM的CsA-DMSO溶液，即抗老化剂母液，然后置于-20℃冻存，备用；
2-2)将抗老化剂母液与渗透调节液混合，其中抗老化剂母液与渗透调节液的体积之比为1：800，搅拌均匀制成浓度为90μM的抗老化剂，即如果配制10ml抗老化剂，则抗老化剂母液的用量为12μl，渗透调节液的用量为10ml；其中所述渗透调节液按照如下方法配制而成：
将聚乙二醇与蒸馏水混合后溶解均匀，制得聚乙二醇-水溶液，然后在加入无水丙酮而成，其中，聚乙二醇的重量与蒸馏水的体积之比为20：50，即每20g聚乙二醇与50ml蒸馏水混合均匀或每2kg聚乙二醇与5L蒸馏水混合均匀，制成聚乙二醇-水溶液；聚乙二醇-水溶液与无水丙酮的体积之比为1：1。
制成的渗透调节液在常温下密闭保存。
3、种子抗老化处理
3-1)取灭菌处理后的合欢种子和抗老化剂溶液置于100ml的烧杯，抗老化剂浸没种子，接着将烧杯置于密闭容器中，开启真空泵，进行抽真空浸种处理，抽真空过程中绝对压力为0.05MPa，处理1h后取出烧杯；
3-2)将抽真空浸种1h后的种子用蒸馏水快速冲洗4～5次，接着用干净的滤纸吸干种子表面水分；然后于25℃晾干至原始含水量7.5％。
种子抗老化处理期间未见胚根伸出。
3-3)由于合欢种子为含内生菌种子，为了降低种子的染菌率，提高种子抗老化能力，将经过CsA抗老化处理的种子与克菌丹粉混合均匀，其中种子与克菌丹粉的重量配比为1000：1，然后在振荡器中搅拌15-20min。
4、种子老化处理
4-1)将玻璃干燥器用酒精擦洗灭菌，或直接放入紫外灯下直接灭菌，然后将装有无菌水(放置于干燥器的底部)的玻璃干燥器放入恒温培养箱内；
4-2)将抗老化处理后的种子置于恒温恒湿箱内的玻璃干燥器的上部，进行人工老化处理，放置24h后，开始计算老化天数，其中，老化处理的温度为50℃，相对湿度为100％，种子在恒温恒湿箱内老化15天后取出。
5、种子发芽
将老化处理后的种子置于发芽床上进行发芽处理，发芽床为直径为12cm的培养皿，其底部垫双层滤纸，用水湿润，每个皿放50粒种子，4个重复；
将发芽床置于光照培养箱内，于温度为25℃，光照强度为80Lux，光暗时间各为12h进行种子的发芽处理，每天记录发芽率至无萌发为止。发芽率的试验结果如表9所示。
实施例27
除了“种子抗老化处理”步骤中采用蒸馏水浸种之外，其余与实施例26相同，种子发芽率计算结果如表9所示。
实施例28
除了“抗老化剂制备”步骤中将抗老化剂母液与蒸馏水混合均匀之外，其余与实施例27相同，种子发芽率计算结果如表9所示。
表9 合欢种子人工老化处理(50℃、100％湿度(RH))对发芽率的影响
Claims (7)
1.一种种子抗老化处理的方法，其特征是将种子浸泡于种子抗老化剂中，所述种子抗老化剂是将环孢霉素A溶于水或渗透调节液而成，其中，所述渗透调节液按照如下方法制备而成：首先将聚乙二醇与蒸馏水混合均匀，制得聚乙二醇-水溶液，然后再与无水丙酮混匀。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是所述种子抗老化剂中所述环孢霉素A的浓度为50-200μM。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征是，所述聚乙二醇-水溶液与无水丙酮的体积之比为1：1。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征是，还包括将环孢霉素A首先溶于二甲亚砜中，制成环孢霉素A母液，然后再溶于水或渗透调节液。
5.一种种子抗老化处理的方法，其特征是包括如下顺序进行的步骤：
1)将环孢霉素A溶于二甲亚砜中，制成浓度为50-150mM的环孢霉素A母液；
2)将环孢霉素A母液与水或渗透调节液混合均匀，制成浓度为50-200μM的抗老化剂；
3)将种子浸泡于步骤2)制备的抗老化剂中，进行抗老化处理，其中抗老化处理时间为4h-24h。
6.一种种子抗老化处理的方法，其特征是包括如下顺序进行的步骤：
1)将环孢霉素A溶于二甲亚砜中，制成浓度为50-150mM的环孢霉素A母液；
2)将环孢霉素A母液与水或渗透调节液混合均匀，制成浓度为50-200μM的抗老化剂；
3)将种子浸泡于步骤2)制备的抗老化剂中，然后抽真空，对种子进行抗老化处理，其中抗老化处理时间为0.5-6h。
7.如权利要求5或6所述的抗老化处理方法，其特征是还包括步骤4)将抗老化处理后的种子与克菌丹混合，进行灭菌处理。
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