CN105056235A

CN105056235A - 激活心脏再生的组合物及其应用

Info

Publication number: CN105056235A
Application number: CN201510436999.9A
Authority: CN
Inventors: 熊敬维; 周小海
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2014-07-23
Filing date: 2015-07-23
Publication date: 2015-11-18

Abstract

本发明提供一种激活心脏再生的组合物，所述组合物含有Erk1/2磷酸化水平正向调节剂。本发明还涉及Mek1/2蛋白、Erk1/2去磷酸化的抑制剂、过氧化氢或NOX家族蛋白在制备激活心脏再生药物中的应用。本发明通过实验发现了一条能够激活心脏再生能力的信号通路，通过对于这条信号通路上的各个环节进行调节，既可以实现对心脏再生能力的激活。通过对心脏损伤面的操作，激活心脏的再生能力，可以实现对心脏损伤的有效治疗，降低死亡率。

Description

激活心脏再生的组合物及其应用

技术领域

本申请涉及一种激活心脏再生的组合物及其应用。

背景技术

由于成人心脏再生能力极为有限，心脏损伤对人类的生命安全带来了极大的威胁。找到一种能够激活成人心脏再生能力的药物，以用于成人心脏损伤的治疗，成为科学界的一大任务。

发明内容

为了解决成人心脏再生能力差的问题，本发明提供一种能够激活心脏再生能力的组合物。

作为本发明的一个方面，涉及一种激活心脏再生的组合物，所述组合物含有Erk1/2磷酸化水平正向调节剂。本发明所称磷酸化水平正向调节剂，可以是一切能够直接或间接使得Erk1/2磷酸化水平升高的物质。

具体地，所述Erk1/2磷酸化水平正向调节剂可以是Mek1/2蛋白和/或Erk1/2去磷酸化的抑制剂。

具体地，所述Erk1/2去磷酸化的抑制剂可以是Dusp6的抑制剂。所述Dusp6的抑制剂可以是BCI、过氧化氢、Dusp6基因沉默剂和/或NOX家族蛋白。

所述激活心脏再生的组合物可以是过氧化氢缓释剂，所述激活心脏再生的组合物可以是BCI注射剂，在心脏损伤面的细胞被激活再生能力的过程中，过氧化氢和Dusp6蛋白均集中在心脏损伤面上，所以，所述过氧化氢及BCI可以通过注射等方式，直接施用于心脏损伤面上，释放出的过氧化氢或BCI激活心脏损伤面细胞的再生能力，从而实现心脏再生。

作为本发明的另一方面，还涉及Mek蛋白、Erk1/2去磷酸化的抑制剂、过氧化氢或NOX家族蛋白在制备激活心脏再生药物中的应用。所述Erk1/2去磷酸化的抑制剂可以是Dusp6的抑制剂。所述Dusp6的抑制剂可以是BCI、过氧化氢、和/或NOX家族蛋白。

所述Dusp6基因沉默剂可以是一切可以使得Dusp6基因沉默的物质，比如可以使Dusp6基因沉默的RNA片段。

作为本发明的第三个方面，还涉及心脏损伤的治疗方法，该方法包括通过对心脏损伤患者施加Erk1/2磷酸化水平正向调节剂的步骤。

本发明至少实现了如下有益效果：

本发明通过实验发现了一条能够激活心脏再生能力的信号通路，通过对于这条信号通路上的各个环节进行调节，既可以实现对心脏再生能力的激活。通过对心脏损伤面的操作，激活心脏的再生能力，可以实现对心脏损伤的有效治疗，降低死亡率。

具体实施方式

本发明所涉及的实验材料均可以通过商业途径或通过申请人获取。

成人心脏再生能力极为有限，而成年斑马鱼在心室切除20％后仍能够完美再生。目前斑马鱼心脏再生的细胞与分子机制仍不清楚。本发明首次发现Duox产生的过氧化氢可作为一个新的信号分子，作用于心外膜和心肌细胞，促进斑马鱼心脏再生。通过体外成像技术直接检测转基因斑马鱼心脏中过氧化氢指示蛋白Hyper以及化合物Redoxsensorcc-1的信号，可观察到损伤区域心外膜与邻近心肌有高浓度过氧化氢产生，最高浓度达30μM，与duox在损伤一个月内的表达时序性高度吻合。使用Duox抑制剂DPI及apocynin抑制过氧化氢生成，或过表达过氧化氢酶以清除高浓度过氧化氢，均可显著抑制心脏再生，表明过氧化氢为心脏再生过程所必需的信号分子。

在分子机制上，高浓度过氧化氢可降解Dusp6(一种氧化敏感性磷酸酶)，从而增加Erk1/2磷酸化水平(可被FGF、PDGF等生长因子激活的MAP激酶信号通路)。更加引人注目的是，Dusp6的小分子抑制剂BCI，可在与DPI及apocynin同时作用时起到过氧化氢促进心脏再生的作用(详见实验例1)。说明Duox产生的过氧化氢通过去阻遏机制抑制Dusp6而激活MAPK通路，促进斑马鱼心脏再生。

通过在全基因组范围内寻找斑马鱼心脏再生相关基因，本发明发现39个活性氧(ROS)系统相关基因在心脏损伤7天后(7dpa)表达量发生明显变化，而此时受损心脏正处于炎症反应消退和心肌再生起始阶段。接下来选取3-30天之间心脏进行原位杂交验证。在20个候选ROS基因中，duox在再生过程中的表达空间和时序性非常重要。duox高度集中在伤口内层，手术后1-3天时，duox表达较弱，7-14天时表达量升至最高，到30天再生基本完成时则回复至较低水平(详见实验例2)。双荧光原位杂交实验表明，duox与心外膜标志物tcf21表达部位基本相同，证明duox主要表达于心外膜。因此，duox的表达时序性和定位都与心脏再生相吻合。

Duox属于NADPH氧化酶(Nox)和相关的双氧化酶(Duox)家族成员。在人类细胞中，该家族包括NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1和DUOX27个成员。nox2在1dpa、7dpa和14dpa表达也有微弱上调。

为了实体观察和追踪斑马鱼心脏再生过程中H₂O₂的动态变化情况，采用Tol2介导的转基因系统和斑马鱼myl7基因的启动子，构建心肌细胞特异性表达Hyper(一种可感应H2O2的荧光蛋白)的转基因鱼。使用激光共聚焦扫描技术对Tg(myl7：Hyper)转基因鱼成体心脏进行拍摄，并通过分别激发于488nm和405nm的荧光信号比值(R＝F488/F405)计算H₂O₂水平。通过使用表达Hyper的心脏组织(未损伤)进行活体滴定，得到H₂O₂标准曲线。与假手术(sham)对照组相比，H₂O₂浓度在3、7、14dpa的受损伤心脏中明显升高，并在30dpa再生接近完成时恢复至本底水平。由于心脏损伤1h内，Hyper荧光信号比值并未显著上升，因此与幼鱼尾鳍损伤后上皮细胞中H₂O₂诱导的迅速炎症反应不同，心脏损伤后H₂O₂诱导过程相对较慢。共聚焦图层和空间曲线显示，H₂O₂梯度范围为心外膜层至心肌层的约20μm范围内，其最高浓度达30μM。这一浓度可使H₂O₂发挥细胞内信号分子的作用。在另一独立实验中，用Redoxsensorcc-1对14dpa的Tg(myl7：Hyper)转基因斑马鱼心脏进行染色，以及用CM-H2DCFDA对14dpa的野生型斑马鱼心脏进行染色，都发现H₂O₂信号除了在邻近的致密层心肌细胞存在，在心外膜上调也很明显。因此通过遗传学方法和小分子标记物可以直观显示H₂O₂在表达duox的心外膜细胞中产生，其动态变化过程与心肌再生更为相关，而非仅是应激性炎症反应。

为了进一步探寻Duox产生的H₂O₂与心肌再生的相关性，使用两种Duox/Nox家族特异性抑制剂DPI(10μM)和apocynin(100μM)抑制心脏再生中H₂O₂的产生，并观察再生变化情况。将Tg(myl7：Hyper)转基因鱼心脏浸泡于含DPI的缓冲液中，Hyper信号在约40min内下降50％，可证明再生中H₂O₂的增加主要来自于Duox或Nox2。斑马鱼心脏切除或小鼠心梗模型中，损伤部位的部分心肌细胞可进入细胞分裂周期(损伤导致的心肌细胞增殖可用BrdU+/Mef2C+细胞进行定量)。与假手术组相比，BrdU+/Mef2C+心肌细胞在14dpa时出现于损伤部位，但在DPI或apocynin处理后明显下降。进一步发现，与DMSO对照组相比，DPI或apocynin处理后，伤口处心肌纤维化明显增加，而新生的Myl7+心肌细胞明显减少。以上结果均支持H₂O₂是心肌再生过程中的关键信号分子。

构建Tg(myl7：catalase-DsRed)转基因鱼，在心肌细胞中过表达过氧化氢酶(catalase)。与抑制剂结果类似，30dpa时，与非转基因对照组相比，新生的My17+心肌细胞明显减少，纤维化明显增加。以上结果与已知的过氧化氢酶对高浓度H₂O₂的有效清除作用相联系，表明由duox/Nox2产生的较高浓度的H₂O₂为心脏再生所必需。

持续性高浓度的H₂O₂会打破细胞内的氧化还原平衡，使细胞转变为高氧化状态，从而激活一系列氧化性敏感信号通路。本发明探究了再生过程中H2O2的特异性效应信号通路。由于FGF和PDGF通路为心脏再生所必需，本发明选择MAPK信号通路进行研究(可受多种生长因子刺激，如FGF、PDGF等)，检测其是否受H₂O₂调节。结果显示，磷酸化的ERK1/2(pERK)在3dpa、7dpa及14dpa表达上调，且pErk1/2+细胞位于心外膜。通过Tg(gata4：EGFP)转基因鱼标记再生过程中的新生心肌细胞，发现，使用U0126(Mek1/2抑制剂)下调pErk1/2水平，可显著抑制心肌细胞再生(与DMSO处理对照组相比，EGFP+细胞明显减少)。更为重要的是，pErk1/2+细胞和EGFP+细胞均受到Duox抑制剂DPI和apocynin影响而下调。以上结果表明心外膜细胞中的和依赖于H₂O₂的某些信号通路可促进心脏再生。Mek1/2可以升高ERK1/2的磷酸化水平，从而促进心脏再生。

双特异性MAPK磷酸酶Dusp6可被pErk1/2诱导产生，并通过去磷酸化使pErk1/2失活，从而成为ERK1/2的反馈抑制因子。之前研究显示，在TNFa介导的细胞死亡和卵巢癌细胞中，Dusp6蛋白可直接被H₂O₂氧化而降解，使Erk1/2活性异常增加。Dusp6基因敲除小鼠表现出心肌细胞增殖增多等表型，表明，心肌损伤诱导产生的H₂O₂可通过氧化降解Dusp6而促进有利于再生的pErk1/2表达，从而形成一个去阻遏作用。

本发明同时在mRNA和蛋白水平检测了Dusp6的表达情况。在Tg(dusp6：EGFP)转基因鱼(胚胎生长时期内源性dusp6mRNA表达状况可通过EGFP信号反映)中，14dpa时心脏损伤部位心外膜细胞有显著EGFP(dusp6mRNA)表达。而dusp6mRNA水平在7dpa时达到最高。同时，Dusp6蛋白也在7dpa和14dpa特异于心外膜表达，30dpa时明显减少。而在DPI/apocynin处理的14dpa心脏中，Dusp6蛋白水平(非mRNA水平)在心外膜和心肌细胞中同时显著增加，并出现于心肌细胞核内。这一现象表明H₂O₂在再生的心肌细胞中通过影响Dusp6蛋白稳定性而对其产生抑制作用。以上结果也证实，Dusp6mRNA和蛋白对FGF/PDGF下游的pErk1/2产生反馈抑制作用，而Duox产生的H₂O₂可通过降解Dusp6而消除这一作用。

为进一步研究心脏再生中的Duox-H₂O₂-Dusp6去阻遏机制，本发明采用Dusp6小分子抑制剂BCI抑制其活性。BCI可恢复DPI/apocynin对心脏再生的抑制作用，使受DPI/apocynin抑制而减少的BrdU+/Mef2C+心肌细胞显著增加，亦可使DPI/apocynin对myl7+心肌细胞生成的抑制作用和心肌纤维化的促进作用得到恢复。这表明内源性H₂O₂受到抑制时，BCI可发挥相似作用。结果表明，Duox-H₂O₂-Dusp6去阻遏机制通过增加ERK1/2活性，对促进心脏再生具有重要作用。

总体来说，本发明得出三个主要发现。首先，在整个损伤诱导的心脏再生过程中，Duox和Nox2产生最高浓度达30μM的H₂O₂。这些H₂O₂分布于心外膜和邻近心肌层。其次，作为信号分子，H₂O₂可以促进心脏再生，促进心肌细胞增殖并抑制纤维化。最后，H₂O₂之所以促进再生，是通过降解氧化还原敏感的磷酸酶Dusp6，从而解除对MAPK信号通路的抑制。同时，本发明发现，H₂O₂缺乏情况下，BCI是首个能促进心脏再生的小分子。

实验例1：

将TL野生型斑马鱼置于4mg/mL3-氨基苯甲酸乙酯-甲磺酸酯(购自Sigma公司，目录号E10521)溶液中麻醉，用眼科镊剖开胸腔并除去心包膜，显露心室，用显微解剖剪除去心室尖部分(约占整个心室的20％左右)，而后放回正常饲养水中。将手术后斑马鱼分为5组，分别在7-14dpa(心脏切除手术后7-14天)期间每天用胸腔注射方式给予DMSO(对照组)、10μMDPI、10μMDPI+10μMBCI、100μMapocynin、100μMapocynin+10μMBCI，并同时注射2.5mg/mLBrdU，以标记可分裂的心肌细胞。至14dpa取心脏，用4％多聚甲醛固定，并进行常规石蜡包埋切片。使用常规免疫组织化学方法标记BrdU+/Mef2C+心肌细胞(BrdU抗体购自Sigma公司，目录号B8434；Mef2c抗体购自Santacruz公司，目录号sc-313)，发现BrdU+/Mef2C+心肌细胞在14dpa时出现于损伤部位，在DPI或apocynin单独处理后明显下降，而BCI可使受DPI/apocynin抑制而减少的BrdU+/Mef2C+心肌细胞显著增加。在7-30dpa期间进行上述术后药物处理实验，30dpa取心脏固定包埋，进行AFOG染色与心肌细胞标志物Myl7+原位杂交实验，发现与DMSO对照组相比，DPI或apocynin处理后，伤口处心肌纤维化明显增加，而新生的Myl7+心肌细胞明显减少。而BCI亦可使DPI/apocynin对myl7+心肌细胞生成的抑制作用和心肌纤维化的促进作用得到明显恢复。以上结果表明，H₂O₂是心肌再生过程中的关键信号分子，而内源性H₂O₂受到抑制时，BCI可发挥相似作用以促进心脏再生。

AFOG染色实验步骤：石蜡切片脱蜡至水(二甲苯10min两次，无水乙醇3min两次，95％乙醇3min，85乙醇3min，流水冲洗后入去离子水5min)，用56℃预热的Bouin’ssolution(购自sigma公司，目录号HT10132)固定(56℃2.5小时，室温1小时)。而后流水冲洗，用1％磷钼酸(用10％磷钼酸加水稀释，原液购自sigma公司，目录号P4869)分化5分钟。流水洗后，用AFOG染色液(100mL染色液配方：1.5gacidfuchsin，购自sigma公司，目录号F8129；1gOrangeG，购自sigma公司，目录号03756；0.5ganilinblue，购自BBl公司，目录号AB0083)染色5min。流水充分冲洗，脱水(85％乙醇2min，95％乙醇2min，无水乙醇2min两次，二甲苯3min两次)，用中性树胶封片。

原位杂交实验步骤参见实验例2。

实验例2：

按实验例1中所述方法进行斑马鱼心尖切除手术与石蜡切片制备以斑马鱼duox基因序列为模板，使用T7RNA聚合酶(购自promega公司，目录号P2075)及地高辛标记单核苷酸混合物(购自Roche公司，目录号11277073910)合成duoxRNA探针。利用该探针在损伤后不同时期的斑马鱼心脏石蜡切片上进行原位杂交实验，切片经脱蜡至水、蛋白酶K消化、三乙醇胺-乙酸酐封闭等步骤后，与探针在55℃杂交过夜。之后经梯度SSC清洗、封闭等步骤后，37℃下与碱性磷酸酶标记的地高辛抗体(购自Roche公司，目录号11094273910)孵育2小时。用NBT/BClP底物(购自Roche公司，目录号11697471001)进行显色，待出现明显蓝紫色信号后，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，用中性树胶封片。结果显示duox高度集中在伤口内层，手术后1-3天时，duox表达较弱，7-14天时表达量升至最高，到30天再生基本完成时则回复至较低水平。duox的表达时序性与斑马鱼心脏再生过程高度吻合，提示其在心脏再生过程中具有重要调控作用。

实验例3：

采用Tol2介导的转基因系统(载体信息和方法见文献1)构建心肌细胞标记基因myl7启动子调控的心肌特异表达Hyper(工作原理见文献2)的转基因鱼。利用该转基因鱼进行心脏手术与H₂O₂浓度测定。斑马鱼心尖切除手术见实验例1。至预定时间取出心脏，浸泡于Tyrode’sBuffer(Tyrode’sBuffer配方：150mMNaCl，5.4mMKCl，1.5mMMgSO4，0.4mMNaH2PO4，2mMCaCl2，10mMglucose，10mMHEPES，pH7.4。所有试剂均购自sigma公司。)，去除心房使心脏停止跳动。用ZeissLSM700激光共聚焦显微镜进行实时拍摄，用405nm和488nm进行激发，计算F488/F405比值即可得到H₂O₂实时浓度。将手术后的Hyper过表达心脏浸泡于不同浓度(5，10，20，50，100and200μM)的H₂O₂中2min，利用上述方法进行测定，可得到H₂O₂活体浓度标准曲线，用于对损伤后不同时间段的心脏H₂O₂浓度进行定量。

实验例4：

采用健康成年雄性SD大鼠，体重200-250g。用4％水合氯醛(1mL/100g体重)腹腔注射进行麻醉。待大鼠完全麻醉后，仰卧固定四肢及头部于手术台上。经口气管插管，连接呼吸机，潮气量约3ml/100g，频率为73次/min。在左侧腋下和剑突连线偏上1cm做一斜切口，长度约为2.5cm，以心脏搏动最强点为中心。依次钝性分离深浅筋膜、胸大肌、前锯肌，显露肋骨，由第3、4肋间入胸(心搏最强点偏上一肋)，钝性分离肋间肌。用开胸夹将胸腔完全撑开，将棉纱放置在肺组织旁边，防止损伤肺组织。用镊子破开心包，轻挤大鼠胸廓，将心脏挤出，用液氮预冷5秒左右，直径1cm的金属探头置于左心室位置进行冷冻损伤，每次10秒，重复三次。观察1-2分钟后，彻底止血并逐层缝合关胸。待大鼠恢复自主呼吸后拔除插管。

至预定时间后，按上述方法进行麻醉。迅速取出心脏并用生理盐水洗净内外部血液，置于4％多聚甲醛中固定48h后，进行石蜡包埋切片。用Masson染色法检测心肌梗死状况。

Masson染色法：

1.组织固定于bouin氏液或zenker氏液，流水冲洗过夜，常规脱水包埋；

2.切片脱蜡至水中；

3.用weigert铁苏木素(weigert铁苏木素A、B液等比例混和)染5-10分，流水稍洗；

4.用1％盐酸酒精分化，流水冲洗数分；

5.丽春红酸性品红染液染5-10分，流水稍冲洗；

6.磷钼酸溶液处理约5分钟，不用水洗，直接用苯胺蓝人染液复染5分钟；

7.用1％冰醋酸处理1分钟，95％酒精脱水多次。

8.无水酒精脱水、二甲苯透明，中性树胶封固。

以上实验均显示，本发明所发现的信号通路，可以用于人心脏的再生调节。

已有实验表明，在斑马鱼心脏再生全过程中，duox均有上调表达，7-14dpa上调更为明显。

已有实验表明，duox与心外膜标志物tcf21表达部位基本相同，证明duox主要表达于心外膜。

已有实验表明，H₂O₂浓度在3、7、14dpa的受损伤斑马鱼心脏中明显升高，并在30dpa再生接近完成时恢复至本底水平。H₂O₂梯度范围为心外膜层至心肌层的约20μm范围内，其最高浓度达30μM。这一浓度可使H₂O₂发挥细胞内信号分子的作用。

已有实验表明，Duox/Nox家族特异性抑制剂DPl和apocynin可抑制心脏再生中H₂O₂的产生，并抑制心肌细胞增殖和增加纤维化。

已有文献表明，H₂O₂可直接氧化降解Dusp6蛋白并抑制其活性，使Erk1/2活性异常增加。

已有文献表明，Dusp6基因敲除小鼠表现出发育时期心肌细胞增殖增多、成年心梗模型中梗死面积减少等表型。已有实验表明，在大鼠心梗后，Dusp6的RNA和蛋白水平明显增加；在斑马鱼心脏损伤后过表达Dusp6可抑制心肌再生。

已有实验表明，Dusp6小分子抑制剂BCl可通过使受DPl/apocynin抑制而减少的BrdU+/Mef2C+心肌细胞显著增加，亦可使DPl/apocynin对myl7+心肌细胞生成的抑制作用和心肌纤维化的促进作用得到恢复等方面作用，可恢复DPl/apocynin对心脏再生的抑制作用。

已有实验表明，在斑马鱼心脏再生过程中，Dusp6与H₂O₂均高表达于伤口周围的心外膜细胞中。所以，所述过氧化氢缓释剂和BCl可以施用于心脏损伤面上，释放出功能性成分氢激活心脏损伤面细胞的再生能力，从而实现心脏再生。

实验例5

实验器材与动物

实验动物：健康雄性SD大鼠，体重200-250g，分为野生型与dusp6^-/-两组，每组7只。

实验器材：小动物呼吸机(KentAutomaticVentilator)，水合氯醛(上海生工)，阿托品注射液(浙江金力制药有限公司)，生理盐水，6/0带线缝合针(宁波医用缝针有限公司)，开胸夹，眼科剪，镊子，止血钳

Masson三色染色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

实验步骤

麻醉：大鼠称重后，腹腔注射10％水合氯醛(生理盐水配制，含0.02mg/mL阿托品)，用量为1mL/100g，至大鼠完全失去知觉后开始手术。

气管插管：大鼠仰卧固定于手术板上，沿颈部中线剪开皮肤，分离肌肉及甲状腺，暴露气管，用眼科剪在气管环之间剪开气管半周。将插管迅速插入并固定，打开呼吸机，根据大鼠体重设置各项具体参数(呼吸频率、潮气量及呼吸比等)，观察大鼠反应，待呼吸正常后继续实验。

开胸及冠状动脉结扎：心前区域剃毛及酒精消毒，在心脏搏动最明显处切开皮肤，逐层钝性分离胸大肌与前锯肌，显露肋骨与肋间肌。在第三肋间用眼科剪剪开肋间肌并刺破胸膜。用开胸夹撑开肋骨，显露心脏。用镊子仔细撕破心包，小心探查左心耳与肺动脉圆锥位置，在其交界处下方1-2mm处(前降支位置)用6/0缝合线穿过心肌结扎。观察5min左右，待左心室变为苍白色，且运动明显减弱，即可判定结扎成功。

关胸及术后处理：清理胸腔，轻轻挤压排出胸腔内空气。逐层关胸缝合。待大鼠恢复自主呼吸后，拔除气管插管，清理呼吸道，小心缝合气管及颈部皮肤。用医用酒精消毒手术创口，放回鼠笼饲养。

病理学检查：前降支结扎4周后处死大鼠，取出心脏，沿冠状方向切成3-4块，置于4％多聚甲醛固定过夜，进行常规石蜡包埋切片。按试剂盒说明书所述方法，对组织切片进行Masson三色染色。

实验结果

dusp6^-/-突变体大鼠在冠状动脉前降支结扎4周后，梗死面积、纤维化程度

及左心室扩张程度均明显小于同批手术的野生型大鼠。证实Dusp6蛋白的突变及失活能显著减小哺乳动物心肌梗死程度，改善心脏功能。

参考以下现有文献，将有助于更好地理解本发明。

1、Tol2系统原理、方法与载体相关信息：Kawakami，K.，Takeda，H.，Kawakami，N.，Kobayashi，M.，Matsuda，N.，andMishina，M.(2004).Atransposon-mediatedgenetrapapproachidentifiesdevelopmentallyregulatedgenesinzebrafish.DevCell7，133-144。

2、Hyper荧光蛋白工作原理：Belousov，V.V.，Fradkov，A.F.，Lukyanov/，K.A.，Staroverov，D.B.，Shakhbazov，K.S.，Terskikh，A.V.，andLukyanov，S.(2006).Geneticallyencodedfluorescentindicatorforintracellularhydrogenperoxide.NatMethods3，281-286。

3、Hyper荧光蛋白在斑马鱼尾鳍再生中的应用及Duox抑制剂DPl与apocynin的使用：Niethammer，P.，Grabher，C.，Look，A.T.，andMitchison，T.J.(2009).Atissue-scalegradientofhydrogenperoxidemediatesrapidwounddetectioninzebrafish.Nature459，996-999。

4、斑马鱼心脏再生模型的建立：Poss，K.D.，wilson，L.G.，andKeating，M.T.(2002).Heartregenerationinzebrafish.Science298，2188-2190。

5、Dusp6抑制剂BCl的工作原理与使用：Molina，G.，Vogt，A.，Bakan，A.，Dai，W.，QueirozdeOliveira，P.，Znosko，W.，Smithgall，T.E.，Bahar，l.，Lazo，J.S.，Day，B.W.，andTsang，M.(2009).ZebrafishchemicalscreeningrevealsaninhibitorofDusp6thatexpandscardiaccelllineages.NatChemBiol5，680-687。

6、Dusp6基因敲除小鼠心脏研究相关相关：Maillet，M.，Purcell，N.H.，Sargent，M.A.，York，A.J.，Bueno，O.F.，andMolkentin，J.D.(2008).DUSP6(MKP3)nullmiceshowenhancedERK1/2phosphorylationatbaselineandincreasedmyocyteproliferationintheheartaffectingdiseasesusceptibility.JBiolChem283，31246-31255。

7、H₂O₂对Dusp6氧化失活与降解机制研究相关：Kamata，H.，Honda，S.，Maeda，S.，Chang，L.，Hirata，H.，andKarin，M.(2005).ReactiveoxygenspeciespromoteTNFalpha-induceddeathandsustainedJNKactivationbyinhibitingMAPkinasephosphatases.Cell120，649-661。

Chan，D.W.，Liu，V.W.，Tsao，G.S.，Yao，K.M.，Furukawa，T.，Chan，K.K.，andNgan，H.Y.(2008).LossofMKP3mediatedbyoxidativestressenhancestumorigenicityandchemoresistanceofovariancancercells.Carcinogenesis29，1742-1750。

Dusp6-ERK作用机制相关：Owens，D.M.，Keyse，S.M.(2007).DifferentialregulationofMAPkinasesignallingbydual-specificityproteinphosphatases.Oncogene26，3203-3213。

尽管已参照优选实施例表示和描述了本发明，但本领域技术人员应该理解，在不脱离由权利要求限定的本发明的精神和范围的情况下，可以对这些实施例进行各种修改和变换。

Claims

1.一种激活心脏再生的组合物，其特征在于，所述组合物含有Erk1/2磷酸化水平正向调节剂。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述Erk1/2磷酸化水平正向调节剂是指Mek1/2蛋白和/或Erk1/2去磷酸化的抑制剂。

3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述Erk1/2去磷酸化的抑制剂是指Dusp6的抑制剂。

4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述Dusp6的抑制剂是指BCI、过氧化氢、Dusp6基因沉默剂和/或NOX家族蛋白。

5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述激活心脏再生的组合物为过氧化氢缓释剂。

6.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述激活心脏再生的组合物为BCI注射剂或口服剂。

7.Mek1/2蛋白在制备激活心脏再生药物中的应用。

8.Erk1/2去磷酸化的抑制剂在制备激活心脏再生药物中的应用。

9.过氧化氢在制备激活心脏再生药物中的应用。

10.NOX家族蛋白在制备激活心脏再生药物中的应用。