CN105002174A - 一种应用章鱼检测海水中污染物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供一种应用章鱼检测养殖水体中污染物的方法，即采用章鱼体内谷胱甘肽硫转移酶(GSTs)的含量变化来检测养殖水体中污染物的方法。本发明的方法相比目前的仪器化学方法，其检出限更低，方法更加灵敏。且验证实验室一致认为该方法准确、灵敏、操作简单、重复性好；不使用有毒的有机溶剂和标准品，对操作人员的安全更有保障，同时减少了对环境的污染；缩短了检测时间，降低了检测成本，有效地提升了实验室的检测能力。通过该项目的深入研究，可建立与国际接轨的食品安全生物检测体系。

Description

一种应用章鱼检测海水中污染物的方法

技术领域

本发明属于污染物检测技术领域，具体涉及一种应用章鱼检测海水中污染物的方法。

背景技术

水产品是海洋和淡水渔业生产的动植物的统称，如鱼类、虾类、蟹类等。我国既是水产品生产大国，同时也是消费大国。水产品的质量安全不仅关系着我国人民的生活健康，也影响着水产品行业的发展，因此对水产品的质量安全检测具有重要意义。随着农、兽药的滥用及环境污染的日益加剧，生物体持续暴露在多种污染物交叉的环境中，造成了其同时遭受多种污染的现象。目前，对水产品中有毒有害物质的常规检测是各种化学手段，但其只能针对部分有毒有害物质进行检测，并且对被生物体吸收代谢转化成的次级代谢产物无法检测，同时还可能由于漏检某种有毒有害物质而产生严重后果。

发明内容

本发明的目的是提供一种应用章鱼检测养殖水体中污染物的方法，即采用章鱼体内谷胱甘肽硫转移酶(GSTs)的含量变化来检测养殖水体中污染物的方法。

本发明首先提供一种用于检测章鱼体内谷胱甘肽硫转移酶的荧光定量PCR引物，所述的引物的序列信息如下：

正向引物Z1：gtctactggtaccggctagac(SEQ ID NO:1)、

反向引物Z2：acttaagctcgagccatc(SEQ ID NO:2)、

为了提高检测的灵敏度，正向引物的序列改造为gtctactggtaccagcacgac(SEQID NO:3)；

本发明还提供用于作为荧光定量PCR的内参引物，序列信息如下：

正向引物ZG1：tctcctcacagaagctccactc(SEQ ID NO:4)、

反向引物ZG2：cgaccagccaagtccaacg(SEQ ID NO:5)；

本发明还提供一种检测海水养殖水体中污染物的方法，包括如下的步骤：

1)从待检测水体中养殖的章鱼肝脏组织中提取RNA，然后以提取的RNA为模板，反转录合成cDNA；

2)用引物对步骤1)反转录合成cDNA进行荧光定量PCR检测，

3)通过对谷胱甘肽硫转移酶基因表达量的变化进行对比分析。

所述的污染物，可以是农兽药、PAH、PCB、毒素、重金属、环境内分泌物。

更具体的，所述的污染物为孔雀石绿、溴氰菊酯、多氯联苯。

本发明的方法相比目前的仪器化学方法，其检出限更低，方法更加灵敏。且验证实验室一致认为该方法准确、灵敏、操作简单、重复性好；不使用有毒的有机溶剂和标准品，对操作人员的安全更有保障，同时减少了对环境的污染；缩短了检测时间，降低了检测成本，有效地提升了实验室的检测能力。通过该项目的深入研究，可建立与国际接轨的食品安全生物检测体系。

附图说明

图1：章鱼在受到孔雀石绿污染时GSTs基因表达量随孔雀石绿浓度变化的表达图。经查阅文献得知，水中孔雀石绿在0.03mg/L就就有较好的杀菌效果，因此，本实验组的给药浓度依次设定为5、10、20、30和40μg/L，对照组为同样条件下不添加孔雀石绿养殖的章鱼。由图可知，随着给药浓度的增大，章鱼GSTs基因相对表达量也随之明显增加，仅在5μg/L浓度时其相对表达量就达1.3倍，变化明显；其在在30μg/L和40μg/L浓度时相对表达量持平，说明酶的表达在高浓度孔雀石绿中可能会受到抑制。

图2：章鱼在受到溴氰菊酯污染时GSTs基因表达量随溴氰菊酯浓度变化的表达图。经查阅相关资料，实验组在溴氰菊酯经口给药浓度10mg/L时，72h后，鲢鱼死亡，本实验选定在养殖水体中溴氰菊酯的给药浓度分别选择了1、2、4、6和8mg/L，对照组为同样条件下不添加溴氰菊酯养殖的章鱼。由图看出：随着给药浓度的增大，章鱼GSTs基因相对表达量也随之增加，并表现出对溴氰菊酯敏感，其GSTs基因相对表达量在8mg/L时高了1.7倍多；其在6mg/L和8mg/L浓度时表达量趋于平稳，说明该酶在这个浓度下开始趋于饱和。

图3：章鱼在受到多氯联苯污染时GSTs基因表达量随多氯联苯浓度变化的表达图。经过文献查阅，鱼的LD50为PCBs 1-10μg/kg，96h；5μg/L，45d。本实验选定了在养殖水体中的给药浓度分别为0.1、0.5、1和2μg/L，对照组为同样条件下不添加多氯联苯养殖的章鱼。由图看出：随着给药浓度的增大，GSTs基因相对表达量也随之增加，其中，在PCBs浓度达2μg/L时，章鱼高了3.2倍；尤其值得一提的是，在PCBs浓度为0.1μg/L时，鲢鱼中GSTs基因相对表达量时就高了1.7倍，这说明鲢鱼的GSTs对PCBs的诱导反应很敏感，GSTs非常适合作为一种生物标志物来监测环境中PCBs存在情况。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的描述

实施例1

1、从章鱼肝脏组织中提取RNA，然后以提取的RNA为模板，反转录合成cDNA；

材料：

章鱼肝脏；RNA提取试剂盒，RNAprep pure Tissue Kit，Tiangen；反转录Prime Script RT试剂盒：TaKaRa，日本；移液器；一次性注射器；方盘；镊子；手术剪；培养皿；1.5mL离心管。

试剂材料

95％的RNase-free乙醇；0.1％DEPC处理水；SV RNA Lysis Buffer；SV RNAdilution Buffer；SV RNAWash Solution；Yellow core Buffer；MnCl₂ 0.09M；DNaseⅠ；SV DNase Stop Solution；Nuclease-Free water；琼脂糖；10×TAE电泳缓冲液(40m MTris，20mM NaAc，1mM EDTAPH 8.0)；载体缓冲液(0.25％溴酚蓝，30％甘油)；溴化乙锭水溶液(10mg/mL)。

由于RNA容易被降解，整个提取过程中要严格防止RNA酶的污染。提取过程用到的玻璃容器、EP管等样品需要用0.1％(v/v)焦碳酸二乙酯(DEPC:diethypyrocarbonate)浸泡处理。实验中用的微量移液器需要用75％的消毒酒精对表面进行消毒，超净台也要擦拭干净，用消毒酒精消毒后，进行紫外灭菌30min以上。提取过程中，要带口罩和一次性PE手套，实验过程需要勤换手套，严防RNA酶污染。

肝脏中RNA的提取

本次实验采用天根生化科技有限公司的RNAprep pure动物组织总RNA提取试剂盒，对章鱼的肝脏RNA提取。

具体步骤如下：

(1)分离章鱼的肝脏组织，分别取50mg样品于离心管中，加入175μl SV RNALysis Buffer，用一次性注射器将组织压碎、反复抽打混匀。

(2)加350μl SV RNA Dilution Buffer(蓝色)，翻转管子3-4次混匀，置70℃水浴3min。

(3)冰上冷却1-2秒，14000rpm离心10min，上清液移入一新离心管。

(4)加入200μl 95％的乙醇，枪头混匀。

(5)将上述混合液移入Spin Basket Assembly，14000rpm离心1min，弃滤液。

(6)加入600μl SV RNA Wash Solution(with ethand added)，14000rpm离心1min，弃滤液。

(7)在一新离心管中配制DNase incubation mix：

Yellow Core Buffer   40μl

MnCl₂0.09M   5μl

DNase Ⅰ   5μl

(8)将上述50μl混合液直接加在Spin Basket的膜上，室温(20-25℃)保育15min。

(9)加200μl SV DNase Stop Solution(with ethand added)至Spin Basket14000rpm，离心1min。

(10)加600μl SV RNA Wash Solution，14000rpm离心1min，弃滤液。

(11)加250μl SV RNA Wash Solution，14000rpm离心2min，将Spin Basket转移到一新离心管中。

(12)加50μl Nuclease-Free Water至膜上，14000rpm离心1min，溶解RNA，-80℃保存。

(13)取5μl RNA样品，1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。

2、RNA质量检测

琼脂糖凝胶电泳测定

(1)将制胶用具用70％乙醇冲冼一遍，晾干备用。

(2)配制琼脂糖凝胶：

称取0.5g琼脂糖，置干净的100ml锥形瓶中，加入40ml蒸馏水，微波炉内加热使琼脂糖彻底溶化均匀。待胶凉至60-70℃，依次向其中加入9mL甲醛、5ml 10x MOPS缓冲液和0.5μL溴化乙锭，混合均匀。

(3)准备RNA样品

取DEPC处理过的500μL小离心管，依次加入如下试剂：10x MOPS缓冲液2uL，甲醛3.5μL,甲酰胺(去离子)10μL，RNA样品4.5μL,混匀。将离心管置于60℃水浴中保10分钟，再置冰上2分钟。向管中加入3μL上样染料，混匀。

(3)上样，电泳；电泳条件为0.5×TAE电泳缓冲液、琼脂糖1.2％、150V，15min。因为细胞中的RNA主要是rRNA，其含量为70％～80％，所以电泳检测到的主要是rRNA条带。电泳结果表明rRNA条带非常明显，28S rRNA条带和18S rRNA条带亮度很清楚，而5.8S rRNA条带则相对较弱，且在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。电泳检测说明提取的RNA完整性较好。

利用紫外分光光度计检测了提取RNA的纯度。一般来讲，检测RNA的纯度可以通过OD_260nm/OD_280nm比值来反映，高质量RNA的OD_260nm/OD_280nm比值在1.8～2.1之间，而比值较小则提取的RNA不纯，表明有蛋白质的污染。测定结果表明，提取的RNA的OD_260nm/OD_280nm为1.9，表明RNA纯度较好。

3、反转录合成cDNA

1)以提取的mRNA为模板，利用反转录Prime Script RT试剂盒反转录合成cDNA。

构建10μL的反应体系：

轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

反转录程序为：37℃，15min进行反转录，85℃，5s灭活酶反应。制备的cDNA放置于-80℃冰箱保存。

2)引物设计

通过NCBI获得不同来源章鱼的谷胱甘肽S转移酶(GSTs)基因序列，利用序列分析软件Clustal X进行同源性比较，在同源性最高的区域设计PCR扩增用引物，并利用Primer Premier 5.0生物软件中的引物分析功能对所设计引物进行各项参数的具体分析，最终确定本发明扩增用的引物组，并进一步以其为核心制备检测试剂盒。而且，为了防止假阴性，选用基因表达水平受环境因素影响较小的β-actin基因作为内参。β-actin基因在个体各个生长阶段的大多数几乎全部组织中持续表达或变化很小，这种管家基因的表达只受启动序列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制调节。所以，选择β-actin的基因作为荧光定量PCR的内参。

所设计的引物的序列信息如下：

正向引物Z1：gtctactggtaccggctagac(SEQ ID NO:1)、

反向引物Z2：acttaagctcgagccatc(SEQ ID NO:2)、

本发明还提供用于作为荧光定量PCR的内参引物，序列信息如下：

正向引物ZG1：tctcctcacagaagctccactc(SEQ ID NO:4)、

反向引物ZG2：cgaccagccaagtccaacg(SEQ ID NO:5)；

3)荧光定量PCR检测引物的效果

利用SYBR Green PCR Master Mix(Tiangen)试剂盒，在ABI 7500 System上进行荧光定量PCR。

反应体系为：

轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

PCR反应条件

将配制好的β-actin内参和待测样品的PCR反应溶液置于PCR仪上进行扩增反应。每个样品放3个孔，目的基因和内参基因同时扩增。采用两步法进行荧光定量PCR：95℃预变性10min；95℃ 30s、60℃ 30s，40个循环。反应结束后进行溶解曲线分析，从而检验退火温度是否适宜，产物中是否含有引物二聚体。得到扩增曲线。结果表明扩增曲线的整体平行性较好，曲线拐点清楚，基线平而无上扬现象。各管的扩增曲线平行性较好，表明扩增效率相近，可以用来进行荧光定量PCR，分析基因的表达水平。

扩增溶解曲线反映出实时荧光定量PCR的扩增特异性，如果每条溶解曲线只有一个峰，表明扩增的特异性较好，如果有两个或者多个峰，则表明荧光定量PCR过程中存在非特异扩增。扩增结果表明基因的溶解曲线的只有一个峰，这表明基因的特异性扩增效果较好，可以用来进行荧光定量PCR，分析基因的表达水平。

对引物的灵敏度进行了检测，具体步骤如下：

1)将制备好的cDNA分别稀释成100ng/μL、50ng/μl和10ng/μL。

2)构建50μL PCR反应体系，分别以100ng、50ng和10ng为模板进行反应，电泳检测。

3)电泳结果发现：cDNA模板浓度为100ng、50ng和10ng的电泳扩增条带清晰，且电泳图下方没有二聚体出现，说明该实验设计的引物灵敏度和特异性都很好，能够很好的满足实验要求。

4)引物的优化

为了提高检测的灵敏度，将GSTs正向引物L1的个别碱基进行修改优化后，得到了新的引物序列gtctactggtaccagcacgac(SEQ ID NO:3)；按照上述的特异性和灵敏性检测步骤进行对比分析，结果发现：相比于未优化前的引物扩增10ngcDNA模板，扩增条带更清晰明显。而且，在同样条件下，优化前的引物并不能从浓度5ng的cDNA样品中扩增出产物，而优化后的产物能扩增出最低浓度为5ng的cDNA样品，且没有引物二聚体的出现，说明优化后的引物能够显著提高灵敏度，且特异性没有收到任何影响。

实施例2对孔雀石绿的检测

孔雀石绿具有高毒素、高残留和致癌、致畸、致突变等副作用，在动物体内能长期残留，通过代谢进入人和动物的机体后，可以通过生物转化，还原代谢成为脂溶性的无色孔雀石绿，严重危害人类健康。许多国家都将孔雀石绿列为水产养殖禁用药物。1992年，加拿大就禁止其作为渔场杀菌剂。美国规定在食用水产品中禁止检出孔雀石绿和无色孔雀石绿。2002年6月，欧盟颁布法令禁止在渔场中使用孔雀石绿。英国食品标准局认为孔雀石绿是一种对人体有极大副作用的化学制剂，任何鱼类都不允许含有此类物质，并且这种化学物质不应该出现在任何食品中。2002年5月，我国农业部已将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》，孔雀石绿在水生食品动物中被禁止使用。

将章鱼暴露于5、10、20、30和40μg/L不同浓度的孔雀石绿中，其在72h内GSTs相对表达量增长较快，而在72h之后表达量增长缓慢，相对平稳，可能与孔雀石绿已经降解有关。

本例实施了其GSTs基因转录表达的情况与液相色谱质谱检测孔雀石绿含量的结果比较。

在5μg/L孔雀石绿浓度下，其GSTs基因表达已有显著增高，随着孔雀石绿浓度增高，GSTs表达量也随之增高，而在5μg/L这个浓度下，采用液相色谱-质谱的检测方法(《GB/T 19857-2005水产品中孔雀石绿和结晶紫残留的测定》)结果显示，在同样条件下，章鱼中并未检测到孔雀石绿的存在，原因是孔雀石绿残留在体内的含量不足以检出(孔雀石绿的液相色谱-质谱检测限为0.1μg/L)。在20μg/L孔雀石绿浓度下，章鱼肉中孔雀石绿的含量检测结果仅为2.2ppb，而GSTs基因的表达显著提高，增量接近1.5倍(如图1)。由此看见，针对水产品中的孔雀石绿来讲，本发明方法的灵敏度要高于化学检测方法。

实施例3：暴露于溴氰菊酯中的检测

以溴氰菊酯为代表的拟除虫菊酯类农药对鱼高毒，因此在我国有相关的规定，菊酯类农药禁止在水田中使用，但菊酯类农药的使用，通过环境的转移，水环境不可避免地受到农药的影响和危害，对水产品造成污染。

将章鱼暴露于1、2、4、6和8mg/L不同浓度的溴氰菊酯中，其在72h内GSTs相对表达量增长较快，而在72h之后表达量增长缓慢，相对平稳，可能在溴氰菊酯的诱导下该酶和底物的结合开始趋于饱和。

本例实施了其GSTs基因转录表达的情况与气相色谱质谱检测溴氰菊酯含量的结果比较。

在1mg/L溴氰菊酯浓度下，其GSTs基因表达已有显著增高，随着溴氰菊酯浓度增高，GSTs表达量也随之增高，在8mg/L时其相对表达量已高达1.7倍之多(如图2)；而在1mg/L这个浓度下，采用《SFB/T 0120-2006食品中251种农药残留测定方法气相色谱法-质谱检测法》结果显示，在同样条件下，章鱼中并未检测到溴氰菊酯的存在，原因是溴氰菊酯残留在体内的含量不足以检出(溴氰菊酯的气相色谱-质谱检测限为10μg/L)。在4mg/L溴氰菊酯浓度下，章鱼肉中溴氰菊酯的检测含量仅为26.9μg/L，而GSTs基因的表达显著提高，增量约为1.4倍。由此看见，针对水产品中的溴氰菊酯来讲，本发明方法的灵敏度要高于化学检测方法。

实施例4对多氯联苯的检测

多氯联苯是首批列入“关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约“(简称《斯德哥尔摩公约》或《POPs公约》)受控名单的12种持久性有机污染物(POPs)之一。自上世纪70年代起世界各国规定禁止生产和使用PCBs，但它与常规污染物不同，其化学性质很稳定，在自然界中难于降解，多存在于土壤、河流底泥中，其持久性的存在长期对水产品造成污染，对人类的主要危害是会引起癌变或畸变。

将章鱼暴露于0.1、0.5、1和2μg/L不同浓度的多氯联苯中，其在120h之内一直呈现上升趋势，尤其是在96h后，GSTs表达急剧增多，说明PCBs一直在诱导GSTs表达，其在体内蓄积并难以代谢，导致其GSTs酶一直处于超表达状态。

本例实施了其GSTs基因转录表达的情况与气相色谱质谱检测多氯联苯含量的结果比较。

在0.1μg/L多氯联苯浓度下，其GSTs基因表达已有显著提高至1.7倍，随着多氯联苯浓度增高，GSTs表达量也随之增高，在2μg/L时其相对表达量已高达3.2倍之多(如图3)；而在0.1μg/L这个浓度下，采用《GB/T 5009.190-2006食品中指示性多氯联苯含量的测定》结果显示，以PCB180为例，在同样条件下，章鱼肉中PCB180也有检出，但浓度很低(多氯联苯的气相色谱-质谱检测限为0.05μg/L)；在1μg/L的PCBs浓度下，章鱼肉中PCB180的检测含量仅为1.34μg/L，而GSTs基因的表达显著提高，增量为2.8倍。

由此可见，章鱼的GSTs对PCBs的诱导反应很敏感，GSTs非常适合作为一种生物标志物来监测环境中PCBs存在情况，本发明方法的灵敏度要高于化学检测方法。

在送检章鱼样品中，实验室按照GB/T 5009.190-2006方法检测，检出章鱼肉中多氯联苯含量为1.26ppb；采用GSTs基因转录表达差异的方法，发现其GSTs基因的表达量是阴性样品GSTs基因的2.9倍，差异显著，判断为受污染样品。本方法应用于实验室的实际检测完全可行，且灵敏度更高，不会受到基质的干扰。

Claims (7)

1.一种用于检测章鱼谷胱甘肽硫转移酶的引物，其特征在于，所述的引物的上游引物和下游引物的序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。

2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述的上游引物的序列为SEQID NO:5。

3.一种用于作为章鱼基因表达的内参引物，其特征在于，所述的引物的上游引物和下游引物的序列分别为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4。

4.一种检测养殖水体中污染物的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：

1)从章鱼肝脏组织中提取RNA，然后以提取的RNA为模板，反转录合成cDNA；

2)用引物对步骤1)反转录合成cDNA进行荧光定量PCR检测，所述的引物为权利要求1所述的上游引物和下游引物，权利要求3所述的内参引物；

3)以通过谷胱甘肽硫转移酶基因表达量的变化进行对比分析。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的引物为权利要求1所述的下游引物、权利要求2所述的上游引物和权利要求3所述的内参引物。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的污染物为农兽药、PAH、PCB、毒素、重金属或环境内分泌物。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的污染物为孔雀石绿、溴氰菊酯或多氯联苯。