CN104971348A - 自噬抑制剂与天冬酰胺酶组合物及其在制备肿瘤增效药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属生物制药领域，涉及治疗肿瘤的药物组合物，具体涉及自噬抑制剂与天冬酰胺酶组合物及其在制备肿瘤增效药物中的用途。本发明的组合药物包含一种或多种细胞自噬抑制剂与天冬酰胺酶活性组份，其特点在于，细胞自噬抑制剂自身无明显细胞毒性但能通过抑制细胞自噬增强天冬酰胺酶的疗效，从而降低天冬酰胺酶在治疗肿瘤时的用量，减少其潜在的副作用和降低治疗成本。本发明的药物组合物通过联合给药或是序贯给药，能增强天冬酰胺酶的抗肿瘤疗效。本发明优选增加白血病细胞对天冬酰胺酶的敏感性。

Description

自噬抑制剂与天冬酰胺酶组合物及其在制备肿瘤增效药物中的用途

技术领域

本发明属生物制药领域，涉及治疗肿瘤的药物组合物，具体涉及自噬抑制剂与天冬酰胺酶组合物及其在制备肿瘤增效药物中的用途

背景技术

天冬酰胺酶(Asparaginase)是主要用于治疗白血病、淋巴瘤、黑色素瘤等的药物，1953年，Kidd首次发现豚鼠血清有抗癌作用，1961年Broom证实豚鼠血清中的抗肿瘤因子是天冬酰胺酶，[Broom JD.Dvidence that the L-asparaginase activity of guinea pig serum isresponsible for its antilymphomas effects.Nature.1961;19:114.]；有研究利用大肠杆菌、欧文菌等继续开发发酵法生产之。研究显示，天冬酰胺酶治疗肿瘤的作用机制是其在机体内可催化天冬酰胺的水解，生成天冬氨酸和氨，在大量的白血病病人中，正常细胞自身能合成天冬酰胺，而肿瘤细胞必须依赖外源性的天冬酰胺才能生存，天冬酰胺酶将外源性的天冬酰胺降解掉，从而消耗肿瘤细胞合成蛋白质所必需的底物，快速抑制蛋白质合成，而不影响正常细胞。[Labrou NE,Papageorgiou AC,Avramis VI.Structure-function relationships andclinical applications of L-asparaginases.Curr Med Chem.2010;17(20):2183-2195.]

白血病(Leukemia)，是发生于造血器官，以血液和骨髓中的白细胞及其前体细胞的增殖和发育异常的一种进行性恶性疾病，其在儿童的发病率较高，严重威胁儿童生命和。通常白血病分为四种类型：急性淋巴细胞白血病（ALL）、急性髓性白血病（AML）、慢性淋巴细胞性白血病（CLL）、慢性髓性白血病（CML）。[Rebecca SY WONG,Soon-KengCHEONG.Leukaemic stem cells:Drug resistance,metastasis and therapeutic implications.Malaysian JPathol.2012;34(2):77–88.]，据调查，世界上白血病年发病人数达30余万人，我国大约每年有3至4万人发病，是我国10大高发肿瘤之一。白血病的发病原因有，外部的环境因素如辐射、有机溶剂、氧化型染发剂、装修污染、药物与农药、生活习惯、生物因素以及内部的自身因素如肥胖、遗传因素。[C Badaloni,A Ranucci,G Cesaroni,et al.Air pollutionand childhood leukaemia:a nationwide case-control study in Italy.Occup Environ Med.2013;70:876-883.]目前的治疗方法有化疗，基因治疗和骨髓移植。

研究显示，在白血病的治疗过程中，天冬酰胺酶能够在体内外降解天冬酰胺，导致天冬酰胺依赖的白血病细胞死亡，而对正常细胞无影响，因此，天冬酰胺酶是一种有很大应用前景的蛋白质类药物。同时天冬酰胺酶的毒副作用是不容忽视的问题，在服用天冬酰胺酶的过程中，会产生过敏反应、低蛋白血症，并且应用天冬酰胺酶后会产生一定程度的耐受性，在一些肿瘤患者中，高表达一些蛋白酶体，可以降解天冬酰胺酶，使药物失效，使肿瘤细胞“逃脱”死亡。[Naina Patel,Shekhar Krishnan,et al A dyad of lymphoblasticlysosomal cysteine proteases degrades the antileukemic drug l-asparaginase.J.Clin.Invest.2009;119:1964–1973.]因此，适当的降低药物的浓度，同时保证其原有的药效是应用天冬酰胺酶治疗肿瘤问题的关键。

天冬酰胺酶在杀伤肿瘤细胞过程中主要通过消耗肿瘤细胞合成蛋白质所必需的底物，使肿瘤细胞的营养缺乏，可能会诱导细胞产生自噬作为一种保护机制来抵抗外界的“饥饿”，Minshu Yu等在天冬酰胺酶治疗卵巢癌时发现了与自噬相关的Atg12、Beclin1的表达增加及LC3的剪切，即发生了细胞自噬。[Minshu Yu,Ryan Henning,Amanda Walker,etal.L-asparaginase inhibits invasive and angiogenic activity and induces autophagy in ovarian cancer.J.Cell.Mol.Med.2012;16(10):2369-2378.]由此，研究人员认为天冬酰胺酶在治疗白血病细胞中可能也会产生自噬，且自噬在其中的作用可能直接影响其在治疗过程的药效，因此确定自噬在此过程中的作用为将来临床治疗中加强天冬酰胺酶的药效，降低用药量，降低毒副作用打下坚实的基础。

细胞自噬（autophagy）又叫Ⅱ型程序性死亡（typeⅡprogrammed cell death)，是真核生物体内常见的“自我消化”（cellular degradation）的现象，能分解细胞内受损或多余的细胞器和蛋白产生核苷酸，氨基酸等小分子物质供细胞合成新的蛋白质，并能维持细胞内微环境的稳定。近年来研究显示其与多种疾病，尤其是肿瘤的发展关系密切。根据细胞内底物运送到溶酶体腔内方式的不同，哺乳动物细胞自噬可分为三种方式：大自噬（macroautophagy）、小自噬（microautophagy）和分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediated autophagy,CMA）。主要概述的大自噬（以下简称自噬）与肿瘤发展及治疗关系最为密切。[Sridhar S,Botbol Y,Macian F,et al.Autophagy and disease:always two sides to a problem.J Pathol.2012;226(2):255-73.]自噬是胞浆大分子物质和细胞器在双层膜包囊泡中大量降解的生物学过程。该过程分为4个阶段：1、在饥饿、缺氧、药物干扰等某些因素的刺激下，自噬泡的双层膜结构开始逐渐形成并包围在被降解物的周围。2、自噬泡完全成型并将要被降解的物质完全隔离于细胞质。3、自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体。4、自噬溶酶体最终被溶酶体中的水解酶溶解，降解产物可以在细胞内再循环利用。[Martínez-Borra J,López-Larrea C.Autophagy and self-defense.Adv Exp Med Biol.2012;738:169-84.]自噬能对细胞对外部环境改变及各种刺激产生应激反应。细胞在生长条件下能发生较低水平的自噬，称基础自噬。然而，一旦受到外界的刺激，如饥饿、缺氧、高温、高细胞密度或是生长因子剥夺等，细胞自噬的水平将会迅速上调。如在营养物质缺乏的情况下，细胞自噬能分解体内坏死细胞器产生氨基酸等供细胞合成新的蛋白质，维持细胞的存活。[①Piacentini M,D'Eletto M,Falasca L,et al.Transglutaminase2at the crossroads between cell death and survival.Adv Enzymol RelatAreas Mol Biol.2011;78:197-246；②Cook KL,Shajahan AN,Clarke R.Autophagy andendocrine resistance in breast cancer.Expert Rev Anticancer Ther.2011;11(8):1283-94.；③Wirawan E,Vanden Berghe T,Lippens S,et al.Autophagy:for better or for worse.CellRes.2012;22(1):43-61.]

自噬能降解折叠错误的蛋白质、损伤的细胞器等，延缓机体衰老的发生。研究表明，大量衰老性疾病，如神经退行性疾病和恶性肿瘤都与细胞自噬密切相关。

[①Martínez-Borra J,López-Larrea C.Autophagy and self-defense.Adv Exp MedBiol.2012;738:169-84.；②Caballero B,Coto-Montes A.An insight into the roleof autophagy in cell responses in the aging and neurodegenerative brain.Histol Histopathol.2012;27(3):263-75.；③Mendelsohn AR,Larrick JW.Rapamycin as an antiagingtherapeutic?:targeting mammalian target of rapamycin to treat Hutchinson-Gilford progeriaand neurodegenerative diseases.Rejuvenation Res.2011;14(4):437-41.]

细胞自噬在生物体的发育和分化过程中起了重要作用。据报道，自噬基因缺失或者突变的线虫生长发育缺陷、衰老加速并缩短寿命；并且自噬也参与果蝇变态的发生。此外自噬在哺乳动物成年个体组织器官发育和分化中也起了重要作用。[MizushimaN,Komatsu M.Autophagy:renovation of cells and tissues.Cell.2011;147(4):728-41.]

作为程序性细胞死亡的一种，细胞自噬能通过多种途径直接或是间接导致细胞死亡。[Denton D,Nicolson S,Kumar S.Cell death by autophagy:facts and apparent artefacts.Cell Death Differ.2012;19(1):87-95.]细胞在一些特定的条件下，由于一系列因素的影响导致了各类基因突变从而导致的细胞各类遗传性状及功能改变。这类改变可能将具有正常功能和特性的细胞转变为具有分裂迅速、抗凋亡等恶性特征的细胞即癌细胞。研究表明，肿瘤的发生与发展和自噬的关系极为密切。

一般来说，由于细胞自噬有利于细胞的存活，因此无论在正常细胞或是肿瘤细胞中，自噬都普遍被保留下来，并且在一般情况下都维持着基础自噬。但是自噬究竟是抑制还是促进肿瘤细胞的发生发展目前尚没有定论。自噬初期可以作为肿瘤发生的一种抑制因素，一些已知的肿瘤抑制因子，例如PTEN、TSC1和TSC2能激活自噬，并且对自噬的抑制可使蛋白降解减少，合成代谢增加，最终导致原癌细胞持续增殖。大多数肿瘤细胞(如肝、胰腺、乳腺癌等)尽管癌变前自噬能力各有不同，但是在癌变之后其自噬能力均减弱。自噬缺乏可引起自噬底物p62积聚，通过NF-κB信号途径引起肿瘤形成。

[Trocoli A,Djavaheri-Mergny M.The complex interplay between autophagy and NF-κBsignaling pathways in cancer cells.Am J Cancer Res.2011;1(5):629-49.]然而在肿瘤生长到一定程度时，尤其是当肿瘤内还没有形成足够的血管为其扩增提供营养时，肿瘤细胞也可以通过自噬来克服营养缺乏和低氧的环境得以生存。研究表明，在缺乏血清或氨基酸的情况下约3h，HeLa细胞中的自噬部分从4%上升到37%。这也说明了在营养缺乏等条件下自噬也是肿瘤细胞的一种自我保护的机制。[Baldwin AS.Regulation of cell deathand autophagy by IKK and NF-κB:critical mechanisms in immune function and cancer.Immunol Rev.2012;246(1):327-45.]

抗肿瘤药物诱导的肿瘤细胞自噬所体现的作用大致可以概括为两种：大部分情况下是对肿瘤细胞的保护，某些情况下也能对肿瘤细胞进行杀伤。研究表明化疗药物5-FU以及单克隆抗体药物曲妥珠单抗（Trastuzumab）和西妥昔单抗（Cetuximab）均能显著地诱导细胞自噬，且抑制由这3种药物产生的细胞自噬能显著增加肿瘤细胞对治疗的敏感性,[①Vazquez-Martin A,Oliveras-Ferraros C,Menendez JA.Autophagy Facilitates theDevelopment of Breast Cancer Resistance to the Anti-HER2Monoclonal AntibodyTrastuzumab.PLoS One.2009;4(7):e6251；②Li J,Hou N,Faried A,Tsutsumi S,et al.Inhibition of Autophagy by3-MA Enhances the Effect of5-FU-Induced Apoptosis in ColonCancer Cells.Ann Surg Oncol.2009;16(3):761–771.]经文献检索等，到目前为止，尚未见有关天冬酰胺酶诱导肿瘤细胞自噬以及细胞自噬抑制剂与天冬酰胺酶联合用于制备用于增强天冬酰胺酶对肿瘤的治疗效果的药物组合物的报道。

发明内容

本发明的目的是提供自噬抑制剂与天冬酰胺酶组合物及其在制备肿瘤增效药物中的用途

本发明的组合药物，其包含一种或多种细胞自噬抑制剂与天冬酰胺酶活性组份，其特点在于，细胞自噬抑制剂自身无明显细胞毒性但能通过抑制细胞自噬增强天冬酰胺酶的疗效，从而降低天冬酰胺酶在治疗肿瘤时的用量，减少其潜在的副作用和降低治疗成本。

更具体的，本发明中，将一种或多种细胞自噬抑制剂和一种或多种天冬酰胺酶的活性组份联合用于制备用于增强天冬酰胺酶对肿瘤的治疗效果的药物组合物，其中，在联用药物中，通过抑制天冬酰胺酶诱导的肿瘤细胞的细胞自噬而抵消肿瘤由于细胞自噬而引起的作用。

本发明中，所述的细胞自噬抑制剂选自3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine）、渥曼青霉素（wortmannin）、LY294002、放线菌酮、巴法洛霉素A1（Bafilomycin A1）、NH4Cl、氯喹（Chloroquine）或羟基氯喹（hydroxychloroquine）；更优选的，所述的细胞自噬抑制剂选自3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine）、氯喹（Chloroquine）或羟基氯喹（Hydroxychloroquine）。

本发明中，所述的天冬酰胺酶选自欧文菌属天冬酰胺酶、大肠埃希菌属天冬酰胺酶、胡萝卜软腐欧文菌属天冬酰胺酶、重组天冬酰胺酶或聚乙二醇修饰的重组人天冬酰胺酶。

本发明中，所述的活性组份序贯使用。

本发明中，所述的药物组合物制成固体、溶液、分散剂、胶束、乳剂、脂质体或纳米微球。

本发明中，所述的肿瘤是白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、卵巢癌、肝癌、肺癌或乳腺癌；更优选的，所述的肿瘤是白血病、淋巴瘤包括霍奇金病淋巴瘤（HD）或非霍奇金病淋巴瘤（NDL），或黑色素瘤。

本发明经实验证实，细胞自噬在天冬酰胺酶对白血病的治疗过程中对天冬酰胺酶有抵抗作用；并且使用细胞自噬抑制剂能加强天冬酰胺酶对白血病的疗效。

本发明基于目前主要用于肿瘤治疗的化疗药物大多产生耐药性及对患者有较强的副作用，而近年来的生物大分子药物具有高靶向性、高效、低毒副作用等优点，虽然天冬酰胺酶的抗肿瘤作用得到了广泛的论证，但其在体内存在若干潜在的毒副作用，因此本发明提供了能加强其活性而降低其用量和毒副作用的由一种或者几种自噬抑制剂与天冬酰胺酶制成药物组合物，通过联合给药或是序贯给药，从而加强了天冬酰胺酶的抗肿瘤疗效。本发明优选的实验例显示，天冬酰胺酶能显著诱导白血病细胞发生细胞自噬，而细胞自噬则会部分抵消天冬酰胺酶的抗肿瘤效果，通过使用细胞自噬抑制剂抑制细胞自噬能增加白血病细胞对天冬酰胺酶的敏感性，从而增强天冬酰胺酶的疗效。

本发明的一种或多种细胞自噬抑制剂与天冬酰胺酶制成复方药物、组合物联合给药或是序贯使用能增强天冬酰胺酶对肿瘤的杀伤作用，增强天冬酰胺酶的疗效，进一步为临床实践提供了新的肿瘤治疗技术。

附图说明

图1显示了天冬酰胺酶能诱导K562细胞发生细胞自噬情况，

其中，图1A显示了给药组细胞内有大量的典型的双层膜结构自噬体，图1B显示给药组细胞内有大量的荧光斑点，而对照组较少；图1C显示，与对照组相比，给予天冬酰胺酶组的K562细胞的LC3Ⅱ的表达水平增强。

图2显示抑制自噬能增强天冬酰胺酶诱导的K562细胞死亡，

图3显示抑制细胞自噬后细胞内相关蛋白的表达水平检测结果，

其中，图3A显示了经过10μmol/L LY294002和0.5IU/ml天冬酰胺酶处理后的K562细胞的LC3Ⅱ的表达量低于0.5IU/ml天冬酰胺酶处理后的K562细胞；

图3B显示了经过0.5IU/ml天冬酰胺酶和10μmol/L的CQ处理后的K562细胞的LC3Ⅱ的表达量高于0.5IU/ml天冬酰胺酶处理后的K562细胞；

图3C显示了经过10μmol/L的LY294002或10μmol/L的CQ与0.5IU/ml天冬酰胺酶联合处理后的K562细胞的Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase的表达量高于0.5IU/ml天冬酰胺酶单独处理后的K562细胞。

具体实施方式

实施例1：天冬酰胺酶的配制

天冬酰胺酶（欧文）的配制：取适量天冬酰胺酶（欧文）溶于纯水配成1000IU/ml的储存液，用0.1μm的滤器过滤除菌后保存于4℃，体外实验用PRMI-1640培养基稀释到相应浓度。

实施例2：自噬抑制剂药物的配制

（1）氯喹的配制：取适量氯喹溶于纯水配成10mmol/L的储存液，用0.1μm的滤器过滤除菌后保存于4℃，体外实验用PRMI-1640培养基稀释500-1000倍用于抑制细胞自噬；

（2）氯化铵的配制：取适量氯化铵溶于水配成0.4mol/L的储存液，用0.1μm的滤器过滤除菌后保存于4℃，体外实验时稀释50-80倍用于抑制细胞自噬；

（3）羟基氯喹的配制：取适量羟基氯喹溶于纯水配成10mmol/L的储存液，用0.1μm的滤器过滤除菌后保存于4℃，体外实验室稀释500-1000倍用于抑制细胞自噬；

（4）3-MA的配制：取适量3-MA干粉配制成0.2mol/L的储存液，用0.1μm的滤器过滤除菌后保存于-20℃。体外实验时稀释50-200倍用于抑制细胞自噬；

（5）LY294002的配制：取适量LY294002干粉配制成0.2mol/L的储存液，用0.1μm的滤器过滤除菌后保存于-20℃。体外实验时稀释50-100倍用于抑制细胞自噬；

（6）巴伐洛霉素A1的配制：取适量巴伐洛霉素A1干粉配制成0.5μg/ml的储存液，用0.1μm的滤器过滤除菌后保存于-20℃，体外实验时稀释1000倍用于抑制细胞自噬；

（7）自噬抑制剂与天冬酰胺酶联合应用于体内或体外抗肿瘤时，自噬抑制剂3-MA的使用浓度范围为0-1mol/L，自噬抑制剂CQ的使用浓度范围为0-50mol/L，羟基氯喹的使用浓度范围为0-50mol/L，LY294002的使用浓度范围为0-1mol/L，巴伐洛霉素A1的使用浓度范围为0-10mol/L，天冬酰胺酶的使用浓度范围为0-100IU/ml。

实施例3：药物组合物的配比

（1）天冬酰胺酶与氯喹冻干粉：天冬酰胺酶（欧文）1000IU，氯喹8g，辅料甘氨酸0.1g，用时稀释到相应的浓度。

（2）天冬酰胺酶与羟基氯喹冻干粉：天冬酰胺酶（欧文）1000IU，羟基氯喹8.5g，辅料甘氨酸0.1g，用时稀释到相应的浓度。

（3）天冬酰胺酶与3-MA冻干粉：天冬酰胺酶（欧文）1000IU，3-MA2g，辅料甘氨酸0.1g，用时稀释到相应的浓度。

（4）天冬酰胺酶与LY294002冻干粉：天冬酰胺酶（欧文）1000IU，LY2940024.2g，辅料甘氨酸0.1g，用时稀释到相应的浓度。

（5）天冬酰胺酶与巴伐洛霉素A1冻干粉：天冬酰胺酶（欧文）10000IU，巴伐洛霉素A17.5g，辅料甘氨酸0.1g，用时稀释到相应的浓度。

实施例4：天冬酰胺酶能诱导K562细胞发生细胞自噬

K562细胞用0.5IU/ml的天冬酰胺酶处理24h后，进行石蜡包埋、切片、染色，在透射电子显微镜下观察细胞亚显微结构，结果如图1A所示，给药组细胞内有大量的典型的双层膜结构自噬体，而对照组则未发现；

K562细胞用0.5IU/ml的天冬酰胺酶处理24h后，用Autophagy DetectionKit自噬体染色试剂盒按说明书处理，随后在激光共聚焦显微镜下观绿色荧光斑点，结果如图1B显示，给药组细胞内有大量的荧光斑点，而对照组较少；

将收集到的K562细胞用PBS洗2次，用RIPA试剂盒裂解细胞，并定量后按照每个泳道20μg进行蛋白电泳后转膜至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭1h，分别加入LC3B和β-Actin抗体，于4℃孵育12h。TBST洗膜后加入二抗室温孵育1.5h，用ECL显色液显色。K562细胞经过天冬酰胺酶处理不同时间或不同浓度后，通过Western Blot的检测，结果如图1C所示，与对照组相比，给予天冬酰胺酶组的K562细胞的LC3Ⅱ的表达水平增强。

实施例5：抑制自噬能增强天冬酰胺酶诱导的K562细胞死亡

K562细胞给予0.04IU/ml的天冬酰胺酶，并在给药前1h加入10μmol/L的LY294002和10μmol/L的CQ抑制细胞自噬；连续培养48h后经过MTT法测定各组的细胞活力如图2所示，天冬酰胺酶能显著降低K562细胞的细胞活力，与天冬酰胺酶单独使用组相比，天冬酰胺酶与自噬抑制剂LY294002或CQ联合应用组的K562细胞的细胞活力有显著性下降，证明自噬抑制剂和天冬酰胺酶的联合给药能更有效地抑制K562细胞的生长，并且只加抑制剂LY294002和CQ组的细胞活力与对照组相比，无显著差异。说明抑制剂本身对细胞无明显细胞毒性，因此我们推断了自噬抑制剂和天冬酰胺酶的联合给药所降低的K562细胞的细胞活性并非是抑制剂和药物的协同作用所致，而是因为抑制自噬后增加了K562细胞对天冬酰胺酶的药物敏感性。结论：抑制自噬能增加天冬酰胺酶对K562细胞的杀伤作用。

实施例6：抑制细胞自噬后细胞内相关蛋白的表达水平检测

药物处理细胞，用RIPA裂解液裂解抽取细胞总蛋白，定量后按每孔20μg蛋白量上样进行蛋白电泳并转膜进行Western blot，用ECL化学发光试剂盒进行化学发光，结果如图3所示：经过0.5IU/ml天冬酰胺酶处理的K562细胞的LC3Ⅱ的表达量高于对照组，经过10μmol/L LY294002和0.5IU/ml天冬酰胺酶处理后的K562细胞的LC3Ⅱ的表达量低于0.5IU/ml天冬酰胺酶处理后的K562细胞，如图3A所示，而经过0.5IU/ml天冬酰胺酶和10μmol/L的CQ处理后的K562细胞的LC3Ⅱ的表达量高于0.5IU/ml天冬酰胺酶处理后的K562细胞，如图3B所示，经过0.5IU/ml天冬酰胺酶处理的K562细胞的Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase的表达量高于对照组，经过10μmol/L的LY294002或10μmol/L的CQ与0.5IU/ml天冬酰胺酶联合处理后的K562细胞的Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase的表达量高于0.5IU/ml天冬酰胺酶单独处理后的K562细胞，如图3C所示，由于LY294002是一种PI3K抑制剂，PI3K在细胞自噬的调控中起重要的作用，其能与Beciln1等分子结合，参与调控自噬体膜的运输，因此抑制PI3K将阻遏自噬体的形成，从而起到抑制细胞自噬的作用，从现象上看，由于自噬体膜的形成与运输受阻，导致ATG8/LC3分子无法通过泛素化在自噬体膜上定位，所以LC3Ⅱ分子的表达水平会因此下降，故而Western Blot的结果证明10μmol/L的LY294002能抑制由0.5IU/ml天冬酰胺酶所诱导的K562细胞的细胞自噬。而CQ是自噬溶酶体的抑制剂，CQ能造成溶酶体的碱化，使溶酶体酶失去活性，从而造成自噬体的堆积，这造成了自噬体无法在溶酶体内进行降解，导致了处于自噬体膜表面的LC3Ⅱ分子的量增加。所以Western Blot的结果能证明10μmol/L的CQ能抑制由0.5IU/ml天冬酰胺酶诱导的K562细胞的细胞自噬。PARP是caspase家族蛋白的剪切底物，经剪切后变为其剪切形式Cleaved-PARP，Cleaved-PARP的量的多少能直接地反应细胞凋亡的程度，同时Caspase的剪切的量的多少也直接反应细胞凋亡的程度，即Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase表达量越多则细胞凋亡越显著；本实验结果可进一步支持“抑制细胞自噬能增强人天冬酰胺酶诱导的白血病细胞凋亡”的结论。

Claims (9)

1.将一种或多种细胞自噬抑制剂和一种或多种天冬酰胺酶的活性组份联合用于制备用于增强天冬酰胺酶对肿瘤的治疗效果的药物组合物，其中，在联用药物中，通过抑制天冬酰胺酶诱导的肿瘤细胞的细胞自噬而抵消肿瘤由于细胞自噬而引起的作用。

2.按权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的细胞自噬抑制剂选自3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine）、渥曼青霉素（wortmannin）、LY294002、放线菌酮、巴法洛霉素A1（Bafilomycin A1）、NH4Cl、氯喹（Chloroquine）或羟基氯喹（hydroxychloroquine）。

3.按权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述的细胞自噬抑制剂选自3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine）、氯喹（Chloroquine）或羟基氯喹（Hydroxychloroquine）。

4.按权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的天冬酰胺酶选自欧文菌属天冬酰胺酶、大肠埃希菌属天冬酰胺酶、胡萝卜软腐欧文菌属天冬酰胺酶、重组天冬酰胺酶或聚乙二醇修饰的重组人天冬酰胺酶。

5.按权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的活性组份序贯使用。

6.按权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物制成固体、溶液、分散剂、胶束、乳剂、脂质体或纳米微球。

7.按权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的肿瘤是白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、卵巢癌、肝癌、肺癌或乳腺癌。

8.按权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述的肿瘤是白血病、淋巴瘤或黑色素瘤。

9.按权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述的淋巴瘤是霍奇金病淋巴瘤（HD）或非霍奇金病淋巴瘤（NDL）。