CN104951870B - 药物临床前心脏风险评估方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种药物临床前心脏风险评估方法，包括以下步骤：动作电位频率设计、动作电位记录以及hERG通道手动膜片钳记录。本发明利用频率依赖性、动作电位三角化以及hERG阻断动力学来评估药物心率失常的风险，大大提高了药物的筛选效率和准确性，降低药物临床心率失常的假阳性。

Description

药物临床前心脏风险评估方法

技术领域

本发明属于药物安全性评估技术领域，具体涉及药物临床前心脏风险评估方法。

背景技术

临床数据显示，由于QT延长而导致的室性扭转性心率失常（TdP）是药物从市场上禁止销售及限制销售的最主要原因。欧洲，美国，日本等国政府在2003年纷纷出台了相应的药物临床前心脏安评指导原则，比如美国FDA新药安评的指导文件S7B中指出，评估药物是否有诱发心率失常的风险主要看这个药物是否阻断hERG钾通道以及是否引发QTc延长。然而，实践证明世界上约60%的药物在高浓度都会阻断hERG通道，而只有极小部分这些化合物可能会对病人造成尖端扭转室性心率失常，即hERG通道的阻断引起的QTc延长和临床心率失常之间的实际相关性比较差。 S7B执行10多年以来由假阳性引起的问题越来越受到重视，常见的例子是维拉帕米，虽然能阻断hERG通道，但是在临床上不会引起心率失常。由于实验设计不严谨而增加假阳性可以使一个具有很好潜力的药物被放弃，这将对公司来说损失是无法估量的，所以提高临床前实验数据与临床的相关性迫在眉睫。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种药物临床前心脏风险评估方法，以提高药物临床前心脏安评与临床心率失常的相关性和准确性。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

药物临床前心脏风险评估方法，包括以下步骤：

（1）动作电位频率设计：用三组不同刺激频率包含100个脉冲来刺激浦肯野纤维在不同刺激频率下发动的动作电位，三组刺激频率周期分别为2000ms、1000ms和600ms；

（2）动作电位记录：将兔子浦肯野纤维放置在灌流浴槽中，按4 mL/min的速度灌流台氏液，通过细胞内微电极记录细胞内膜电压，微电极的材质为硼硅酸盐玻璃毛细管，通过电极拉制仪拉制，微电极内充3 M KCl的内液；通过银丝连接到细胞内的静电计放大器记录胞内电压；待电压稳定后将药物按照浓度梯度灌流浦肯野纤维，并用步骤（1）的三组刺激频率分别刺激浦肯野纤维记录药物的作用；

（3）hERG通道手动膜片钳记录：将hERG稳转细胞接种于玻片上，细胞密度低于50%，过夜培养后移到嵌于倒置显微镜平台的浴槽中灌流细胞外液，灌流速度为2.7 mL/min；GO封接细胞后将细胞膜电位钳制在-80 mV，对细胞持续2 s、+20 mV电压刺激，激活hERG钾通道，再复极化至-50 mV、持续5 s，产生尾电流；采用膜片钳放大器和采集系统记录膜电流；待电流稳定即5 min内电流衰减小于5 %，且尾电流不低于300 pA时，以相同的速度灌流含药物的细胞外液，记录药物在细胞除极通道开发时间段阻断hERG通道的动态过程。

本发明的有益效果是：利用频率依赖性、动作电位三角化以及hERG阻断动力学来评估药物心率失常的风险，大大提高了药物的筛选效率和准确性，降低药物临床心率失常的假阳性。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明发明专利作进一步详细描述。

图1是本发明中PCL和多菲利特的频率依赖性对比图；

图2是本发明中加多菲利特后的APD90-APD60相比于空白对照的比例图；

图3是本发明中加PCL后的APD90-APD60相比于空白对照的比例图；

图4是本发明中10 μM PCL与空白对照相比的使用依赖性对比图；

图5是本发明中30 nM多菲利特与空白对照相比的使用依赖性对比图；

图6是本发明中3 μM特罗地林与空白对照相比的使用依赖性对比图；

具体实施方式：

药物临床前心脏风险评估方法，包括以下步骤：

（1）动作电位频率设计：用三组不同刺激频率包含100个脉冲来刺激浦肯野纤维在不同刺激频率下发动的动作电位，三组刺激频率周期分别为2000ms、1000ms和600ms；

（2）动作电位记录：将兔子浦肯野纤维放置在灌流浴槽中，按4 mL/min的速度灌流台氏液，通过细胞内微电极记录细胞内膜电压，微电极的材质为硼硅酸盐玻璃毛细管，通过电极拉制仪拉制，微电极内充3 M KCl的内液；通过银丝连接到细胞内的静电计放大器记录胞内电压；待电压稳定后将药物按照浓度梯度灌流浦肯野纤维，并用步骤（1）的三组刺激频率分别刺激浦肯野纤维记录药物的作用；

（3）hERG通道手动膜片钳记录：将hERG稳转细胞接种于玻片上，细胞密度低于50%，过夜培养后移到嵌于倒置显微镜平台的浴槽中灌流细胞外液，灌流速度为2.7 mL/min；GO封接细胞后将细胞膜电位钳制在-80 mV，对细胞持续2 s、+20 mV电压刺激，激活hERG钾通道，再复极化至-50 mV、持续5 s，产生尾电流；采用HEKA EPC-10膜片钳放大器和PATCHMASTER采集系统记录膜电流；待电流稳定即5 min内电流衰减小于5 %，且尾电流不低于300 pA时，以相同的速度灌流含药物的细胞外液，记录药物在细胞除极通道开发时间段阻断hERG通道的动态过程。

本发明将PCL和特罗地林分别与在临床上能诱发心率失常的标准药物多菲利特按照上述评估方法进行评估，实验结果如下：

如图1所示，X轴表示三组刺激频率周期，分别为2000ms、1000ms和600ms，Y轴表示加PCL和多菲利特后APD90的变化情况。两者均表现出逆向使用依赖性的APD延长，但PCL的延长效果相对低。

如图2和图3所示，Y轴分别表示加多菲利特和PCL后的APD90-APD60相比于空白对照的比例，X轴分别为不同浓度的多菲利特和PCL。结果表明PCL延长APD没有三角化趋势，但是多菲利特却有较明显的三角化。

图4至图6分别表示灌流10 μM PCL、30 nM多菲利特和3 μM特罗地林（此浓度下hERG钾通道电流抑制率均为70 - 80 %）后hERG通道开放的使用依赖性，Y轴表示细胞中hERG电流大小，X轴为时间。每个电流图中均包括四条电流曲线，分别为未加药的空白曲线（control）、加药孵育5分钟后运行的第一条电流曲线（pulse 1）、第10条曲线（pulse 10）和第20条曲线（pulse 20）。结果表明多菲利特有较明显的使用依赖性，抑制作用随着运行的pulse数的递增而增加；而PCL和特罗地林没有使用依赖性，在第10条电流曲线（pulse 10）时即达到了稳定。

一般而言，有较强使用依赖性和三角化的药物有较高的致心率失常风险。因此，本发明利用频率依赖性、动作电位三角化以及hERG阻断动力学可以更加准确地评估药物是否有诱发心率失常的风险，从而降低药物临床心率失常的假阳性。

Claims (1)

1.药物临床前心脏风险评估方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）动作电位频率设计：用三组不同刺激频率包含100个脉冲来刺激浦肯野纤维在不同刺激频率下发动的动作电位，三组刺激频率周期分别为2000ms、1000ms和600ms；

（2）动作电位记录：将兔子浦肯野纤维放置在灌流浴槽中，按4 mL/min的速度灌流台氏液，通过细胞内微电极记录细胞内膜电压，微电极的材质为硼硅酸盐玻璃毛细管，通过电极拉制仪拉制，微电极内充3 M KCl的内液；通过银丝连接到细胞内的静电计放大器记录胞内电压；待电压稳定后将药物按照浓度梯度灌流浦肯野纤维，并用步骤（1）的三组刺激频率分别刺激浦肯野纤维记录药物的作用；

（3）hERG通道手动膜片钳记录：将hERG稳转细胞接种于玻片上，细胞密度低于50%，过夜培养后移到嵌于倒置显微镜平台的浴槽中灌流细胞外液，灌流速度为2.7 mL/min；GO封接细胞后将细胞膜电位钳制在-80 mV，对细胞持续2 s、+20 mV电压刺激，激活hERG钾通道，再复极化至-50 mV、持续5 s，产生尾电流；采用膜片钳放大器和采集系统记录膜电流；待电流稳定即5 min内电流衰减小于5 %，且尾电流不低于300 pA时，以相同的速度灌流含药物的细胞外液，记录药物在细胞除极通道开发时间段阻断hERG通道的动态过程。