CN104920307B - 一种适用于单粒子微束装置的秀丽小杆线虫固定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种适用于单粒子微束装置的秀丽小杆线虫固定方法。本发明的主要步骤包括线虫的培养；简易固定装置的制作；虫体保湿凝胶片的制备；线虫的固定；辐射样品的准备；辐射结束后线虫的恢复和转移培养。本方法的特点在于线虫固定所需的装置可以利用市售的离心管，通过简单的操作，自制而成；线虫的固定过程简单、耗时短，固定状态维持时间长，且辐射后线虫复苏方法简单，活力恢复快、成活率高；虫体采用2%的凝胶片保湿，有效解决水分快速蒸发造成的虫子死亡，提高线虫麻醉固定后的恢复率，且凝胶片透光率好，显微镜下虫体组织结构成像清晰，易于单粒子辐射的精确定位，减少实验误差，提高实验的准确性和精确性。

Description

一种适用于单粒子微束装置的秀丽小杆线虫固定方法

技术领域：

本发明涉及一种秀丽小杆线虫的固定方法，具体地说提供了一种适用于单粒子微束装置定点辐射线虫不同身体组织的虫体麻醉方法，属于辐射生物学技术领域。

背景技术：

辐射生物学是研究电离辐射与细胞、组织及生物体相互作用的学科。传统的辐射生物学认为辐射损伤仅发生在直接受辐射的细胞、组织或机体中，而辐射旁效应的出现则打破了这一传统观点，并为广大的研究者所重视，随之出现了许多用于辐射旁效应研究的实验装置、实验模型和实验方法。单粒子微束装置由于其能精确对一定区域内的机体组织、单个细胞甚至细胞内的特定亚细胞结构实现定点、定量辐射而广泛应用于辐射旁效应的研究中，同时辐射旁效应的实验模型亦由最初的离体细胞培养体系、离体组织研究体系发展到了如今的个体实验模型。秀丽小杆线虫已被广泛应用于辐射生物学研究的各个领域，因其虫体透明，身体组织器官在活体状态下清晰可辨，且其成虫体长约1毫米，与旁效应损伤信号转导的有效距离非常相符，从而成为研究辐射旁效应过程及机理的有力活体动物模型。

但将秀丽小杆线虫应用于辐射旁效应的研究却存在着几个方面的问题，首先，线虫在活体状态下其身体不停地运动，在线虫这种运动状态下无法进行单粒子微束装置的定点、定量辐射，这就需要研发可行的线虫活体状态下的固定方法；其次，线虫个体微小，离开线虫培养基仅能存活几秒钟，而单粒子微束辐射在液体存在条件下由于液体分子的阻力，无法精确计算到达线虫个体组织的辐射剂量，因此，如何在辐射过程中在无液体或极少液体存在的条件下保持线虫的存活状态亦成为其中的一个难题；再者，线虫经过固定和单粒子微束辐射双重处理的作用下，如何有效地恢复线虫的活力也是线虫用于辐射旁效应研究的一个难题。中国专利申请号为201110065496.7，申请日为2011年03月18日，发明创造名称为：基于微阀的秀丽隐杆线虫长期培养及双检测微流控芯片，该申请案利用PDMS聚合物，采用PDMS软刻蚀及不可逆封接技术构建了线虫微流控芯片，虽然可以将此微流控芯片通过适当的调整应用于单粒子微束辐射研究中，但由于单粒子微束辐射研究中要求线虫身体基本处于不动的状态，因而芯片容纳线虫的通路尺寸很难控制，且易发生堵塞，增加实验的难度。中国专利申请号为201210189484.X，申请日为2012年06月08日，发明创造名称为：用于线虫培养和/或观察的微流芯片和设备及其应用，所述的微流芯片虽然也可用于单粒子微束辐射研究中，但仍存在着上述专利相同的问题。中国专利申请号为201110242704.6，申请日为2011年08月23日，发明创造名称为：一种动物麻醉剂的复方拮抗剂及其应用，以及中国专利号为ZL 96226348.6，授权公告日为1997年10月29日，实用新型名称为：大白鼠乙醚麻醉器，这两个专利均是通过麻醉的方法固定实验动物模型，虽然其中的麻醉剂配方、用量以及麻醉装置并不适宜于线虫的麻醉处理，但却为我们寻找线虫的活体固定方法开拓了思路。

基于上述理论基础，结合秀丽小杆线虫自身的特点以及单粒子微束装置所需的实验条件，通过反复的尝试和实验验证，本发明创造了一种适用于单粒子微束装置的秀丽小杆线虫固定方法。该发明借助市售的5毫升离心管，通过简单的操作，自制了简易的线虫固定装置，并利用挥发性的乙醇和乙醚混合麻醉剂固定线虫，且在线虫固定的过程中使用2%的Agar A凝胶片进行线虫的保湿，有效提高了线虫的恢复率和虫体成像的清晰度。本发明充分满足了利用秀丽小杆线虫为活体动物模型开展单粒子微束辐射研究的需求，并为秀丽小杆线虫在辐射生物学领域的研究提供新的固定方法。

发明内容

发明要解决的技术问题

本发明的目的在于解决现有技术中以秀丽小杆线虫为活体动物模型，利用单粒子微束辐射装置开展辐射旁效应研究中关于线虫的固定问题，提供了一种适用于单粒子微束装置的秀丽小杆线虫固定方法。通过自制的简易线虫固定装置，利用挥发性的乙醇和乙醚混合麻醉剂，并使用2%的Agar A凝胶片进行虫体的保湿，解决了单粒子微束辐射过程中线虫固定难、固定状态持续时间短、辐射实验后虫子活力恢复慢、恢复率低等现存问题，有效提高了单粒子微束辐射线虫组织器官实验的精确性和准确性。

技术方案

为解决以秀丽小杆线虫为活体动物模型，利用单粒子微束辐射装置开展辐射旁效应研究中关于线虫的固定的难题，本发明的技术步骤具体为：

步骤一、秀丽小杆线虫的培养过程

将秀丽小杆线虫进行同步化处理，获得发育一致的L1期幼虫。将同步化的L1期幼虫接种于NGM线虫固体培养基上，于20摄氏度恒温条件下持续培养至实验所需的时期。

步骤二、简易线虫固定装置的自制过程

取一5毫升离心管，在其管盖（管盖A）内面覆三层Mylar膜，再将管盖盖紧，获得良好的密封效果；将该离心管从中间部位切断，丢弃管底部分，保留上部1.8厘米的高度，并修平切口，形成一端密封的圆柱形小管；然后剪取另一5毫升离心管管盖（管盖B）作为该圆形小管另一端的密封盖，完成线虫固定装置的自制过程。

步骤三、线虫保湿的凝胶片制备过程

称取2克Agar A分散于100毫升已灭菌的去离子水，利用微波加热使得Agar A完全溶解，配成2%的Agar A溶液；立即吸取2.5毫升2%的Agar A溶液均匀平铺于60毫米的塑料培养皿底部，待Agar A溶液自然凝固后，封口膜密封放置12小时备用；实验时，用灭菌后的手术刀将整块凝胶分割成边长约0.6厘米凝胶片，完成线虫保湿的凝胶片制备过程。

步骤四、线虫的固定过程

首先在自制简易线虫固定装置覆盖Mylar膜一端的底部放入小拇指大小的脱脂棉球，备用；使用灭菌后的手术刀片挑一凝胶片于管盖B内，为了获得平滑的表面，凝胶片接触培养皿的一面朝上；吸取0.6微升的M9缓冲液于凝胶片中心，在解剖镜下使用铂金丝挑虫针从NGM培养基上挑取线虫20条于M9缓冲液中；吸取60微升挥发性的乙醇和乙醚混合麻醉剂于自制简易线虫固定装置底部的脱脂棉球上，并将其倒扣于管盖B上，形成一个密闭空间；2.0-3.5分钟后取下管盖B，解剖镜下观察管盖B内凝胶片上的线虫是否已被麻醉。

步骤五、单粒子束辐射样品的准备过程

使用已灭菌处理的手术刀片挑起管盖B内的凝胶片，倒扣于事先准备好的辐射板中心的Mylar膜上，完成单粒子束辐射样品的准备过程。

步骤六、辐射结束后线虫的恢复和转移培养过程

在辐射盘中间Mylar膜上凝胶片放置的位置滴加约0.5毫升的M9缓冲液，使得M9缓冲液将凝胶片完全包裹；再将凝胶片挑离Mylar膜，使所有的虫体与M9缓冲液直接接触；放置10-15分钟，待虫子全部复苏后，使用10微升的移液枪将所有的虫子转移至NGM培养基上，待下一步的检测。

有益效果

本发明所表述的实验方案，与现有技术相比，具有以下特点：

本发明所表述的一种适用于单粒子微束装置的秀丽小杆线虫固定方法，利用市面上现有的5毫升离心管为材料，通过简单的实验室操作，自制了简易的简易线虫固定装置。该装置制作成本低，仅用了两个5毫升的离心管，制作过程简单、便利、耗时短，解决了现有技术装备成本高、制作过程复杂等问题；

本发明所表述的一种适用于单粒子微束装置的秀丽小杆线虫固定方法，使用挥发性的乙醇和乙醚混合麻醉剂，线虫在自制简易的线虫固定装置中密封2-3.5分钟即可实现虫体的完成麻醉，且麻醉状态时间可持续可达10-15分钟，满足单粒子微束同时进行20条虫子的辐射所需的时间，且该线虫的固定过程简单，固定快，易操作；

本发明所表述的一种适用于单粒子微束装置的秀丽小杆线虫固定方法，在线虫的固定、辐照过程中均采用2%的Agar A凝胶片进行虫体的保湿，有效解决了线虫离开培养后由于水分快速蒸发造成虫子的死亡，同时有效提高了线虫长时间麻醉固定以及辐射处理后虫子的恢复率；

本发明所表述的一种适用于单粒子微束装置的秀丽小杆线虫固定方法，虫体保湿所用的2% Agar A凝胶片透光率好，使得虫体成像清晰，虫体内部结构清晰易辨，有利于单粒子微束辐射的精确定位，减少实验误差，大大提高了实验的准确性和精确性。

附图说明

图1为适用于单粒子微束装置的秀丽小杆线虫固定方法的示意图；

图2为自制简易线虫固定装置实物图；

图3为辐射后线虫复苏实物图；

图4为实施例1和2中线虫不同组织辐射定位图。

具体实施方式

为进一步解释本发明的内容，一下结合实施例对本发明的具体步骤做详细描述。

实施例1: L1/L2期幼虫阴门组织的单粒子微束辐射处理

本实施例表述的是以L1/L2期幼虫为实验模型，利用自制的简易线虫固定装置，使用挥发性的乙醇和乙醚混合剂麻醉固定后，对线虫的阴门组织进行单粒子微束的辐射处理，其详细的步骤描述如下。

步骤一、秀丽小杆线虫的培养

将秀丽小杆线虫进行同步化处理（同步化试剂：5 mol/L NaOH和NaClO），将虫卵置于3毫升的M9缓冲液中于20摄氏度恒温条件下孵育24小时。解剖镜下观察线虫的卵，待有95%以上卵孵化为L1期幼虫时，将其接种于NGM线虫固体培养基上，于20摄氏度恒温条件下培养10个小时。

步骤二、简易线虫固定装置的制作

取一5毫升离心管，在其管盖（管盖A）内面覆三层Mylar膜，再将管盖盖紧，获得良好的密封效果；将该离心管从中间部位切断，丢弃管底部分，保留上部1.8厘米的高度，并修平切口，形成一端密封的圆柱形小管；然后剪取另一5毫升离心管管盖（管盖B）作为该圆形小管另一端的密封盖，获得简易的线虫固定装置。

步骤三、线虫保湿凝胶片的制备过程

称取2克Agar A分散于100毫升已灭菌的去离子水，利用微波炉加热3分钟左右，使得Agar A完全溶解，配成2%的Agar A溶液；立即吸取2.5毫升液态的Agar A溶液均匀平铺于60毫米的塑料培养皿底部，待Agar A溶液自然凝固后，封口膜密封，于室温条件下放置12小时备用；实验时，用灭菌后的手术刀将整块凝胶分割成若干个边长约0.6厘米的凝胶片即可。

步骤四、线虫的固定

首先在自制简易线虫固定装置覆盖Mylar膜一端的底部放入小拇指大小、松软的脱脂棉球，备用；使用灭菌后的手术刀片挑一凝胶片于管盖B内，为了获得平滑的表面，凝胶片接触培养皿的一面朝上；吸取0.6微升的M9缓冲液于凝胶片中心，在解剖镜下使用铂金丝制成的挑虫针从NGM培养基上挑取大小均匀的线虫20条于M9缓冲液中分散开来；吸取60微升乙醇和乙醚按照体积1:1混合的麻醉剂于自制简易线虫固定装置底部的脱脂棉球上，并将其倒扣于管盖B上，形成一个密闭空间；2. 5分钟后取下管盖B，解剖镜下观察管盖B内凝胶片上的线虫已被全部麻醉。

步骤五、单粒子束辐射样品的准备

使用已灭菌处理的手术刀片挑起管盖B内的凝胶片，倒扣于事先准备好的辐射板中心的Mylar膜上，使得凝胶片载有已麻醉线虫的一面与Mylar膜接触，完成单粒子束辐射样品的准备过程，并将辐射盘置于单粒子微束装置上进行一定L1/L2期幼虫阴门组织的定点定量辐射。

步骤六、辐射结束后线虫的恢复和转移培养过程

在辐射盘中间Mylar膜上凝胶片放置的位置滴加约0.5毫升的M9缓冲液，使得M9缓冲液将凝胶片完全包裹；再用挑虫针将凝胶片挑离Mylar膜，使所有的虫体与M9缓冲液直接接触；放置11分钟，虫子已全部复苏，使用10微升的移液枪将所有的虫子转移至NGM培养基上，等待进一步的检测。

实施例2: L4期/早期成虫咽部后食道球的单粒子微束辐射处理

本实施例基本方法同实施例1，不同之处在于步骤一中将同步化的L1期幼虫接种于NGM培养基上培养48小时，这时的线虫基本发育至L4期，并即将进入早期成虫；不同之处还有步骤四中L4期/早期成虫需要用1:1的乙醇和乙醚混合麻醉剂麻醉3分钟，这是由于该时期的虫子耐受力较强的原因；不同之处还有步骤六中辐射的虫子需要15分钟才能全部复苏，并达到活动自如的状态。

以上对本发明及其实施方式进行了描述，该描述没有限制性，只为说明本发明的技术思路及特点，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或改进，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (2)

1.一种适用于单粒子微束装置的秀丽小杆线虫固定方法，其特征在于：其步骤包括秀丽小杆线虫的培养过程、简易线虫固定装置的自制过程、线虫保湿凝胶片的制备过程、线虫的固定过程、单粒子束辐射样品的准备过程以及辐射结束后线虫的恢复和转移培养过程；

其中，秀丽小杆线虫的培养是在20摄氏度恒温条件下将线虫接种于NGM固体培养基培养至实验所需的时期；

简易线虫固定装置的自制步骤主要通过在一5毫升离心管管盖A内面覆三层Mylar膜，再将管盖A盖紧，并将该离心管从中间部位切断，丢弃管底部分，保留上部1.8厘米的高度，形成一端密封的圆柱形小管，然后剪取另一5毫升离心管管盖B作为该圆形小管另一端的密封盖，完成简易线虫固定装置的自制过程；

线虫保湿凝胶片的制备，称取2克Agar A分散于100毫升已灭菌的去离子水，利用微波加热使得Agar A完全溶解，配成2%的Agar A溶液；立即吸取2.5毫升2%的Agar A溶液均匀平铺于60毫米的塑料培养皿底部，待Agar A溶液自然凝固后，封口膜密封放置12小时备用；实验时，用灭菌后的手术刀将整块凝胶分割成若干个边长约0.6厘米的凝胶片，完成线虫保湿凝胶片的制备过程；

线虫的固定过程：首先在自制简易线虫固定装置覆盖Mylar膜一端的底部放入小拇指大小、松软的脱脂棉球，备用；使用灭菌后的手术刀片挑一凝胶片于管盖B内，为了获得平滑的表面，凝胶片接触培养皿的一面朝上；吸取0.6微升的M9缓冲液于凝胶片中心，在解剖镜下使用铂金丝制成的挑虫针从NGM培养基上挑取大小均匀的线虫20条于M9缓冲液中分散开来；吸取60微升挥发性的乙醇和乙醚混合麻醉剂于自制简易线虫固定装置底部的脱脂棉球上，并将其倒扣于管盖B上，形成一个密闭空间；2.0-3.5分钟后取下管盖B，解剖镜下观察管盖B内凝胶片上的线虫是否已被麻醉；

单粒子束辐射样品的准备，通过将载有已固定线虫的凝胶片用灭菌后的手术刀挑起倒扣于事先准备好的辐射板中心的Mylar膜上来完成；

辐射结束后线虫的恢复和转移培养过程，在辐射盘中间Mylar膜上凝胶片放置的位置滴加0.5毫升的M9缓冲液，使得M9缓冲液将凝胶片完全包裹；再将凝胶片挑离Mylar膜，使所有的虫体与M9缓冲液直接接触；放置10-15分钟，待虫子全部复苏后，使用10微升的移液枪将所有的虫子转移至NGM培养基上，待下一步的检测。

2.根据权利要求1所述的一种适用于单粒子微束装置的秀丽小杆线虫固定方法，其特征在于：其步骤具体如下：

步骤一、秀丽小杆线虫的培养过程

将秀丽小杆线虫进行同步化处理，获得发育阶段一致的L1期幼虫。