CN104911249A - 一种快速检测奶源动物以及原料乳中金黄色葡萄球菌的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公布了一种快速检测奶源动物以及原料乳中金黄色葡萄球菌的试剂盒，及其检测方法，适用于奶源动物金黄色葡萄球菌感染以及原料乳中金黄色葡萄球菌污染的定性检测。所述试剂盒包括(1)牛奶中微生物的提取试剂，(2)PCR检测试剂，其中包括3对特异性的mntc基因的引物，(3)阳性对照，(4)阴性对照和(5)空白质控标准品。本发明试剂盒分离病原菌、检测速度快，特异性好，灵敏度高，操作简单，可替代传统的牛奶中金黄色葡萄菌的检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测奶源动物以及原料乳中金黄色葡萄球菌的试剂盒及其检测方法，属于微生物检测技术，适用于奶源动物金黄色葡萄球菌感染以及原料乳中金黄色葡萄球菌污染的定性检测。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，简称SA)，也称“金葡菌”，是一种革兰氏染色阳性球菌，直径0.8μm，在显微镜下排列成葡萄串状。金葡菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可以找到，是引起细菌性食物中毒的主要病原菌之一，且在国家鲜乳标准中列为不得检出的项目。并且金葡菌也是引起慢性/隐性奶牛乳房炎的主要病原菌之一，可以极大的影响牛奶的产量和质量，给奶制品产业带来巨大的经济损失。因此检测牛奶中的金葡菌不仅是保证食品安全的需要，同时也可以应用于监测奶牛的健康程度，从根本上提高奶牛产业的经济效益。
金葡菌在宿主体内的生存以及其主要毒力与多种金属离子的摄取紧密相关，这一过程是通过特定的基因所编码的特定的金属离子转运蛋白实现的。因此只要检测这些特定的基因便可快速检测金葡菌。Anderson，A.S等(Anderson，Scully，Timofeyeva，Murphy，McNeil，Mininni，Nunez，Carriere，Singer，Dilts and Jansen，Staphylococcus aureus manganese transportprotein C is a highly conserved cell surface protein that elicits protective immunity against S.aureus and Staphylococcus epidermidis.205.1688-96)的研究证明锰离子转运蛋白C(Mntransporter protein C，MntC)是锰离子转运复合物的一个重要组成成分，它存在于金葡菌的膜表面，在感染宿主的早期以及定居、生长和大量繁殖阶段都会表达的蛋白，并高度保守。本实验室的研究涉及到从不同地区患有临床型或者隐型乳房炎的奶牛所产的牛奶里分离金葡菌，并通过检测这些菌株，证明mntc基因广泛存在于这些不同基因型、血清型的金葡菌菌株中，且高度保守。
在检测牛奶中所含金葡菌的方法上，目前国内外主要采用FDA、AOAC、ISO和GB等标准对金葡菌进行检测，整个过程一般需要3-5天，且操作复杂，已经不能满足微生物快速准确检测的现实需要。因此，迫切需要建立新的快速检测技术和方法。
近年来，免疫学和分子生物学等方法的发展和应用，使金葡菌的快速检测有了很大发展。但是，免疫学方法如ELISA、胶体金等，在成本、敏感性等方面尚不理想，而分子生物学检测，如PCR、分子探针等，操作简便、敏感性高、特异性强，已经被越来越多的应用。现在市场上大多数检测金葡菌的PCR或者分子探针方法所采用的引物一般是根据耐热核酸酶(nuc)基因、细菌16S rRNA或者23S rRNA基因设计的，而这些检测方法并不能直接反映所检测出的金葡菌的毒力。
发明内容
本发明的目的在于建立一种从牛奶中直接分离病原微生物的快捷方法，再结合使用针对mntc基因设计的特异性引物，通过PCR方法检测mntc基因，从而达到快速检测牛奶中是否存在金葡菌的目的。
本发明还进一步提供了利用该检测方法在制备从牛奶中检测金葡菌的检测试剂盒的应用，该试剂盒可用于奶源动物以及原料乳中金葡菌的检测，检测方法简便快捷，适用于工业化需要。该试剂盒包括：(1)牛奶中微生物的提取试剂：Pecoll溶液1，密度为1.050g/mL；Pecoll溶液2，密度为1.123g/mL；NaCl溶液，浓度为0.15M；(2)PCR检测试剂：10×PCR缓冲液，dNTP，Taq DNA聚合酶，ddH2O以及3对mntc基因的引物；(3)阳性对照：金葡菌基因组DNA；(4)阴性对照：大肠杆菌基因组DNA；(5)空白质控标准品：ddH2O。其中：
3对引物是根据金葡菌的mntc基因设计的，所述mntc基因序列如SEQ ID NO.1所示。引物序列如下：
第一对引物：
F1：5’-AAATTAAAAGTAGTAACGACG-3’(SEQ ID NO.2)
R1：5’-TTATTTCATGCTTCCGTGTAC-3’(SEQ ID NO.3)
第二对引物：
F2：5’-AGACTGGTAACGGTTGGT-3’(SEQ ID NO.4)
R2：5’-GCACCTTCACTTGTAATCAT-3’(SEQ ID NO.5)
第三对引物：
F3：5’-CATGTGGTACTGGTGGTAA-3’(SEQ ID NO.6)
R3：5’-ATGCGTGTGGATCTTGTT-3’(SEQ ID NO.7)
阳性对照是采用本实验室用国标法分离鉴定的金黄色葡萄球菌株中提取的基因组DNA。
阴性对照是采用本实验室从BL21大肠杆菌株中提取的基因组DNA。
本发明所提供的具体检测方法：
(1)提取牛奶中的微生物：
1)取待检牛奶样品与Percoll溶液1按0.5～1∶1的体积比混匀，室温4,500g离心15min，弃去上层悬浮物；
2)配制Pecoll梯度溶液：按1∶1的体积比将Percoll溶液1缓慢加到Percoll溶液2上层，注意不要冲动下层梯度；
3)将步骤1)中所得物缓缓加入到步骤2)中准备好的Percoll梯度溶液的表面上，室温14,000g离心5min，小心收集上层乳白色溶液；
4)将步骤(3)中的所得物按0.3～0.5∶1的体积比加入至NaCl溶液中，混匀后室温15,000g离心5min，弃上清液；
5)沉淀用适量ddH2O洗涤，室温13,000g离心5min，弃上清液；
6)用所提牛奶样品1/50体积的ddH2O重选沉淀，获得奶样中微生物的浓缩液，作为DNA模板。
(2)PCR法扩增待检样本中的mntc基因，具体步骤如下：
1)按照以下比例制备反应体系：
ddH2O 8.2μL
10×PCR缓冲液 2.5μL
上游引物(F1，F2或F3)(10μM) 1μL
对应的下游引物(R1，R2或R3)(10μM) 1μL
dNTP 2μL
Taq DNA聚合酶 0.3μL
DNA模板 10μL
2)PCR反应循环参数如下：
预变性：95℃5min；
30个循环：95℃45s；55℃45s；72℃1min；
延伸：72℃15min。
PCR反应产物将用于电泳检测鉴定，也可以保存于4℃。
(3)电泳检测鉴定
将步骤(2)PCR反应产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳检测，在凝胶成像仪中观察结果并拍照，如果检测到期待大小的特异性条带：如应用第一对引物得到837bp条带，应用第二对引物得到346bp条带，或应用第三对引物得到375bp条带则证明所检样品中存在金葡菌。
应用本发明的从牛奶中快速提取并检测金葡菌的方法所制备的试剂盒，可以快速准确的检测牛奶中是否存在金葡菌，检测方法简便快速、特异性和灵敏度高。整个检测过程在同一天可以完成，与常规培养检测法相比大大提高了检测效率。
附图说明
图1应用3对mntc基因特异性引物PCR扩增DNA片段检测结果，其中金葡菌DNA模板采用按国标法分离鉴定，来自内蒙古奶样中分离的金葡菌NM006的菌液(浓度为1×103CFU/10μL)：1)Marker DL2000，2)是应用第二对引物F2和R2扩增金葡菌，3)是应用第三对引物F3和R3扩增金葡菌，4)是应用第一对引物F1和R1扩增金葡菌，5)是应用第二对引物F2和R2扩增ddH2O，6)是应用第三对引物F3和R3扩增ddH2O，7)是应用第一对引物F1和R1扩增ddH2O。
图2牛奶样品检测结果图：标准金葡菌1株以及按国标法分离鉴定的16株金葡菌按1×104CFU/0.5mL人工污染无菌鲜牛奶利用第一对引物F1和R1检测的检测结果，包括图2-1和图2-2，其中：
图2-1：1)Marker DL2000，2)是金葡菌基因组DNA，3)是内蒙古奶样中分离的金葡菌NM006，4)是内蒙古奶样中分离的金葡菌NM005，5)是黑龙江奶样中分离的金葡菌HJ31，6)是河北奶样中分离的金葡菌HB31，7)是河北奶样中分离的金葡菌HB0823-2，8)是河北奶样中分离的金葡菌HB49-3，9)是甘肃奶样中分离的金葡菌GS22，10)是甘肃奶样中分离的金葡菌GS38，11)是购买的标准金葡菌ATCC29213，12)是无菌鲜牛奶，13)是大肠杆菌基因组DNA，14)ddH2O。
图2-2：1)Marker DL2000，2)是金葡菌基因组DNA，3)是浙江奶样中分离的金葡菌Zh_QS13，4)是浙江奶样中分离的金葡菌Zh_HZ041，5)是重庆奶样中分离的金葡菌CQ339，6)是新疆奶样中分离的金葡菌XJ041，7)是新疆奶样中分离的金葡菌XJ048，8)是上海奶样中分离的金葡菌SH008，9)是上海奶样中分离的金葡菌SH004，10)是无菌鲜牛奶，11)是大肠杆菌基因组DNA，12)ddH2O。
图3试剂盒特异性鉴定图：按国标法分离鉴定的7株非金葡菌和金葡菌分别按1×103CFU/0.5mL人工污染无菌鲜牛奶利用第一对引物F1和R1检测的检测结果，其中：1)是ddH2O，2)是大肠杆菌基因组DNA，3)是无菌鲜牛奶，4)是河北奶样中分离的非金葡菌NSA_HB47，5)是非金葡菌NSA_HB47和金黄色葡萄球NM006菌混合，6)是河北奶样中分离的非金葡菌NSA_HB241，7)是非金葡菌NSA_HB241和金葡菌NM006混合，8)是北京奶样中分离的非金葡菌NSA_FM36，9)是非金葡菌NSA_FM36和金葡菌NM006混合，10)是黑龙江奶样中分离的非金葡菌NSA_2K108，11)是非金葡菌NSA_2K108和金葡菌NM006混合，12)是黑龙江奶样中分离的非金葡菌NSA_HJ56，13)是非金葡菌NSA_HJ56和金葡菌NM006混合，14)是陕西奶样中分离的非金葡菌NSA_5121455，15)是非金葡菌NSA_5121455和金葡菌NM006混合，16)是甘肃奶样中分离的非金葡菌NSA_QD22，17)是非金葡菌NSA_QD22和金葡菌NM006混合，18)是Marker DL2000。
图4试剂盒敏感度鉴定图：按国标法分离鉴定的1株金葡菌分别按1×102CFU/0.5mL，1×103CFU/0.5mL，1×104CFU/0.5mL，1×105CFU/0.5mL和1×106CFU/0.5mL浓度人工污染无菌鲜牛奶，利用第一对引物F1和R1检测的结果：1)是Marker DL2000，2)是金葡菌菌液(1×103CFU/10μL)，3)是用金葡菌NM006按1×106CFU/0.5mL污染无菌鲜牛奶样品，4)是用金葡菌NM006按1×105CFU/0.5mL污染无菌鲜牛奶样品，5)是用金葡菌NM006按1×104CFU/0.5mL污染无菌鲜牛奶样品，6)是用金葡菌NM006按1×103CFU/0.5mL污染无菌鲜牛奶样品，7)是用金葡菌NM006按1×102CFU/0.5mL污染无菌鲜牛奶样品，8)是无菌鲜牛奶，9)是大肠杆菌基因组DNA，10)是ddH2O。
具体实施方式
实施例1金葡菌mntc基因的特异性引物设计。
通过查询文献和研究本实验室用国标法分离的60株金葡菌的mntc基因以及蛋白表达情况，发现mntc基因(SEQ ID NO.1)存在于多种血清型、基因型的金葡菌中并且序列高度保守，因此选取此基因作为检测基因。
引物采用Vector NTI Advance和Primer Premier 6.0软件设计分析，通过引物动力学特征分析，如引物长度、Tm值、二级结构、上下游引物的错配、3’端稳定性、GC含量和PCR产物的长度等，选择动力学性质尽可能好的引物对，并在GenBank上进行Blast比对，确定其特异性，经过实验验证，筛选出的引物如下：
第一对引物：
F1：5’-AAATTAAAAGTAGTAACGACG-3’(SEQ ID NO.2)
R1：5’-TTATTTCATGCTTCCGTGTAC-3’(SEQ ID NO.3)
第二对引物：
F2：5’-AGACTGGTAACGGTTGGT-3’(SEQ ID NO.4)
R2：5’-GCACCTTCACTTGTAATCAT-3’(SEQ ID NO.5)
第三对引物：
F3：5’-CATGTGGTACTGGTGGTAA-3’(SEQ ID NO.6)
R3：5’-ATGCGTGTGGATCTTGTT-3’(SEQ ID NO.7)
它们扩增出的金葡菌mntc基因片段大小分别为：第一对引物扩增片段大小为837bp，第二对引物扩增片段大小为346bp，第二对引物扩增片段大小为375bp。如图1所示。
实施例2实验方法的建立。
本研究通过多次实验优化各体系和程序，从而确定了最优的反应体系和反应程序，其具体步骤为：
(1)提取牛奶中的微生物：
1)取待检牛奶样品与Percoll溶液1按0.5～1∶1的体积比混匀，室温4,500g离心15min，弃去上层悬浮物；
2)配制Percoll梯度溶液：按1∶1的体积比将Percoll溶液1缓慢加Percoll溶液2上层，注意不要冲动下层梯度；
3)将步骤1)中所得物缓缓加入到步骤2)中准备好的Percoll梯度溶液的表面上，室温14,000g离心5min，小心收集上层乳白色溶液；
4)将步骤3)中的所得物按0.3～0.5∶1的体积比加入至NaCl溶液中，混匀后室温15,000g离心5min，弃上清液；
5)沉淀用适量ddH2O洗涤，室温13,000g离心5min，弃上清液；
6)用所提牛奶样品1/50体积的ddH2O重选沉淀，获得奶样中微生物的浓缩液，作为DNA模板。
(2)PCR法扩增检测待检样本中的mntc基因，具体步骤如下：
1)按照以下比例制备反应体系：
ddH2O 8.2μL
10×PCR缓冲液 2.5μL
上游引物(F1，F2或F3)(10μM) 1μL
对应的下游引物(R1，R2或R3)(10μM) 1μL
dNTP 2μL
Taq DNA聚合酶 0.3μL
DNA模板 10μL
2)PCR反应循环参数如下：
预变性：95℃5min；
30个循环：95℃45s；55℃45s；72℃1min；
延伸：72℃15min。
PCR反应产物将用于电泳检测鉴定，也可以保存于4℃。
(3)电泳检测鉴定
将步骤(2)PCR反应产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳检测，在凝胶成像仪中观察结果并拍照，如果检测到目的条带大小的特异性条带：如应用第一对引物得到837bp条带，应用第二对引物得到346bp条带，或应用第三对引物得到375bp条带则证明所检样品中存在金葡菌。
实施例3人工用金葡菌污染无菌鲜牛奶制备检测样本并应用本发明试剂盒进行检测。
培养本实验室用国标法分离鉴定的16株来源于全国8个省市的金葡菌及1株标准菌株至对数生长期，离心沉淀并用PBS洗涤一次后计数，计数后将金葡菌稀释到106CFU/mL，分别取10μL加到0.5mL的无菌鲜牛奶中，使奶样中金葡菌浓度达到2×104CFU/mL。
按实施例2中的实验步骤，其中步骤(2)PCR检测选用第一对引物F1和R1来检测制备牛奶样品中的金葡菌，阴性对照采用大肠杆菌基因组DNA，空白质控对照采用ddH2O。检测结果如图2所示。
实施例4人工用非金葡菌，以及非金葡菌和金葡菌混合污染无菌鲜牛奶制备检测样本并应用本发明试剂盒进行检测，用于试剂盒特异性鉴定。
培养分离鉴定的非金葡菌和金葡菌NM006至对数生长期，离心沉淀并用PBS洗涤一次后计数，计数后将细菌稀释到105CFU/mL，分别取10μL非金葡菌加到0.5mL的无菌鲜牛奶中，使奶样中非金葡菌浓度达到2×103CFU/mL，每株菌加2个样，并在其中一个样品中再加入10μL金葡菌NM006，使奶样中金葡菌NM006浓度也达到2×103CFU/mL，作为对照。
按实施例2中的实验步骤，其中步骤(2)PCR检测选用第一对引物来检测制备牛奶样品中的金葡菌，阴性对照采用大肠杆菌基因组DNA，空白质控对照采用ddH2O。检测结果如图3所示，显示本发明检测试剂盒有很好的特异性。
实施例5人工用不同浓度的金葡菌污染无菌鲜牛奶制备检测样本并应用本发明试剂盒进行检测，用于试剂盒敏感性鉴定。
培养分离鉴定的1株金葡菌至对数生长期，离心沉淀并用PBS洗涤一次后计数，计数后将金葡菌菌液分别稀释到108CFU/mL、107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL和104CFU/mL，取10μL各个浓度的菌液加到0.5mL的无菌鲜牛奶中，使奶样中金葡菌浓度依次分别达到2×106CFU/mL、2×105CFU/mL、2×104CFU/mL、2×103CFU/mL和2×102CFU/mL。
按实施例2中的实验步骤，其中步骤(2)PCR检测选用第一对引物F1和R1来检测制备牛奶样品中的金葡菌，阳性对照采用金葡菌菌液，阴性对照采用大肠杆菌基因组DNA，空白质控对照采用ddH2O。检测结果如图4所示，显示本发明检测试剂盒有很好的敏感性，可以检测到牛奶样品中2×103CFU/mL的金葡菌含量。
Claims (4)
1.一种快速检测奶源动物以及原料乳中金黄色葡萄球菌(后面简称金葡菌)的检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括：
(1)牛奶中微生物的提取试剂：Pecoll溶液1，密度为1.050g/mL；Pecoll溶液2，密度为1.123g/mL；NaCl溶液，浓度为0.15M；
(2)PCR检测试剂：10×PCR缓冲液，dNTP，Taq DNA聚合酶，ddH2O以及3对mntc基因的引物；
(3)阳性对照：金葡菌基因组DNA；
(4)阴性对照：大肠杆菌基因组DNA；
(5)空白质控标准品；ddH2O。
2.优选的，权利要求1所述的试剂盒，通过检测目标基因mntc(序列见SEQ ID NO.1)的存在来检测奶源动物以及原料乳中金黄色葡萄球菌，包括利用此段基因设计出的PCR的引物，包括所有与此段基因序列相似性高于90％的引物片断。
3.优选的，权利要求1所述的试剂盒中，根据检测基因mntc设计的3对引物：
第一对引物：
F1：5’-AAATTAAAAGTAGTAACGACG-3’(SEQ ID NO.2)
R1：5’-TTATTTCATGCTTCCGTGTAC-3’(SEQ ID NO.3)
第二对引物：
F2：5’-AGACTGGTAACGGTTGGT-3’(SEQ ID NO.4)
R2：5’-GCACCTTCACTTGTAATCAT-3’(SEQ ID NO.5)
第三对引物：
F3：5’-CATGTGGTACTGGTGGTAA-3’(SEQ ID NO.6)
R3：5’-ATGCGTGTGGATCTTGTT-3’(SEQ ID NO.7) 。
4.优选的，权利要求1所述的试剂盒的具体检测方法，包括以下步骤：
(1)提取牛奶中的微生物：
1)取待检牛奶样品与Percoll溶液1按0.5～1∶1的体积比混匀，室温4,500g离心15min，弃去上层悬浮物；
2)配制Pecoll梯度溶液：按1∶1的体积比将Percoll溶液1缓慢加到Percoll溶液2上层，注意不要冲动下层梯度；
3)将步骤1)中所得物缓缓加入到步骤2)中准备好的Percoll梯度溶液的表面上，室温14,000g离心5min，小心收集上层乳白色溶液；
4)将步骤3)中的所得物按0.3～0.5∶1的体积比加入至NaCl溶液中，混匀后室温15,000g离心5min，弃上清液；
5)沉淀用适量ddH2O洗涤，室温13,000g离心5min，弃上清液；
6)用所提牛奶样品1/50体积的ddH2O重选沉淀，获得奶样中微生物的浓缩液，作为DNA模板。
(2)PCR法扩增待检样本中的mntc基因：
1)按照以下比例制备反应体系：
2)PCR反应循环参数如下：
预变性：95℃ 5min；
30个循环：95℃ 45s；55℃ 45s；72℃ 1min；
延伸：72℃ 15min。
PCR反应产物将用于电泳检测鉴定，也可以保存于4℃。
(3)在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳检测，鉴定所检样品中是否含有金葡菌。
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