CN104906106A - 一种抗肿瘤细胞增殖的药物组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗肿瘤细胞增殖的药物组合物及其应用，该药物组合物由活性成分和辅料制备而成，其中所述的活性成分包括3-溴-N-((2S)-2-(4-氟苯基)-4-{3-[(9aS)-4-氧代六氢吡嗪并[2，1-c][1，4]噁嗪-8(1H)-基]氮杂环丁烷-1-基}丁基)-N-甲基-5-(三氟甲基)苯甲酰胺。试验显示，该化合物在一定的剂量和时间范围内，能抑制人乳腺癌MCF-7细胞生长；通过光镜观察，见药物可引起肿瘤细胞出现胞浆空泡和凋亡小体，说明其具有抗癌细胞增殖的生物活性，可开发成抗肿瘤的新药。

Description

一种抗肿瘤细胞增殖的药物组合物及其应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体而言，涉及一种化合物的治疗活性，尤其涉及一种抗肿瘤细胞增殖的药物组合物及其应用。

背景技术

癌症是严重威胁人类健康的恶性疾病之一。近30年来，我国癌症发生率正处于快速上升期，癌症发病率约为200/10万人，每年癌症发病人数约260万，在治患者700万人以上，死亡180万人。

目前癌症的治疗手段仍然是传统的手术治疗、放射治疗及药物治疗，但在很大程度上仍是以药物治疗为主。因此，研究开发新的抗肿瘤药物具有重要意义。

近年来，随着肿瘤分子生物学研究的进展，对肿瘤发病机理有了更多的认识，找到了许多抗肿瘤药物作用的新靶点，使抗肿瘤药物的发展取得许多新的成就，如拓扑异构酶抑制剂、蛋白激酶抑制剂、PI3K抑制剂，mTOR抑制剂等。

在多数肿瘤细胞中，一些激酶呈现高表达或过度激活。针对这一特点，已经开发了吉非替尼、伊马替尼、埃罗替尼、埃克替尼、索拉非尼、舒尼替尼和拉帕替尼等靶向激酶的抗肿瘤药物。但是，有些药物应用于临床后发现其有效率并不高，有些作用于单一靶点的药物容易产生耐药性。因此，研发新的抗肿瘤药物或同时作用于多个靶点的抗肿瘤药物具有重要意义。

CN101316846A公开了一类氮杂环丁烷化合物及其制备方法，并公开了所述化合物在治疗功能性胃肠疾病、IBS和功能性消化不良中的用途。目前，尚没有文献报道这类化合物具有抗肿瘤细胞增殖的生物活性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗肿瘤细胞增殖的药物。该药物以3-溴-N-((2S)-2-(4-氟苯基)-4-{3-[(9aS)-4-氧代六氢吡嗪并[2，1-c][1，4]噁嗪-8(1H)-基]氮杂环丁烷-1-基}丁基)-N-甲基-5-(三氟甲基)苯甲酰胺为活性成分，可用于抗肿瘤药物制剂的制备。

为了实现本发明的目的，发明人通过研究3-溴-N-((2S)-2-(4-氟苯基)-4-{3-[(9aS)-4-氧代六氢吡嗪并[2，1-c][1，4]噁嗪-8(1H)-基]氮杂环丁烷-1-基}丁基)-N-甲基-5-(三氟甲基)苯甲酰胺(SD-906)对体外培养人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响试验，采用MTT试验检测SD-906对MCF-7细胞增殖的影响，并采用光镜观察药物处理后细胞形态学的变化，结果发现SD-906在一定的剂量和时间范围内，能抑制MCF-7细胞生长；通过光镜观察，见药物可引起肿瘤细胞出现胞浆空泡和凋亡小体。基于上述试验结果，本发明提供的技术方案概括如下：

一种抗肿瘤细胞增殖的药物组合物，由活性成分和药学上可接受的辅料制备而成，所述的活性成分包括3-溴-N-((2S)-2-(4-氟苯基)-4-{3-[(9aS)-4-氧代六氢吡嗪并[2，1-c][1，4]噁嗪-8(1H)-基]氮杂环丁烷-1-基}丁基)-N-甲基-5-(三氟甲基)苯甲酰胺。优选地，如上所述抗肿瘤细胞增殖的药物组合物，其中所述的活性成分由3-溴-N-((2S)-2-(4-氟苯基)-4-{3-[(9aS)-4-氧代六氢吡嗪并[2，1-c][1，4]噁嗪-8(1H)-基]氮杂环丁烷-1-基}丁基)-N-甲基-5-(三氟甲基)苯甲酰胺作为唯一组分组成。该化合物3-溴-N-((2S)-2-(4-氟苯基)-4-{3-[(9aS)-4-氧代六氢吡嗪并[2，1-c][1，4]噁嗪-8(1H)-基]氮杂环丁烷-1-基}丁基)-N-甲基-5-(三氟甲基)苯甲酰胺(SD-906)的结构式如下式所示：

本发明所述抗肿瘤细胞增殖的药物组合物可以为口服制剂，包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸、口服液。需要说明的是，按照制剂领域的常规工艺，本领域的技术人员很容易将3-溴-N-((2S)-2-(4-氟苯基)-4-{3-[(9aS)-4-氧代六氢吡嗪并[2，1-c][1，4]噁嗪-8(1H)-基]氮杂环丁烷-1-基}丁基)-N-甲基-5-(三氟甲基)苯甲酰胺与药剂学上可接受的辅料制备成常用的口服制剂，如口服液、颗粒剂、片剂、胶囊剂。其中，药剂学上可接受的辅料包括填充剂、崩解剂、粘合剂、矫味剂、润滑剂等等。所述的填充剂选自以下的一种或多种：预胶化淀粉、乳糖、甘露醇和微晶纤维素；所述的崩解剂选自以下的一种或多种：羧甲基淀粉钠、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠和低取代羟丙基纤维素；所述的粘合剂选自以下的一种或多种：淀粉浆、羟丙基纤维素溶液、聚维酮溶液；所述的润滑剂选自以下的一种或两种：硬脂酸镁、滑石粉。

另外，本发明还提供一种化合物新用途，即：3-溴-N-((2S)-2-(4-氟苯基)-4-{3-[(9aS)-4-氧代六氢吡嗪并[2，1-c][1，4]噁嗪-8(1H)-基]氮杂环丁烷-1-基}丁基)-N-甲基-5-(三氟甲基)苯甲酰胺在制备抗癌细胞增殖的药物中的应用。优选地，所述的癌细胞包括乳腺癌细胞、胃癌细胞、宫颈癌细胞。进一步优选所述的癌细胞为乳腺癌细胞。

与现有技术相比，本发明涉及的3-溴-N-((2S)-2-(4-氟苯基)-4-{3-[(9aS)-4-氧代六氢吡嗪并[2，1-c][1，4]噁嗪-8(1H)-基]氮杂环丁烷-1-基}丁基)-N-甲基-5-(三氟甲基)苯甲酰胺，其在一定的剂量和时间范围内，能抑制人乳腺癌MCF-7细胞生长；通过光镜观察，见药物可引起肿瘤细胞出现胞浆空泡和凋亡小体，说明其具有抗癌细胞增殖的生物活性，可开发成抗肿瘤的新药。

附图说明

图1为未经药物处理的对照组MCF-7乳腺癌细胞形态；

图2为120μg/mL SD-906作用48h后MCF-7乳腺癌细胞的形态学变化；

图3为480μg/mL SD-906作用48h后MCF-7乳腺癌细胞的形态学变化。

具体实施方式

以下是该化合物的具体制备和体外试验过程，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于该试验例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

实施例1：3-溴-N-((2S)-2-(4-氟苯基)-4-{3-[(9aS)-4-氧代六氢吡嗪并[2，1-c][1，4]噁嗪-8(1H)-基]氮杂环丁烷-1-基}丁基)-N-甲基-5-(三氟甲基)苯甲酰胺的制备

(a)3-溴-N-[(2S)-2-(4-氟苯基)戊-4-烯-1-基]-N-甲基-5-(三氟甲基)苯甲酰胺

向[(2S)-2-(4-氟苯基)戊-4-烯-1-基]甲基胺(见Bioorg.Med.Chem.Lett；2001；265-270；0.54克，2.8毫摩尔)和3-溴-5-三氟甲基苯甲酸(0.81克，3.0毫摩尔)的DMF(7毫升)溶液中，加入TBTU(0.96克，3.0毫摩尔)和DIPEA(1.41克，10.9毫摩尔)。于室温氮气下搅拌反应混合物过夜，然后在乙酸乙酯和NaHCO3水溶液中分配。水相用乙酸乙酯萃取三次。合并的有机溶液用水洗涤三次，然后经相分离柱干燥。蒸发除去溶剂，产物经硅胶色谱法纯化(乙酸乙酯-庚烷10％至17％)。获得3-溴-N-[(2S)-2-(4-氟苯基)戊-4-烯-1-基]-N-甲基-5-(三氟甲基)苯甲酰胺0.86克(68％)。1H NMR(500MHz，CDCl3)：2.1-3.8(cm，8H)，4.9-5.1(m，2H)，5.5-5.8(m，1H)，6.8-7.4(cm，6H)，7.8(s，1H)。

(b)3-溴-N-((2S)-2-(4-氟苯基)-4-{3-[(9aS)-4-氧代六氢吡嗪并[2，1-c][1，4]噁嗪-8(1H)-基]氮杂环丁烷-1-基}丁基)-N-甲基-5-(三氟甲基)苯甲酰胺

向3-溴-N-[(2S)-2-(4-氟苯基)戊-4-烯-1-基]-N-甲基-5-(三氟甲基)苯甲酰胺(0.86克，1.9毫摩尔)的丙酮(45毫升)溶液中，加入OsO4(2.5％/叔丁基醇，0.49毫升，0.039毫摩尔)和4-甲基吗啉-4-氧化物(0.41克，3.5毫摩尔)。于室温氮气下搅拌溶液过夜，然后加入NaHSO3(39％，45毫升)水溶液。搅拌混合物2小时，用水稀释，然后用二氯甲烷萃取两次。合并的有机溶液用相分离柱分离，蒸发除去溶剂。将残余物(1.08克)溶于THF(18毫升)和水(4.5毫升)中，向所得溶液中加入NaIO4(0.73克，3.4毫摩尔)。室温氮气下搅拌混合物过夜。混合物在二氯甲烷和水之间分配。水相用二氯甲烷萃取，然后合并的有机溶液用盐水洗涤，并用相分离柱分离。蒸发除去溶剂，获得标题化合物0.78克(90％)。1HNMR(500MHz，CDCl3)：2.4-4.4(cm，8H)，6.8-7.8(cm，7H)，9.8(s，1H)；LCMS：m/z 447(M-1)+。

实施例2：(9aS)-8-氮杂环丁烷-3-基六氢吡嗪并[2，1-c][1，4]噁嗪-4(3H)-酮的制备

(a)(3S)-3-(羟甲基)哌嗪-1-羧酸苯甲酯盐酸盐

将(2S)-2-(羟基甲基)哌嗪-1，4-二羧酸4-苯甲酯1-叔丁酯(见WO02/000631；1.6克，4.6毫摩尔)溶于乙腈(25毫升)中，向所得溶液中加入浓HCl(1毫升)。室温搅拌混合物过夜，然后蒸发除去溶剂。获得无色油状的(3S)-3-(羟基甲基)哌嗪-1-羧酸苯甲酯盐酸盐1.3克(100％)。1H NMR(500MHz，CD3OD)：3.1-3.4(m，5H)，3.7(m，1H)，3.8(m，1H)，4.2(m，2H)，5.2(m，2H)，7.2-7.4(m，5H)；LCMS：m/z 251(M+1)+。

(b)(3S)-4-(溴乙酰基)-3-(羟基甲基)哌嗪-1-羧酸苯甲酯

将(3S)-3-(羟基甲基)哌嗪-1-羧酸苯甲酯盐酸盐(0.83克，2.9毫摩尔)溶于二氯甲烷(10毫升)和DIPEA(1.5毫升，8.6毫摩尔)中。于0℃逐滴加入溴乙酰氯(0.48克，3.0毫摩尔)。室温搅拌混合物1小时，然后加入水(10毫升)。通过相分离柱来分离相。收集有机溶液，蒸发除去溶剂。获得棕色油状的(3S)-4-(溴乙酰基)-3-(羟甲基)哌嗪-1-羧酸苯甲酯1.1克(100％)。LCMS：m/z 370(M-1)-。

(c)(9aS)-4-氧代六氢吡嗪并[2，1-c][1，4]噁嗪-8(1H)-羧酸苯甲酯

将(3S)-4-(溴乙酰基)-3-(羟基甲基)哌嗪-1-羧酸苯甲酯(1.1克，2.9毫摩尔)溶于甲苯(25毫升)中，向所得溶液中加入碳酸钾(4.0克，28.8毫摩尔)。将混合物加热至回流过夜，冷却至室温，然后过滤除去固体。蒸发除去溶剂，产物经硅胶色谱法纯化(甲醇-二氯甲烷1％至10％)。获得无色油状的(9aS)-4-氧代六氢吡嗪并[2，1-c][1，4]噁嗪-8(1H)-羧酸苯甲酯0.19克(23％)。1HNMR(500MHz，CDCl3)：2.6-3.0(m，3H)，3.4-3.6(m，2H)，4.0(d，1H)，4.1-4.3(m，4H)，4.5(d，1H)，5.1(s，2H)，7.2-7.4(m，5H)。

(d)(9aS)-六氢吡嗪并[2，1-c][1，4]噁嗪-4(3H)-酮

将(9aS)-4-氧代六氢吡嗪并[2，1-c][1，4]噁嗪-8(1H)-羧酸苯甲酯(0.19克，0.65毫摩尔)溶于乙醇(20毫升)中。将溶液转移至装有10％钯碳(0.1克)、甲酸(0.1克，2.2毫摩尔)和甲酸铵(0.2克，3.17毫摩尔)的25毫升小瓶中。用微波单节加热将混合物于120℃加热5分钟。过滤除去催化剂，(9aS)-六氢吡嗪并[2，1-c][1，4]噁嗪-4(3H)-酮的粗品溶液无需纯化和定量而用于下一步骤。

(e)(9aS)-8-[1-(二苯基甲基)氮杂环丁烷-3-基]六氢吡嗪并[2，1-c][1，4]噁嗪-4(3H)-酮

向1-(二苯基甲基)氮杂环丁烷-3-酮(见Bioorg.Med.Chem.Lett.；13；52003；2191-2194，约0.65毫摩尔)和(9aS)-六氢吡嗪并[2，1-c][1，4]噁嗪-4(3H)-酮(0.65毫摩尔)的甲醇(10毫升)溶液中，加入氰基硼氢化钠(125毫克，2.0毫摩尔)和氯化锌(135毫克，1.0毫摩尔)的甲醇(20毫升)溶液。室温搅拌反应混合物15分钟，然后蒸发除去溶剂。残余物在乙酸乙酯(50毫升)和水(20毫升)之间分配。有机溶液用盐水洗涤，然后经Na2SO4干燥。蒸发除去溶剂，将残余物溶于乙腈(10毫升)、乙酸(100毫克)和水(10毫升)的混合物中。产物用乙腈和0.1M乙酸铵水溶液的混合物经反相色谱法纯化。合并适当的部分，旋转蒸发浓缩。水性残余物用乙酸乙酯萃取，有机溶液经Na2SO4干燥。蒸发除去溶剂，获得(9aS)-8-[1-(二苯基甲基)氮杂环丁烷-3-基]六氢吡嗪并[2，1-c][1，4]噁嗪-4(3H)-酮170毫克(69％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：1.6-1.7(m，1H)，1.8-1.9(m，1H)，2.6(d，1H)，2.7-2.8(m，2H)，2.8-2.9(m，2H)，3.0(qn，1H)，3.3-3.7(m，4H)，3.9(dd，1H)，4.0-4.2(qt，2H)，4.4(s，1H)，4.5(dd，1H)，7.2(t，2H)，7.3(m，4H)，7.4(m，4H)；LCMS：m/z 378(M+1)+。

(f)(9aS)-8-氮杂环丁烷-3-基六氢吡嗪并[2，1-c][1，4]噁嗪-4(3H)-酮

将(9aS)-8-[1-(二苯基甲基)氮杂环丁烷-3-基]六氢吡嗪并[2，1-c][1，4]噁嗪-4(3H)-酮(85毫克，0.22毫摩尔)溶于乙醇(18毫升)中。将溶液转移至装有乙醇(2毫升)、10％钯碳(0.1克)、甲酸(0.1克，2.2毫摩尔)和甲酸铵(0.2克，3.17毫摩尔)的25毫升小瓶中。用微波单节加热将混合物于120℃加热5分钟。过滤除去催化剂，(9aS)-8-氮杂环丁烷-3-基六氢吡嗪并[2，1-c][1，4]噁嗪-4(3H)-酮的粗品溶液无需纯化和定量而用于下一步骤。

实施例3：3-溴-N-((2S)-2-(4-氟苯基)-4-{3-[(9aS)-4-氧代六氢吡嗪并[2，1-c][1，4]噁嗪-8(1H)-基]氮杂环丁烷-1-基}丁基)-N-甲基-5-(三氟甲基)苯甲酰胺(SD-906)的制备

向3-溴-N-((2S)-2-(4-氟苯基)-4-{3-[(9aS)-4-氧代六氢吡嗪并[2，1-c][1，4]噁嗪-8(1H)-基]氮杂环丁烷-1-基}丁基)-N-甲基-5-(三氟甲基)苯甲酰胺(实施例1制备；100毫克，0.22毫摩尔)和(9aS)-8-氮杂环丁烷-3-基六氢吡嗪并[2，1-c][1，4]噁嗪-4(3H)-酮(实施例2制备；约0.20毫摩尔)的乙醇(20毫升)溶液中，加入氰基硼氢化钠(125毫克，2.0毫摩尔)和氯化锌(135毫克，0.99毫摩尔)的甲醇(10毫升)溶液。室温搅拌反应混合物10分钟，然后蒸发除去溶剂。残余物在乙酸乙酯(50毫升)和水(20毫升)中分配。有机溶液用盐水洗涤，然后经Na2SO4干燥。蒸发除去溶剂，将残余物溶于乙腈(10毫升)、乙酸(100毫克)和水(20毫升)的混合物中。用乙腈和0.1M乙酸铵水溶液的混合物通过反相色谱法来纯化产物。将适当的部分合并，旋转蒸发浓缩。水性残余物用乙酸乙酯萃取，有机溶液经Na2SO4干燥。蒸发除去溶剂。获得标题化合物(SD-906)80毫克(55％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：0.9-3.8(cm，21.5H)，3.9(d，1H)，4.1-4.2(qt，2H)，4.4(b，0.5H)，4.5-4.6(d，1H)，6.6-7.5(cm，6H)，7.8(s，1H)；LCMS：m/z 642(M+1)+。

本发明通过研究3-溴-N-((2S)-2-(4-氟苯基)-4-{3-[(9aS)-4-氧代六氢吡嗪并[2，1-c][1，4]噁嗪-8(1H)-基]氮杂环丁烷-1-基}丁基)-N-甲基-5-(三氟甲基)苯甲酰胺(SD-906)对体外培养人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响试验，MTT实验和形态学观察结果显示，SD-906具有较好的体外抗肿瘤活性。具体地试验过程如下：

实施例4：SD-906对人乳腺癌细胞株MCF-7增殖的影响试验研究

取对数生长期的人乳腺癌细胞株MCF-7悬液接种于96孔培养板，每孔100μL(含1×10⁴个细胞)，置37℃、100％湿度、5％CO2条件培养至细胞贴壁后，换新鲜培养基并加入不同量实施例3制备的化合物SD-906，使药物终浓度分别为30、60、120、240、360、480μg/mL(每一浓度设6个复孔)处理12、24、48h后弃上清液，每孔加入90μL新鲜培养基和5％MTT 10μL，继续培养4h后弃上清液，每孔加入100μL DMSO，振荡10min，用酶联免疫检测仪测定吸光值。细胞存活率＝(实验组A值-本底A值)/(对照组A值-本底A值)×100％，实验重复3次。实验结果见表1。通过表1的体外肿瘤细胞增殖抑制试验统计结果可以看出，低浓度的SD-906(30、60μg/mL)作用24、48h，表现出一定的促细胞生长作用，但高浓度的SD-906(120、240、360、480μg/mL)对细胞有明显的生长抑制作用，并随着给药时间的延长，抑制作用也显著增强，480μg/mL的SD-906作用48h，细胞的存活率仅为1.8％。

表1：SD-906对MCF-7细胞生长的抑制作用

另外，倒置显微镜观察各组MCF-7乳腺癌细胞经SD-906干预处理后形态的变化。镜下观察发现，未经药物处理的MCF-7乳腺癌细胞贴壁伸展，相邻细胞连接成片，形态舒展，折光均匀，细胞核大而明显(见图1)。低浓度的SD-906处理48h后细胞收缩变小，与周围细胞分离，细胞核周围出现较多空泡样结构，细胞核物质边集(见图2)，而高浓度的SD-906作用48h后，部分细胞出现细胞核异常凝集、核固缩和凋亡小体形成等典型的细胞凋亡形态(见图3)。

Claims (5)

1.一种抗肿瘤细胞增殖的药物组合物，该组合物由活性成分和辅料制备而成，其特征在于：所述的活性成分包括3-溴-N-((2S)-2-(4-氟苯基)-4-{3-[(9aS)-4-氧代六氢吡嗪并[2，1-c][1，4]噁嗪-8(1H)-基]氮杂环丁烷-1-基}丁基)-N-甲基-5-(三氟甲基)苯甲酰胺。

2.根据权利要求1所述抗肿瘤细胞增殖的药物组合物，其特征在于：所述的活性成分由3-溴-N-((2S)-2-(4-氟苯基)-4-{3-[(9aS)-4-氧代六氢吡嗪并[2，1-c][1，4]噁嗪-8(1H)-基]氮杂环丁烷-1-基}丁基)-N-甲基-5-(三氟甲基)苯甲酰胺作为唯一组分组成。

3.3-溴-N-((2S)-2-(4-氟苯基)-4-{3-[(9aS)-4-氧代六氢吡嗪并[2，1-c][1，4]噁嗪-8(1H)-基]氮杂环丁烷-1-基}丁基)-N-甲基-5-(三氟甲基)苯甲酰胺在制备抗癌细胞增殖的药物中的应用。

4.根据权利要求3所述3-溴-N-((2S)-2-(4-氟苯基)-4-{3-[(9aS)-4-氧代六氢吡嗪并[2，1-c][1，4]噁嗪-8(1H)-基]氮杂环丁烷-1-基}丁基)-N-甲基-5-(三氟甲基)苯甲酰胺在制备抗癌细胞增殖的药物中的应用，其特征在于：所述的癌细胞包括乳腺癌细胞、胃癌细胞、宫颈癌细胞。

5.根据权利要求3所述3-溴-N-((2S)-2-(4-氟苯基)-4-{3-[(9aS)-4-氧代六氢吡嗪并[2，1-c][1，4]噁嗪-8(1H)-基]氮杂环丁烷-1-基}丁基)-N-甲基-5-(三氟甲基)苯甲酰胺在制备抗癌细胞增殖的药物中的应用，其特征在于：所述的癌细胞为乳腺癌细胞。