CN104886128A

CN104886128A - 镁离子在提高植物光合效率中的应用

Info

Publication number: CN104886128A
Application number: CN201510244474.5A
Authority: CN
Inventors: 李昆志; 吴远双; 陈东杰; 王平; 陈宣钦; 陈丽梅
Original assignee: Kunming University of Science and Technology
Current assignee: Kunming University of Science and Technology
Priority date: 2015-05-14
Filing date: 2015-05-14
Publication date: 2015-09-09

Abstract

本发明公开了铝胁迫下镁离子在提高植物光合效率中的应用；用铝敏感大豆SB、耐铝型大豆RB，采用不同铝浓度梯度的AlCl₃胁迫及添加镁离子处理，对光合速率、蒸腾速率等光合特性参数及质膜H⁺-ATPase的活性和磷酸化水平、14-3-3蛋白的表达水平进行了测定。结果表明，在铝胁迫处理时，两种大豆的光合特性参数都受到抑制，而在添加了镁离子的较低强度铝胁迫处理的植株中，其光合特性参数均有明显恢复，SB大豆的质膜H⁺-ATPase的活性、叶中的质膜ATPase的磷酸化水平及14-3-3蛋白的表达水平也明显增高。以上结果说明，镁离子具有从多个方面提高铝胁迫下SB、RB大豆光合效率的作用。

Description

镁离子在提高植物光合效率中的应用

技术领域

本发明属于植物光合作用领域，具体涉及铝胁迫下镁离子在提高植物光合效率上的新用途。

背景技术

研究表明酸性土壤占据世界上可耕土壤的比例达40%，主要分布在热带、亚热带及温带，发展中国家尤为明显。中国的酸性土壤主要是酸性富铝化土壤（以红壤为主），占全国土地总面积的21％左右，主要分布在长江以南的热带地区、亚热带地区及云贵川地区，面积高达200多万公顷。这些地方气温高、雨量大，年降雨多在1500mm以上。这种高温多雨、湿热同季的特点，使土壤的风化和成土作用均甚强烈，生物物质的循环十分迅速。盐基高度不饱和，pH一般在4.5-6。近年来，随着全球环境的日益恶化，土地的集约化管理，化肥的大量使用，许多地方已出现了酸雨危害，加速了土壤酸化，致使我国酸性土壤面积呈现逐渐扩大的趋势，同时使土壤的酸度增强，导致土壤释放大量的铝离子，严重制约了植物的生长。铝已被认为是酸性土壤中限制植物生长的一个重要因素。因此，近年来铝胁迫受到国内外研究者的普遍关注。

目前国内外关于铝对植物毒害方面的研究取得了较大进展，发现铝胁迫下多种植物，如水稻、大豆等的光合作用受到抑制。在叶片光合作用过程中，CO₂ 从空气中向叶绿体光合部位扩散受诸多因素影响，如气孔导度、保卫细胞间 CO₂ 浓度等。铝胁迫还可能使植物叶片的细胞结构发生了变化，包括对气孔的保卫细胞和叶绿素的分子结构的破坏等。逆境胁迫条件下通常会导致叶片气孔导度下降、蒸腾作用减弱，导致光合速率降低，从而影响植物的生长和作物的产量。因此找到一种高效、低廉而又易于使用的提高植物光合效率的促进剂来解决铝胁迫抑制光合作用的问题是具有重大的现实和应用意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种在铝胁迫下提高植物光合速率、蒸腾速率、气孔导度等的矿物质，即铝胁迫下镁离子在提高植物光合效率中的应用。

为了实现本发明的上述目的，本发明的技术方案如下：

(1) 考虑到不同品种的大豆本身的生理特性及对铝胁迫的响应存在一定差异，选择了云南本地的铝敏感大豆SB（下称SB）、耐铝型大豆RB（下称RB）品种进行了以下试验；

(2) 将SB和RB饱满种子进行种子消毒，25℃黑暗下催芽萌发，待根长出2cm转入0.5 mmol/L CaCl₂溶液中平衡一天，再转移至1/4的Hoagland培养液一周，长出二叶后转移至Hoagland培养液培养；

(3) 待SB、RB苗长到四对叶片时选择长势一致的健壮植株，分别在含0、50、100、200、400 μmol/L AlCl₃的铝胁迫处理的Hoagland培养液中加入100 μmol/L MgCl₂，对SB、RB苗处理4天，并以相同浓度AlCl₃胁迫的植株作为对照，每个处理设置三个重复，取SB、RB苗从上往下数的第二对叶进行光合特性参数及相关蛋白表达水平的测定。

本发明以镁离子作为提高铝胁迫下大豆光合作用速率的促进剂，成本低，容易实施，可以添加到农肥中，也可以单独使用。镁离子能显著提高大豆各项光合特性参数，将微量元素对植物生长的显著作用发掘出来，尤其是用于对铝胁迫环境中的植物生长的调节，为进一步开发相关产品提供了思路。

本发明的有益效果：本发明所述的提高植物光合特性参数能力的镁离子，具有投入低、操作简单、效率高的特点；镁离子是植物所必需的一种微量矿物质元素，存在于植物体内叶绿素分子中心，也是一些酶，如H⁺-ATPase等的激动剂。在铝胁迫条件下，Al³⁺会竞争Mg²⁺在植物体内的结合位点，导致植物体内有效的镁离子的量减少，因此加大镁离子的量，能有效增加镁离子的量，降低铝胁迫所产生的负面效应，间接恢复植物的光合效率及相关酶的活性，对提高大豆的产量有重要意义。

附图说明

图1是本发明中RB和SB大豆中镁离子对不同浓度铝胁迫下大豆净光合速率的影响；

图2是本发明中RB和SB大豆中镁离子对不同浓度铝胁迫下大豆蒸腾速率的影响；

图3是本发明中RB和SB大豆中镁离子对不同浓度铝胁迫下大豆气孔导度的影响；

图4是本发明中SB大豆叶中镁离子对不同浓度铝胁迫下大豆质膜H⁺-ATPase活性的影响；

图5是本发明中SB大豆根中镁离子对不同浓度铝胁迫下大豆质膜H⁺-ATPase活性的影响；

图6是本发明中在SB大豆叶和根中镁离子对不同浓度铝胁迫下大豆质膜H⁺-ATPase磷酸化水平影响的Western blotting 图；

图7是本发明中在SB大豆叶和根中镁离子对不同浓度铝胁迫下大豆质膜H⁺-ATPase磷酸化水平影响的Western blotting结果的量化图；

图8是本发明中在SB大豆叶和根中镁离子对不同浓度铝胁迫下大豆14-3-3蛋白表达量影响的Western blotting 图；

图9是本发明中在SB大豆叶和根中镁离子对不同浓度铝胁迫下大豆14-3-3表达量影响的Western blotting结果的量化图。

具体实施方式

下面通过实施例和附图对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。实施例中方法如无特殊说明，按常规操作进行，如无特殊说明使用试剂均为常规购试剂或按常规方法配制的试剂，如无特殊说明方法中百分数均为质量百分数。

实施例1：SB、RB植株的栽培和处理，具体步骤如下：

1、实验材料为SB、RB幼苗

SB、RB种子消毒催芽后，25℃黑暗下催芽萌发，待根长出2cm转入0.5mmol/L CaCl₂溶液中平衡一天，再转移至1/4的Hoagland培养液一周，长出二叶后转移至Hoagland培养液培养，待幼苗长至四对叶时用于本实验；

2、配置浓度0、50、100、200、400 μmol/LAlCl₃处理液及添加100 μmol/L MgCl₂的AlCl₃处理液；以浓度为0的AlCl₃未添加MgCl₂处理的植株作为对照（CK）；

3、分别用上述不同浓度AlCl₃处理液及添加100 μmol/L MgCl₂的AlCl₃处理液处理SB、RB幼苗，4天后，取样进行光合速率、蒸腾速率、气孔导度的测定；同时液氮速冻后，-80℃低温保存根及叶片材料，用于质膜ATPase的表达水平及14-3-3蛋白表达水平的检测。

实施例2：采用实施例1中第3步处理4天后的植株，使用北京雅欣理仪科技有限公司的Yaxin-1102便携式光合蒸腾仪，按照说明书对大豆净光合速率、蒸腾速率、气孔导度进行测定；结果如图1所示，在AlCl₃ 处理的情况下，RB大豆的净光合速率下降不如SB大豆明显，仅用MgCl₂处理的情况下， RB和SB的净光合速率均升高，RB比SB的升高得更明显，而在一定浓度（50、100、200 μmol/L）的铝胁迫处理下添加镁离子时，在铝胁迫浓度较低时两种大豆的光合速率均相对增高，SB则比RB增高得更明显。以上结果说明MgCl₂具有促进铝胁迫下两种大豆的光合速率的作用，尤其是对铝敏感型大豆更有效，这可能与大豆的耐铝机制有关。蒸腾速率和气孔导度测定的结果与光合速率的结果一致，结果如图2、图3所示，说明Mg²⁺对两种大豆光合速率的影响和这两个指标相关。

实施例3：取实施例1中处理4天的SB大豆根部作为研究材料，将质膜分离与纯化后，使用Bradford的方法测定质膜蛋白的浓度，检测质膜蛋白的纯度并测定质膜H⁺-ATPase的活性；H⁺-ATPase活性的测定在0.5 ml的反应体系中进行的；反应体系包含50 mM BTP/MES、 5 mM MgSO₄、50 mM KCl、0.02% Brij (w/v)、50 mM KNO₃、1 mM （NH₄）₂MoO₄、1 mM NaN₃、4 mM ATP-Na₂，加入500 μg的质膜蛋白后启动反应；将反应混合物置于30℃水浴30min后，加入反应终止液1 ml [含2% H₂SO₄ (v/v)、5% SDS (w/v)和0.7% (NH₄)₂MoO₄ (w/v)]后，立即加入50 μl Vc并于室温下放置约20 min，测定波长为700 nm处的吸光值。根据无机磷标准曲线计算无机磷的释放含量，1单位的质膜H⁺-ATPase活性定义为：在30℃的反应条件下，在1分钟内每毫克蛋白催化ATP分解释放无机磷酸的μM数。

如图4所示，不论是否有铝胁迫，SB的质膜H⁺-ATPase的活性均很低，且在铝胁迫条件下的质膜H⁺-ATPase活性比无铝条件下低1倍左右，当添加了镁离子后，铝胁迫下的SB大豆叶中质膜H⁺-ATPase的活性提高到原来的7-8倍左右，无铝条件下的提高更多，结果如图4所示。但是在SB大豆根中H⁺-ATPase的活性变化不明显，结果如图5所示，说明镁离子能通过影响叶中H⁺-ATPase的活性来提高SB大豆的光合速率。

实施例4：采用实施例1中第3步冻存的SB叶片及根，用Western Blotting和免疫共沉淀（CO-IP）的方法对两种大豆质膜ATP酶的磷酸化水平及14-3-3蛋白表达水平及其互作的检测，具体方案如下：

1、分别提取两种大豆叶片及根中的总蛋白

分别称取叶片及根尖0.5 g，在液氮中研磨至粉末状，加入1 ml蛋白提取液（体积比10%甘油、10 mM Tris-HCl、1 mM PMSF、质量体积比浓度5% PVP、10 mM巯基乙醇），待溶液溶解后继续研磨，使其充分混匀，最大限度提取蛋白质。将溶液转移至2 ml的离心管中，4℃、13000 rpm离心20 min，取上清液，并加入固体硫酸铵，直至蛋白完全沉淀；4℃、13000rpm，离心20 min收集蛋白沉淀物；用500 μl 1x PBS buffer (8 g/L NaCl、0.2 g/L KCl、2.9 g/L Na₂HPO₄·12H₂O、0.2 g/L KH₂PO₄) 溶解收集到的蛋白沉淀；随后，用Bradford方法测定蛋白质的浓度(加入200 μl Bradford、800 μl去离子水、5 μl蛋白溶液)，于595 nm处测定蛋白OD值)，确定总蛋白的浓度。

2、根据总蛋白的浓度计算出电泳需加入的组织总蛋白体积，然后加入等体积的2×蛋白上样缓冲液(0.25 M Tris-HCl(pH 6.8)、10% SDS（w/v）、0.5% BPB（w/v）、 50%甘油(v/v)、5%β-巯基乙醇（w/v）），于沸水中煮沸15 min后冰上静置5-10 min；经10% SDS-PAGE分离后，经半干式转膜仪将胶上蛋白转移到PVDF膜上后，然后再分别加入Arabidopsis AHA3（拟南芥质膜H⁺-ATPase）的C端抗体和Malus domestica(苹果)14-3-3蛋白抗体作为一抗，常温孵育2-3h，接着用偶联过氧化物酶的羊抗兔IgG的抗体常温孵育2h，最后加入产生荧光的反应底物，通过凝胶成像仪观察并照相。

研究结果发现，在SB大豆的叶和根中，铝胁迫下其质膜H⁺-ATPase的磷酸化水平均下降，但加入镁离子后均升高，结果如图6、图7所示。与质膜H⁺-ATPase互作的14-3-3蛋白的水平也是相同的趋势，结果如图8、图9所示。H⁺-ATPase的磷酸化水平在根中的变化更为明显，但与其互作的14-3-3蛋白变化则不如叶明显，说明两种蛋白的互作在根和叶中可能产生不同的生理效应，镁离子通过不同途径提高两种大豆对铝胁迫的耐受性。

Claims

1.镁离子在提高植物光合效率中的应用。