CN104884933A - 液体向液体的生物粒子分级和浓缩 - Google Patents

Abstract

本公开提供了用于从流体样品分级和浓缩粒子的装置、系统和方法。这包括含有分级式滤器的滤筒，所述滤器具有多孔表面且按递减的孔眼尺寸排列，用于从流体样品捕获粒子；以及与所述滤筒流体连通的渗透压力源；其中将所述粒子从所述多孔表面洗脱并分发到减小的流体体积中。

Description

液体向液体的生物粒子分级和浓缩

本专利申请要求2012年10月18日提交的美国临时专利申请系列号61/715,451的优先权，所述临时专利申请的内容在此整体通过参考并入本公开。

政府利益

本公开的主题内容在美国国土安全部(Department of HomelandSecurity)(DHS)授予的资助号为D12PC00287的美国政府支持下做出。美国政府在本公开的主题内容中具有一定权利。

技术领域

本公开的主题内容总的来说涉及样品制备领域。更具体来说，本公开的主题内容涉及用于分级(fractionate)和浓缩流体样品内的物质的装置、系统和方法。

背景技术

检测和定量空气和液体中的粒子的困难是众所周知的。当浓度下降时，现有的系统都开始趋向失败，直至随着被分析物浓度减小，最终完全不能检测。这对国家安全造成严重问题，例如2001年的邮件炭疽病袭击和随后的反恐战争已揭示出在生物威胁物的取样和检测方面的不足之处。医学领域同样受到现有的检测限的影响，环境科学也是如此。

在生物防御和气溶胶研究领域中，通常使用湿式旋风分离器或类似的装置将气溶胶收集在液体样品中。将气溶胶收集在水性样品中，以便可以使用主要要求样品被包含在液体中的标准技术来进行随后的生物粒子分析。这些“湿式”收集器具有许多缺点，包括：难以维持设定的流体体积，与粒子物质在装置中积累相伴的难题，以及对在变化的环境条件下储存流体的要求。

长期以来，干式滤器已被用于收集气溶胶以及从液体收集粒子。然而，干式滤器主要不能用于鉴定生物粒子，因为检测器通常要求液体样品，并且将粒子移除到液体中是极为困难的。用于从平板式滤器移除粒子的方法是常见的，但也是繁琐、低效的，且需要大量液体。

从液体浓缩粒子传统上使用离心来进行。使用离心力按照混合物中存在的各个组分的密度差来分离混合物。这种力分离混合物，在管的底部形成相对致密的材料球粒。然后可以将被称为上层清液或上清液的剩余溶液小心地从管中倾倒出来而不扰动所述球粒，或使用巴氏(Pasteur)吸管吸出。离心速率由施加到样品的加速度指定，并且通常用每分钟转数(RPM)或离心力度量。在离心中的粒子沉降速度是粒子的尺寸和形状、离心加速度、存在的固体的体积分数、粒子与液体之间的密度差和液体的粘度的函数。

与离心技术相伴的问题限制了它的适用性。微米尺寸范围内的粒子的沉降速度相当低。因此，这些粒子的离心浓缩花费数分钟至数小时。实际时间随着样品的体积、所使用的设备和操作人员的技能而变。

离心技术是繁琐的，因为它们通常由大量步骤构成，每个步骤要求操作人员进行高度浓缩。大多数微生物实验室每天通过离心处理大量样品。由于繁琐性，人为误差的可能性高，并且这些技术的自动化是困难且高成本的。离心通常还需要供电设备。因此，许多情况例如紧急响应阻碍了它们的使用。

已经探索了其他的浓缩技术，它们主要分成三种技术类别——基于微流体/电泳、基于过滤和基于捕获的技术。然而，这些技术各自具有阻碍它们在某些情况下使用的缺点。

发明内容

鉴于常规技术的限制，需要的是用于将流体样品分级和浓缩成数种组分浓度的单一装置。

在这样做时，本公开的主题内容提出了新的、快速、高效的、单程的基于膜滤器的分级和浓缩装置、系统和方法，其将悬浮在来自于稀进料悬液(“进料”)的液体中的粒子、特别是生物粒子分级并浓缩成经尺寸分级并浓缩的样品悬液(阻留物)，在独立的液流中排除分离的流体(透过物)。本公开的主题内容对于直径为约0.001微米至20微米的尺寸范围内的悬浮生物粒子例如蛋白质/毒素、病毒、DNA和细菌的分级和浓缩来说是特别有用的。这些粒子的浓缩对于检测稀悬液中的目标粒子来说是有利的，因为将它们浓缩到小体积中使它们更容易检测。分级以“级联”方式进行，以便将残留在分离的流体中的低于每个前一级的截留尺寸的粒子浓缩在浓缩的样品悬液中。这一过程也可用于产生“带通”浓缩，用于浓缩狭窄范围内的特定目标尺寸的粒子。所述装置使用进料侧上的压力、透过物侧上的真空和/或机械剪切来加速分离过程，并且可以包括添加的表面活性剂以提高效率。集成的气动阀、液压阀或机械阀和新的真空启动程序允许湿滤膜启动并同时减小装置中的液体滞留体积。该级联滤器堆叠体的独特之处在于所述样品流垂直于包封在外壳中的串联的滤器堆叠体的表面，每个滤器之间仅具有小的开放间隙空间，并且所述滤器的洗脱通过平行于阻留物滤器表面或与所述表面相切进行的同时的湿泡沫洗脱，通过所述小的间隙空间来进行。泡沫洗脱在每个滤器级上同时进行，使得在洗脱期间横跨每个膜的跨膜压力保持基本为零或接近于零。通过这种方式，洗脱流体通过膜的流动被消除或显著减小，使得切向流速和洗脱效率被最大化。提取泡沫可以从加压气体和溶解在收集流体中的表面活性剂制备得到。

在一种示例性实施方式中，本公开的主题内容是一种用于从流体样品分级和浓缩粒子的装置。所述装置包括含有分级式滤器(stagedfilters)的滤筒，所述滤器具有多孔表面且按递减的孔眼尺寸排列，用于从流体样品捕获粒子；以及与所述滤筒流体连通的渗透压力源；其中将所述粒子从所述多孔表面洗脱并分发到减小的流体体积中。

在另一种示例性实施方式中，本公开的主题内容是一种用于从流体样品分级和浓缩粒子的系统。所述系统包括容纳流体样品的储存器；包括两个或更多个分级式滤器的分级和浓缩滤筒；与所述滤筒流体连通的渗透压力装置；浓缩单元，其包括驱动集成阀，以将样品移动通过所述滤筒；以及流体分发器源，用于从滤筒分级式滤器收集浓缩的样品；其中将所述流体样品移动通过所述浓缩单元，然后将所述浓缩的样品从所述滤器洗脱并分发。

在又一种示例性实施方式中，本公开的主题内容是一种用于从流体样品快速分级和浓缩粒子的系统。所述系统包括将样品导入到样品储存器中；启动分级和浓缩循环；将所述流体样品通过一系列滤器；从每个滤器级洗脱粒径逐渐减小的大量粒子；以及从每个滤器级提取浓缩的样品。

附图说明

图1A示出了本公开主题内容的示例性实施方式的五级流体装置的歧管部分。

图1B示出了本公开主题内容的示例性实施方式的五级流体装置的夹持部分。

图1C示出了本公开主题内容的示例性实施方式的五级流体装置的分解视图。

图2示出了本公开主题内容的示例性实施方式的五级流体装置的内部流体体积视图。

图3示出了本公开主题内容的示例性实施方式的二级流体装置的内部流体体积视图。

图4示出了本公开主题内容的示例性实施方式的三级流体装置的内部流体体积视图。

图5示出了本公开主题内容的示例性实施方式的分级和浓缩的流程图。

图6示出了本公开主题内容的示例性实施方式的双滤筒系统。

图7A示出了本公开主题内容的示例性实施方式的具有集成的滤器支承物的二级滤器堆叠体的横截面视图。

图7B示出了本公开主题内容的示例性实施方式的不具有滤器支承物的二级滤器堆叠体的横截面视图。

图8A-8X示出了本公开主题内容的示例性实施方式的用于分级和浓缩的方法的流程图和详细步骤。

具体实施方式

本公开的主题内容总的来说涉及生物恐怖主义安保、医学和环境科学领域。空气携带的生物威胁物的快速可靠的检测是保护平民和军人免于流行病大爆发和生物恐怖主义事件的显著需求。一流的生物威胁物检测系统使用气溶胶收集器将粒子捕获在2至12mL范围内的液体体积中。然后使用多种样品制备技术对样品进行处理，并通过快速微生物学方法(包括实时定量聚合酶链反应(qPCR)和超高通量测序(UHTS)和/或基于培养的金标准方法)进行分析。尽管快速检测器、收集器和鉴定器的技术水平在近年来已取得巨大进步，但样品制备技术的发展显著落后，在这些技术中需要相当大的改进。

用于空气携带的生物威胁物的检测/收集/鉴定系统必须在所有类型的户内和户外环境中恰当地运行。城市、工业和乡村的户外环境和户内环境包括从非常低到非常高的粒子浓度。在这些变化的环境中，威胁物的检测通常依赖于系统在可能是有机和无机碎片粒子、无害微生物、花粉、真菌孢子和哺乳动物细胞的高度变化的复杂混合物中捕获和识别稀少的威胁物粒子的能力。

需要更好的自动样品制备技术，以便可以克服目前与复杂环境样品中稀少粒子的检测相关的问题。由于粒子和化学抑制剂的变化的高度复杂的混合物，由环境碎片造成的鉴定技术的抑制是伴随这些系统的常见问题。UHTS、qPCR和其他快速检测技术也可能由于高水平的背景混杂物而失效。由高的背景混杂物水平造成的用于UHTS数据分析的生物信息学系统的故障，是在先进测序技术可以被改造以适应于自主生物威胁物检测应用之前必须克服的最大障碍之一。另外还存在的一个显著要求是，能够在来自于完整活细胞的目标因子与作为游离DNA或游离蛋白质存在的目标因子之间做出区分。不能快速确定目标粒子是完整活细胞还是仅仅作为游离DNA或蛋白质特征物(signature)(这是当前的生物威胁物检测系统中的规范)存在，就不允许组织将可能的实际恐怖主义事件与潜在灾难性的与恶作剧或自然事件相关的假警报区分开。

气溶胶样品和其他重要样品(例如表面、液体、临床、食物等)通常含有显著量和广范围的非靶碎片，包括有机和无机物质以及生物材料。如上所述，这些非靶材料可以以常见的抑制副作用显著影响样品制备和因子鉴定技术的性能。对于除去这些抑制剂来说，存在常规样品制备技术，但它们是缓慢的并且在处理体积仅为数百微升时性能最好——显示了收集的样品量与可以通过可用技术处理和分析的体积之间的失配。这种失配将真实的系统检测限升高到显著高于所需检测限的水平，并且在只存在痕量水平的特征物(真实情况往往如此)时产生假阴性结果的显著可能性。

广范围的现有和正在开发的快速分析平台是用于检测和鉴定需求的潜在有用的技术。检测和鉴定可以提供关于完整生物体、核酸或蛋白质的线索。基于培养的分析、抗生素敏感性试验和功能测定法都要求活生物体样品。常用的核酸技术包括qPCR、UHTS和杂交阵列。ELISA和其他免疫测定技术、质谱术、层析技术以及其他技术可用于蛋白质分析。在某些情况下偏好地选择这些技术之一或者在某些情况下使用超过一种技术进行分析，存在显著的理由。此外，某些技术使其自身能够在自主检测平台中使用，而某些技术只能在实验室背景中使用。此外，难以确定哪些技术在不久的将来由于成本下降或开发出新的改进方法而获得领先。在确定可以使用何种检测和鉴定系统上的困难，确保了对能够以浓缩形式为每种潜在的分析类型提供所需样品级分的即插即用型(plug-and-play type)样品制备系统的需求。

需要稳健、快速和灵敏的检测系统，但由于在样品制备方面的缺陷，目前大多数系统不能满足这些需求。样品制备系统必须能够自主运行一个月或更长时间而不需维护。通常引起鉴定器出问题的同样的环境粒子和抑制剂，也可以引起样品制备系统故障，尤其是在长时期重复使用后。用于这些复杂样品的样品制备方法所需的时间占鉴定所需总时间的大部分，并且尽管如此，所述方法也只能处理非常小部分的可用样品。

本公开的主题内容提出了一种同时将多种组分分级的新技术。它可用于大量领域中，包括但不限于生物恐怖主义检测。例如，示例性的具体应用领域包括但不限于：

1.生物恐怖主义威胁因子的气溶胶取样

a.其中所述样品产生用于分析的液体样品

b.其中所述样品可能含有据认为对人类健康有显著威胁的目标因子

i.其中潜在威胁性(目标)因子的名单可以从美国食品和药品监督管理局的疾病控制和预防中心(CDC)选择因子A、B或C名单获取(参见下面的名单1)

c.其中所述样品可能含有据认为对人类、动物或植物健康有威胁，造成社会混乱和经济伤害的目标因子

i.其中潜在威胁性(目标)因子的名单可以从CDC因子名单(http://www.bt.cdc.gov/agent/agentiist.asp)或下面的名单2获取

d.其中得到的样品可能含有对于通过所选方法进行检测来说浓度过低的试验粒子、目标因子或替代物

i.其中将所述样品浓缩在较小体积中，可以导致通过下列方法之一或组合来检测目标威胁因子：

1.其中威胁因子的检测通过聚合酶链反应(PCR)或类似PCR的方法来进行

2.其中目标威胁因子的检测通过免疫测定法来进行

3.其中目标威胁因子的检测通过紫外光荧光方法来进行

ii.或者其中产生无检测结果的浓缩和分析可以提供下述保证，即，如果存在目标因子，它也以非常低的量存在，使得对受影响群体产生的风险是极低的

iii.其中将样品分离成所需尺寸的级分，可以将目标粒子浓缩到分开但经同等浓缩的尺寸的级分中，用于通过上面1.c.i.中列出的不同检测方法进行分析，例如：

1.分离和浓缩大于0.2微米的粒子，以分离和浓缩细菌

iv.其中可以分离出并浓缩小的尺寸范围或“带通”，以质询特定威胁因子或替代物，例如：

1.分离和浓缩直径0.2微米至直径2微米的粒子，以将细菌孢子与初始样品中存在的更小和更大的粒子分离开并将它们单独浓缩

2.分离和浓缩直径为0.005微米至0.2微米的粒子，以将大多数病毒与初始样品中存在的更小和更大的粒子分离开并将它们单独浓缩(实例包括马脑炎病毒或VEE；直径为0.06微米)

3.分离和浓缩0.001微米(约5千道尔顿)至0.01微米(约100千道尔顿)的粒子，以将毒素和蛋白与初始样品中存在的更小和更大的粒子分离开并将它们单独浓缩

2.进行上述类型的取样和分析，用于国土安全、企业安全和军事力量保护领域：

a.自动取样和分析系统，例如为政府计划Portal Shield、生物检测系统联合计划(Joint Programs Biological Detection System)(JPBDS)、美国邮政服务生物检测系统(US Postal Service BiologicalDetection System)(BDS)所开发的系统，和正在开发的系统例如生物气溶胶网络化检测(Biological Aerosol Networked Detection)(BAND)系统和快速气溶胶生物鉴定系统(Rapid Aerosol BiologicalIdentification System)(RABIS)

b.手动系统，例如使用空气/液体撞击器(包括全玻璃撞击器(AGI-30,Ace Glass,Inc.,Vineland,NJ)、Greenburg-Smith撞击器和SKC Biosamplers)的生物气溶胶收集，提供20-100mL尺寸范围内的样品，并且可以使用InnovaPrep装置和本文中描述的方法将所述样品浓缩到4-400uL体积范围

c.通过手动擦拭表面在湿拭子、垫或过滤材料片上获得的样品，通常被获取用于生物恐怖主义安保监测，并且通常被提取到一定体积液体中，产生2至20mL体积的初始样品。可以使用InnovaPrep类似将这些的样品快速浓缩至4-400uL范围内的小得多的体积

3.生物恐怖主义威胁因子的水取样

a.其中所述样品可能含有据认为通过摄食或接触对人类健康有显著威胁的目标因子

i.其中潜在威胁性(目标)因子的名单可以从美国食品和药品监督管理局的疾病控制和预防中心(CDC)选择因子A、B或C名单获取(参见下面的名单1)

b.其中所述样品可能含有据认为对人类、动物或植物健康有威胁，造成社会混乱和经济伤害的目标因子

i.其中潜在威胁性(目标)因子的名单可以从CDC因子名单(http://www.bt.cdc.gov/agent/agentiist.asp)或下面的名单2获取

c.其中得到的样品可能含有对于通过所选方法进行检测来说浓度过低的试验粒子、目标因子或替代物

i.其中将所述样品浓缩在较小体积中，可以导致通过下列方法之一或组合来检测目标威胁因子：

1.其中威胁因子的检测通过聚合酶链反应(PCR)或类似PCR的方法来进行

2.其中目标威胁因子的检测通过免疫测定法来进行

3.其中目标威胁因子的检测通过紫外光荧光方法来进行

ii.或者其中产生无检测结果的浓缩和分析可以提供下述保证，即，如果存在目标因子，它也以非常低的量存在，使得对受影响群体产生的风险是极低的

iii.其中将样品分离成所需尺寸的级分，可以将目标粒子浓缩到分开但经同等浓缩的尺寸的级分中，用于通过上面1.c.i.中列出的不同检测方法进行分析，例如：

1.分离和浓缩大于0.2微米的粒子，以分离和浓缩细菌

iv.其中可以分离出并浓缩小的尺寸范围或“带通”，以质询特定威胁因子或替代物，例如：

1.分离和浓缩直径0.2微米至直径2微米的粒子，以将细菌孢子与初始样品中存在的更小和更大的粒子分离开并将它们单独浓缩

2.分离和浓缩直径为0.005微米至0.2微米的粒子，以将大多数病毒与初始样品中存在的更小和更大的粒子分离开并将它们单独浓缩(实例包括马脑炎病毒或VEE；直径为0.06微米)

3.分离和浓缩0.001微米(约5千道尔顿)至0.01微米(约100千道尔顿)的粒子，以将毒素和蛋白与初始样品中存在的更小和更大的粒子分离开并将它们单独浓缩

4.进行上述类型的取样和分析，用于国土安全、企业安全和军事力量保护领域：

a.从用于为公众消费和政府用途产生饮用水的水源获取的水样品

b.为确定生物恐怖主义因子的产生来源而获取的水样品

c.为确定生物去污染是否有效而获取的水样品

5.用于生物恐怖主义威胁因子的农业样品

a.其中所述样品可能含有据认为对植物或动物的健康具有显著威胁或在摄食被污染的农业产品后间接地对人类具有显著威胁的目标因子

b.其中所述样品是液体或可以被提取到液体中用于分析

i.其中潜在威胁性(目标)因子的名单可以从美国食品和药品监督管理局的疾病控制和预防中心(CDC)选择因子A、B或C名单获取(参见下面的名单1)

c.其中所述样品可能含有据认为对人类、动物或植物健康有威胁，造成社会混乱和经济伤害的目标因子

i.其中潜在威胁性(目标)因子的名单可以从CDC因子名单(http://www.bt.cdc.gov/agent/agentiist.asp)或下面的名单2获取

d.其中得到的样品可能含有对于通过所选方法进行检测来说浓度过低的试验粒子、目标因子或替代物

i.其中将所述样品浓缩在较小体积中，可以导致通过下列方法之一或组合来检测目标威胁因子：

1.其中威胁因子的检测通过聚合酶链反应(PCR)或类似PCR的方法来进行

2.其中目标威胁因子的检测通过免疫测定法来进行

3.其中目标威胁因子的检测通过紫外光荧光方法来进行

ii.或者其中产生无检测结果的浓缩和分析可以提供下述保证，即，如果存在目标因子，它也以非常低的量存在，使得对受影响群体产生的风险是极低的

iii.其中将样品分离成所需尺寸的级分，可以将目标粒子浓缩到分开但经同等浓缩的尺寸的级分中，用于通过上面1.c.i.中列出的不同检测方法进行分析，例如：

1.分离和浓缩大于0.2微米的粒子，以分离和浓缩细菌

iv.其中可以分离出并浓缩小的尺寸范围或“带通”，以质询特定威胁因子或替代物，例如：

1.分离和浓缩直径0.2微米至直径2微米的粒子，以将细菌孢子与初始样品中存在的更小和更大的粒子分离开并将它们单独浓缩

2.分离和浓缩直径为0.005微米至0.2微米的粒子，以将大多数病毒与初始样品中存在的更小和更大的粒子分离开并将它们单独浓缩(实例包括马脑炎病毒或VEE；直径为0.06微米)

3.分离和浓缩0.001微米(约5千道尔顿)至0.01微米(约100千道尔顿)的粒子，以将毒素和蛋白与初始样品中存在的更小和更大的粒子分离开并将它们单独浓缩

v.其中干扰性粒子例如柴油烟碳的排除是合乎需要的，以提高分析方法的性能[干扰的最小化或“对比”的提高对于所有领域来说都可能是合乎需要的]

6.进行上述类型的取样和分析，用于国土安全、企业安全和军事力量保护领域：

a.其中监测食品例如牛奶中的毒素污染例如由蓖麻毒素造成的污染

b.其中监测肉类加工厂中由大肠杆菌(E.coli)、李斯特菌(Listeriaspp.)造成的生物污染。进行这样的监测也是为了质量保证，例如危害评估和关键控制点(HACCP)计划

c.用于瓶装水生产

本公开的主题内容可用于协助鉴定来自于下列名单的因子：

名单1：CDC A类和B类生物恐怖主义因子名单

A类(定义如下)

炭疽(炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis))

肉毒杆菌中毒(肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)毒素)

鼠疫(鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis))

天花(重型天花(variola major))

土拉菌病(土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis))

病毒性出血热(丝状病毒[例如埃博拉病毒、马堡病毒]和沙粒病毒[例如拉沙病毒、马秋波病毒])

B类(定义如下)

布鲁氏菌病(布鲁氏菌物种(Brucella species))

产气荚膜梭状芽胞杆菌(Clostridium perfringens)的ε毒素

食品安全威胁物(例如沙门氏菌物种(Salmonella species)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)O157:H7、志贺氏菌(Shigella))

鼻疽病(鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia mallei)

类鼻疽(类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pseudomallei))

鹦鹉热(鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci))

Q热(贝纳特氏立克次体(Coxiella burnetii))

来自于蓖麻(Ricinus communis)(蓖麻籽)的蓖麻毒素

葡萄球菌肠毒素B

斑疹伤寒(普氏立克次体(Rickettsia prowazekii))

病毒性脑炎(甲病毒[例如委内瑞拉马脑炎、东方马脑炎、西方马脑炎])

水安全威胁物(例如霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、小球隐孢子虫(Cryptosporidium parvum))

名单2：二级潜在生物威胁因子

病毒/朊病毒

黄病毒(黄热病病毒、西尼罗病毒、登革热、日本脑炎、TBE等)

Hep A、B、C

朊病毒(CJD、BSE、CWD)

甲病毒(VEE、EEE、WEE)

尼帕病毒

狂犬病病毒

鼻病毒(可能被修饰？)

脊髓灰质炎病毒

汉坦病毒

丝状病毒(埃博拉病毒、马堡病毒、拉沙病毒)

杆菌

结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)，耐药TB之外的分支杆菌，如麻风杆菌(C.leprae)

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)

化脓性链球菌(S.pyogenes)

金黄色葡萄球菌(S.aureus)

破伤风梭状芽孢杆菌(Clostridium tetani)

艰难梭状芽孢杆菌(C.difficile)

蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)

贝纳特氏立克次体(Coxiella burnetii)(Q热)

土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)

回归热疏螺旋体(Borrelia recurrentis)

立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)

普氏立克次体(R.prowazekii)

宋内志贺菌(Shigella sonnei)

汉氏巴尔通体(Bartonella henselae)

小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterolitica)

假结核耶尔森氏菌(Y.pseudotuberculosis)

脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)

嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)

类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pseudomallei)

败血性巴氏杆菌(Pasturella multocida)

其他病原微生物

小球隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)

荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)

新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)

黑曲霉(Aspergillus niger)

病原性真菌

枝顶孢属物种(Acremomium spp.)

互隔交链孢霉(Alternaria alternate)

雅致鳞质霉(Apophysomyces elegans)

土曲霉(Aspergillus terreus)

双极霉属物种(Bipolaris spp.)

长穗双极霉(Bipolaris spicifera)

头状芽生裂殖酵母(Blastoschizomyces capitatus)

克柔假丝酵母(Candida krusei)

葡萄牙假丝酵母(Candida lusitaniae)

斑替支孢瓶霉(Cladophialophora bantiana)

Cunnihamella berholletiae

月状弯孢霉(Curvularia lunata)

嘴突脐孢(Exserohilum rostratum)

串珠镰孢霉(Fusarium moniliforme)

腐皮镰孢霉(Fusarium solani)

异常汉逊酵母(Hansenula anomala)

可可毛色二孢菌(Lasiodilodia theobromae)

糠秕马拉色菌(Malassezia furfur)

淡紫色拟青霉(Paecilomyces lilacinus)

蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces bariotii)

马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)

弯曲单胞瓶霉(Phialemonium curvatum)

寄生瓶霉(Philophora parasitica)

烂木瓶霉(P.richardsiae)

枝氯霉属物种(Ramichloridium spp.)

微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)

Rhizopus rhizopodiformus

深红酵母(Rhodotorula rubra)

酿酒酵母(Sacchromyces cerevisiae)

多育赛多孢(Scedosporium prolificans)

白色毛孢子菌(Trichosporon beigelii)(阿氏毛孢子菌(T.asahii))

皮炎瓶霉菌(Wangiella dermatitidis)

本公开的主题内容可用于协助鉴定不同尺寸的各种不同因子：

A类疾病/因子的定义

美国公共卫生系统和主要卫生护理提供商必须准备应对各种不同的生物因子，包括在美国罕见的病原体。高优先性因子包括对国家安全造成风险的生物体，这是因为它们

·可以容易地从人传播或传递到人；

·造成高死亡率并且具有造成重要公共卫生影响的潜力；

·可能引起公众恐慌和社会混乱；并且

·需要采取特殊行动进行公共卫生防范

B类疾病/因子的定义

第二高优先性的因子包括具有下列特征的因子

·中等地容易传播；

·造成中度发病率和低的死亡率；并且

·需要特异性增强CDC诊断能力和加强疾病监测。

C类疾病/因子的定义

第三高优先性的因子包括由于下列原因可能在将来被工程化改造用于大规模传播的新兴病原体

·可获得性；

·容易生产和传播；并且

·具有高发病和死亡率和重大健康影响的潜力

一些因子和替代物的物理尺寸

靶：

·苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)内生孢子-约1μm

·炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)内生孢子-约1μm

·鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)-革兰氏阴性菌杆状-卵形，宽度0.5-0.8μm，长度1-3μm

·罗氏耶尔森氏菌(Yersinia rohdei)-约1μm

·委内瑞拉马脑炎-70nm(0.07μm)

·γ射线杀死的MS2-2mD或约25nm(0.025μm)(但是会通过300kD孔眼尺寸，但被100kD孔眼尺寸的Wick和McCubbin持留-ECBC)

·卵清蛋白-45kD或6nm(0.006μm)

·肉毒杆菌类毒素A–150至900kD或10nm至70nm(0.01μm至0.07μm)(通常发表为150kD，但某些出版物描述了释放的类毒素A可以是包含150kD毒素蛋白和与其结合的非毒素蛋白的复合体，因此可以以900kD、500kD和300kD的形式释放)。

·DNA-1000Bp或600kD直至15,000Bp或9mD

在医学领域中的具体应用领域包括但不限于：

1.进行上述类型的取样和分析用于医学研究和诊断学领域：

a.在癌症研究中，其中体液或尿液中非常低浓度的实验药物是分析的靶

b.在过敏诊断中，其中体液中的少量特定抗原是分析的靶

c.在健康影响研究中，所述研究涉及已知由空气动力学直径小于2.5微米的吸入颗粒物(PM 2.5)中的各种不同物质引起的健康影响的确定。这一领域与环境研究(参见下文)交叠。

d.在法医学中，其中体液中低浓度的毒素或毒液是分析的靶

e.在手术室中[表面提取和空气监测，增添]

f.在药物制造中，其中生物气溶胶颗粒物浓度受美国食品和药品监督管理局管控

在环境研究领域中的具体应用领域包括但不限于：

[与上面的提纲类似，进行修改以适合于环境应用]

2.进行上述类型的取样和分析用于环境研究领域：

a.在健康影响研究中，所述研究涉及已知由空气动力学直径小于2.5微米的吸入颗粒物(PM 2.5)中的各种不同物质引起的健康影响的确定。

b.高海拔气溶胶研究，其中少量颗粒物被收集并且必须被浓缩用于研究

c.在洁净室中，其中收集非常低气溶胶浓度的气溶胶粒子，用于旨在控制来源的监测

d.用于在地面上不同高度处收集的粒子群体的分离(概貌研究(profiling study))

本公开的主题内容被开发成一种独特的基于膜滤器的分级和浓缩系统，其能够根据尺寸分离粒子并将那些粒子浓缩在小的(<100μL)样品体积中。开发了一种新方法，其中将膜滤器以孔眼尺寸逐渐减小的顺序堆叠在单一滤筒中，在每个膜滤器之间具有小的间隙空间或者在某些情况下具有实心滤器支承物和进一步减小的间隙空间。将样品流垂直于第一滤器表面导入，并对其连续地推或拉以直接通过滤筒中的每个膜。由于滤筒可以被设计成用于重复使用，并且由于湿的亲水性膜滤器不允许空气在低于起泡点的压力下流过，因此使用新的真空启动方法以允许将空气从间隙空间和其他内部体积移除，以便可以开始样品处理。使用集成到滤筒的一系列通道和相关的阀将每个级连接回到泵，以允许在系统上抽出负压。

在系统上抽出负压后，将样品流如上所述导入。使全部样品流过滤筒，直至空气到达第一膜滤器并且系统锁定。然后将真空启动阀一个接一个启动，以允许将剩余的流体推过其余膜滤器。当全部样品体积已被处理时，随后将滤筒入口和出口阀关闭，并且将每一级上的阻留物阀打开。然后将充二氧化碳的湿泡沫导入到滤筒的一个末端中，其随后沿着滤筒的长度，与每个膜的阻留物表面相切移动。最后，将泡沫从阻留物端口分发到每个膜滤器的独立的样品容器中。然后泡沫分解成液体，留下少量与每个膜滤器级相关联的浓缩物级分。

本申请的主题公开内容描述了液体向液体的分级和浓缩装置、系统和方法，提供了快速高效地分离、然后浓缩生物样品的新手段。与现有方法相比提供了显著优点，包括但不限于：提高的分离效率，提高的浓缩效率，缩短的处理时间，自动化和集成在自动化系统中。与离心、过滤和其他常规方法相似，本发明的技术在分析之前浓缩收集到的样品，但是具有许多其他优点，包括但不限于：1)样品的液体体积被快速减少。与通常花费10至30分钟来浓缩微米尺寸粒子的离心不同，该方法对于10mL初始体积来说可以在5至60秒内完成。与其中初始样品花费数分钟至数小时通过滤器重复循环许多次以便将粒子如蛋白质或酶浓缩到数毫升的体积中的常规中空纤维过滤浓缩不同，样品在单程中直接通过。这产生100至400微升量级的小得多的液体体积，或以死末端方式直接通过，然后被提取在4至400微升范围内的液体或泡沫体积中。与典型的单程平板式过滤不同，样品以液体形式保留用于运输和分析。相对于最初取样的介质来说，目标因子的检测限降低。2)与以前已知的方法相比，最终样品体积大大减小，同时被保持在液体形式下，这允许在诸如利用少量输入样品的多孔板读板器的装置中进行检测。3)体积减小的样品可以更高效地通过微流体操控方法进行储存和运输。4)装置可以被构造成在单程中将粒子分离成不同尺寸的级分，用于某些因子的分析。例如，细胞和孢子可以与病毒和生物毒素分开浓缩。此外，被浓缩的尺寸范围可以是狭窄的或“带通”，以从复杂基质例如环境样品浓缩小尺寸范围级分。5)通过在将取样的粒子移除到用于分析的小体积中之后将清洁的液体重循环回到收集循环，装置可用于降低气溶胶取样器的板载(onboard)流体储存容量。6)与其他技术(包括离心、平板式过滤和其他方法)相比，这种装置远远更加容易改造以适应于自动化系统。装置的通流(flow-through)本质允许直接配置在自动化检测系统中。7)与新的微流体浓缩系统例如介电泳浓缩系统相比，这种装置在本质上明显更稳健。由Sandia开发的介电泳系统具有小直径的内部流动通路，其在处理具有高粒子浓度的流体期间可能造成明显堵塞。可商购的中空纤维滤器，当具有直径高达约0.5μm的最大值的孔眼时，由于孔眼的数量大以及使用优选的表面活性剂泡沫进行切向流清洁，将需要明显更长的时间才会发生堵塞。8)InnovaPrep系统比任何可商购的液体向液体浓缩器小得多。可以对必需的部件进行排布，以便利用待集成的系统中的任何空余空间。9)装置几乎完全由低成本、容易获得的部件制成。这显著降低了集成成本并使其比其他方法的浓缩更加实用。

本公开主题内容的装置的示例性实施方式被示出在图1A-1C中。在这些图中，示出了可用于分级和浓缩流体内的组分的示例性装置100。装置100包括：歧管部分101，其具有用于连接或锁牢装置的歧管安装法兰111；以及合在一起起到装置100的端片作用的夹持板102，并且流体堆叠体108被保持在那些端片内。夹持螺栓103在装置100运行时维持其密封状态。对齐销针104用于维持装置的结构完整性，并提供更容易的方法将所有部件放在一起。流体连接105是将流体导入到装置100内的端口。气动控制管线106调节装置100内的压力。

图1C示出了层压的多级浓缩池装置100的分解视图，其中为清晰起见，除去了螺栓103和对齐销针104。流体堆叠体108包含：多层硬塑料层121，其具有以特定形状和几何尺寸切出的孔和在表面中蚀刻出的流体通路；以及包封滤器部分123的垫圈122。装置100通过将交替的塑料层121和过滤介质123压缩在两个流体组块122之间来构造，所述流体组块允许浓缩池与流体系统的剩余部分相接。这种类型的滤筒可以使用示出的方法来构造，或者可以使用在微流体装置构造中常用的粘合和构造技术来构造。示出了具有5个滤器的示例性滤筒。在这种情况下，5个膜滤器可以由下面示出的滤器类型或与其类似的滤器类型制成：

·滤器1-6μm的蚀刻轨道聚碳酸酯膜滤器，用于移除大的粒子

·滤器2-基于亲和性的滤器，用于移除腐殖质

·滤器3-0.4μm的蚀刻轨道聚碳酸酯膜滤器，用于细菌捕获

·滤器4-0.02μm的嵌段共聚物膜滤器，用于病毒和核酸捕获

·滤器5-10kD嵌段共聚物膜滤器，用于蛋白质捕获

通过这种方式，系统将产生含有下列粒子类型的目标粒子的级分，其中干扰性粒子或腐殖质的数目或浓度减小。

·完整细菌

·病毒和游离核酸

·蛋白质

图7A示出了具有集成的滤器支承物的双级滤器堆叠体的横截面视图。该池通过将数层不同材料层压在一起以产生流体通道来构造。部件是(1)流体通路被蚀刻在其中的有棱纹的塑料基材，(2)起到垫圈作用以在层之间产生不透气体和液体的密封件的软塑料基材，(3)过滤介质，(4)滤器支承棱纹，以及(5)将一个滤器级连接到下一个滤器级以使得第一级滤器的透过物变成第二级滤器的样品的流体通路。

图7B示出了五级滤器堆叠体的横截面视图。该池也通过将材料层层压在一起来构造；过滤介质被排列成使得样品在单一步骤中移动通过所有5个滤器级，从孔眼直径最大的滤器开始并结束于孔眼直径最小的滤器。部件是(6)样品入口端口，(7)将层密封在一起并产生流体通道的软基材或有棱纹的基材，(8)过滤介质，以及(9)透过物端口。(10)示出了样品流动方向。

应该指出，尽管图1A-1C中示出的示例性实施方式包括5层滤器，但任何数目都是可能的，并且制造和使用装置的技术是相似的，并且是本领域普通技术人员在考虑本公开内容时能理解的。

一旦将装置100用对齐销针104正确对齐并用螺栓103紧固后，产生具有大量区室、通道和连接的内部流体体积200。这样的内部流体体积200被示出在图2中。应该指出，该内部流体体积的产生是由于在流体堆叠体108中使用的各个硬塑料层121、垫圈122和滤器123的激光切割的通道。

内部流体体积200显示出用于五级浓缩器的流体堆叠体108组件的各个通路。202、204和206是气动控制管线，并用于控制滤器级1的旁通阀(移除腐植酸)202、滤器级2的旁通阀(预滤器)204和去污染分离阀206。

各种流体管线包括去污染流体出口端口208、滤器级3的阻留物端口(浓缩级1)210、滤器级1的阻留物端口(移除腐植酸)212、滤器级4的阻留物端口(浓缩级2)214、滤器级2的阻留物端口(预滤器)216和滤器级5的阻留物端口(浓缩级3)218。

其他气动控制管线包括滤器级5的旁通阀(浓缩级3)220、滤器级4的旁通阀(浓缩级2)222、滤器级3的旁通阀(浓缩级1)224和主滤器分离阀226。

其他流体管线包括气体冲洗端口228、泡沫注入端口230、样品入口端口232、样品出口端口(透过物)234和去污染流体入口端口236。气动控制管线的一部分是进料/透过物分离阀238。最后，各个滤器级包括滤器级1 250、滤器级2 252、滤器级3 254、滤器级4 256和滤器级5 258。

图2中示出的五级流体堆叠体的所有部件和内部流体通道以下面进一步详细描述的方式一起工作。应该指出，图2中示出的五级流体堆叠体仅仅是示例性的，并且本公开不限于这样的示例性实施方式。例如，双级内部流体体积被示出在图3中，三级内部流体体积被示出在图4中。其他数目也是可能的，并且在本领域普通技术人员的技术范围之内。

为完整起见，双级内部流体体积300的部件包括：

301 微型阀控制的气动控制隔膜(示出了7个)

302 微流体阀(示出了7个)

303 (气动控制管线)滤器级1的旁通阀

304 (流体管线)样品出口(透过物)

305 (流体管线)样品入口(进料)

306 (流体管线)滤器级1的阻留物

307 (流体管线)滤器级2的阻留物

308 (气动控制管线)主滤器分离阀

309 (气动控制管线)滤器级2的旁通阀

310 (流体管线)泡沫注入端口

311 滤器级1

312 滤器级2

为完整起见，三级内部流体体积400的部件包括：

401 级1的泡沫入口

402 级1的泡沫微型阀

403 级2的泡沫入口

404 级2的泡沫微型阀

405 级3的泡沫入口

406 级3的泡沫微型阀

407 滤器级1的旁通阀

408 滤器级2的旁通阀

409 样品入口(进料)

410 级1的阻留物出口

411 级1的阻留物阀

412 级2的阻留物出口

413 级2的阻留物阀

414 级3的阻留物出口

415 级3的阻留物阀

416 滤器级1

417 滤器级2

418 滤器级3

本公开主题内容的示例性系统的过程流程图被示出在图5中。橙色框522、525、542、545、547、551含有最终的6个浓缩级分，它们从红色框501中示出的输入样品回收得到。两个分级/浓缩流体滤筒510和540被用于产生6个级分522、525、542、545、547、551。滤筒A 510将输入样品分离成含有全细胞514、游离核酸522和游离蛋白质525的级分。来自于滤筒A 510的一部分全细胞级分514被裂解，然后使用滤筒B 540将全细胞裂解物543分离成含有细胞碎片545、核酸547和蛋白质551的级分。使用级A.1 511、A.2 513、A.3 515、A.4 521和A.5524来进行滤筒A 510的分离。滤筒B 540装有级B.1 544、B.2 548和B.3 550。在滤筒A 510之前，使用装有聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)介质的新的、可重新补充的介质柱来移除腐殖物质，同时允许目标材料通过。级A.1 511使用大孔膜来移除来自于输入样品的环境碎片和抑制剂530，包括大的颗粒物。级A.2 513是新的、可重新补充的聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)溶胶-凝胶膜，用于移除腐殖物质531，同时允许目标材料通过。级A.3 515被用于捕获完整的活生物体。然后将这个级分的一部分保存用于以后的分析，并将一部分裂解用于快速检测。来自于这一级的透过物流体含有游离的溶液核酸和游离的溶液蛋白质，其随后分别被级A.4 521和A.5 524分离成核酸级分和蛋白质级分。将用于快速检测的完整活细胞的裂解级分分别用级B.1 544、B.2 548和B.3550分离成含有细胞碎片、核酸和蛋白质的三个级分。示出了各个透过物512、514、516、523、549，以指示该过程的剩余物质。透过物废物526和552分别指示了滤筒A 510和滤筒B 540的过程的最终结果。

图6与图5相结合，提供了双滤筒系统600的示例性版本的布局的流动示意图。对于开始进行的讨论来说，图5和6应该联合在一起考虑。在运行期间，将体积为1mL至50mL的样品进料到样品输入储存器中。然后启动处理循环。第一步是使用新的真空启动方法准备用于处理的滤筒601、603。由于膜606在本质上是亲水的并且在第一个样品后对于被处理的每个样品来说是湿的，因此启动要求将空气从系统600抽出，以便可以使液体样品与膜发生接触。应该指出，为清楚起见，在图中仅仅指出了一个膜606，但示出了多个膜。在滤筒601、603内的每个级上抽负压执行了这一行动。启动滤筒601、603内的气动阀，以允许分别通过每个滤筒顶部的三通阀602、604施加真空。当已获得足够的真空时，将阀关闭以便在滤筒内捕获负压。整个真空启动过程预期花费不到20秒来进行。

当真空启动完成时，将样品通过用于移除腐殖质的PVPP柱进行处理，然后通过滤筒A 520、601进行处理。然后流体在单程中流过滤筒A 520、601的所有4个级。由于膜606之间的间隙空间小(小于300μL)，并且由于膜是串联排列的，因此滤筒A 520、601中的总滞留体积小于1.5mL，其中处理速率主要仅受滤筒中最慢的膜的限制。通过腐殖质移除柱和滤筒A 510、601处理10mL样品的总时间为约10分钟。当所有液体样品通过级A.1 511膜时，系统锁定，因为空气不通过湿的亲水性膜。然后使用液流开关来确定系统何时锁定，并将空气压力施加到下一级，以便可以将液体推动通过下一个膜滤器。这一过程持续到所有液体从系统中被抽空。

当整个样品已被处理时，每个级同时进行提取。通过同时进行提取过程，横跨每个膜的压力被平衡，并且由于两侧上的压力是相等的，因此不发生通过膜的流动。这一过程提供了可能的最佳浓缩效率和得到的最小提取体积。提取过程通过打开和关闭经内部滤筒流体通路连接到每个级的单一提取流体阀来进行。将所述阀短时间(15至50msec)打开，以允许提取流体快速分发到每个膜之间的间隙空间中。在分发后，提取流体快速形成湿的粘稠泡沫，其沿着膜的长度移动并分发到每个级的独立的捕获储存器中。

从滤筒A 510释放的浓缩物包括含有用于废弃的环境废物碎片、全细胞、游离核酸和游离蛋白质的级分。来自于滤筒A 510的全细胞浓缩物将被分成储存样品和可用于二次处理的样品。然后将可用于二次处理的样品使用通流式机械细胞裂解系统进行处理。在裂解后进行湿泡沫洗脱冲洗，以确保从裂解系统高度有效和快速地移除裂解的材料。然后将得到的体积为约1mL的裂解材料在滤筒B 540中进行处理。

滤筒B 540的运行基本上与滤筒A 510一致，区别在于它仅仅具有3个膜级。在级1 544中，移除在裂解过程中产生的细胞碎片。级2548将捕获核酸。级3将捕获蛋白质550。

单一滤筒分级/浓缩仪器操作的详细的24步骤的过程图被提供在图8A-8X中。所述图清楚地演示了每一步骤时的行动。在这里将对它们进行概述。

初始状态在图8X中显示为最后步骤，并注明：

·所有阀关闭

·注射器归位

·旋转阀处于位置1(废物)

·池中装填有NaOH储存溶液

·样品已被置于进料储存器中

步骤1被示出在图8A中，并注明：

·提示用户“将废物容器置于阻留物端口下方”并按压“OK”

·旋转阀将CW旋转到位置6(NaOH储存器)

步骤2被示出在图8B中，并注明：

·注射器抽取3mL NaOH

步骤3被示出在图8C中，并注明：

·旋转阀将CCW旋转到位置2(NaOH入口)

·腐殖质级分离阀打开

·注射器将3mL NaOH全部缓慢推过池(～6mL/min)

步骤4被示出在图8D中，并注明：

·注射器完成其冲程

·下面的阀同时改变状态：

ο旁通阀1-5打开

ο分离阀打开

ο腐殖质级分离阀关闭

步骤5被示出在图8E中，并注明：

·气体阀脉冲以迫使NaOH流出阻留物端口

步骤6被示出在图8F中，并注明：

·泡沫阀脉冲数次以清洗池

步骤7被示出在图8G中，并注明：

·气体阀脉冲以推出剩余的泡沫

步骤8被示出在图8H中，并注明：

·提示用户“将样品容器置于阻留物端口下方”并按压“Ok”

·下面的阀同时改变位置：

ο分离阀关闭

ο进料/透过物分离阀打开

ο腐殖质级分离阀打开

·注射器抽取其整个容积

步骤9被示出在图8I中，并注明：

·诊断：池现在应该处于全真空，从现在起直至步骤12，压力不应以显著量增加。如果它超过限值，则用户应该得到提示。

·下面的阀同时改变位置：

ο滤器旁通阀1-5关闭

ο腐殖质级分离阀关闭

ο旋转阀将CCW旋转到位置1(废物)

·注射器排出其整个容积

步骤10被示出在图8J中，并注明：

·旋转阀将CW旋转到位置5(进料储存器)

·注射器吸入进料样品

步骤11被示出在图8K中，并注明：

·进料流体传感器观察到没有流体

·注射器抽取额外的10mL空气

步骤12被示出在图8L中，并注明：

·旋转阀将CCW旋转到位置4(阻断)

·注射器抽取整个容积

步骤13被示出在图8M中，并注明：

·旋转阀将CCW旋转到位置3(池入口)

·注射器开始在压力设定点下驱动进料样品

步骤14被示出在图8N中，并注明：

·入口流体传感器观察到没有流体

·第一级锁定并且注射器必须停止，以防止超过压力设定点

步骤15被示出在图8O中，并注明：

·当每一级锁定时，用于该级的旁通阀打开，以允许空气在滤器周围通过

步骤16被示出在图8P中，并注明：

·在最后的滤器旁通阀已被打开后，压力将快速下降到环境压力

·注射器继续其冲程以排出其整个容积

步骤17被示出在图8Q中，并注明：

·注射器完成其冲程

·所有旁通阀关闭

·进料/透过物分离阀关闭

·分离阀打开

步骤18被示出在图8R中，并注明：

·泡沫阀脉冲以洗脱池

步骤19被示出在图8S中，并注明：

·气体阀脉冲以推出剩余的泡沫

·提示用户“再次洗脱”或“完成运行”

ο如果“再次洗脱”，则重复步骤18和19

ο如果“完成运行”，则继续进行步骤20

·步骤1被示出在图8A中，并注明：

步骤20被示出在图8T中，并注明：

·下面的阀同时改变位置：

ο分离阀关闭

ο滤器旁通阀1-5打开

ο进料/透过物分离阀打开

ο腐殖质级分离阀打开

·在短时间暂停后，注射器抽取其整个容积

步骤21被示出在图8U中，并注明：

·旋转阀将CCW旋转到位置1(废物)

·进料/透过物分离阀关闭

·滤器旁通阀1-5关闭

·注射器排出其整个容积

步骤22被示出在图8V中，并注明：

·旋转阀将CW旋转到位置6(NaOH储存器)

·注射器抽取4mL

步骤23被示出在图8W中，并注明：

·旋转阀将CCW旋转到位置2(NaOH入口)

·注射器将NaOH缓慢推进到池中(～6mL/min)

·3mL流体填充池的内部，同时用另外1mL回冲腐殖质级并送往废物

步骤24被示出在图8X中，并注明：

·腐殖质级分离阀关闭

·旋转阀将CCW旋转到位置1(废物)

·系统重置

泡沫提取过程概述如下。可以使用由提取表面活性剂制成的泡沫，在小体积中进行样品提取。这个程序清洁浓缩器，同时提高提取效率并允许大大减少阻留物体积。可以使用小体积液体产生大体积的泡沫。由于为了保持泡沫，泡沫中存在的气泡的边界必须保持完整，因此在滤器与提取泡沫的界面处气泡的边界必须总是接触。当泡沫切向清扫通过滤器表面时，它将浓缩物清扫通过装置。当泡沫从装置被提取出来并瓦解时，剩余的产物是小体积液体。该体积可以在小于5微升至1毫升的范围内。在最简单的形式下，泡沫可以在独立的容器中制造，然后被注入以将样品从浓缩器清扫到样品收集端口中。然而，使用样品环测量用于制造泡沫的液体的量是优选的，以便产生一致大小的样品。除了通过将空气与表面活性剂溶液混合产生的表面活性剂泡沫之外，泡沫也可以使用充二氧化碳的表面活性剂溶液来产生。在充二氧化碳后，通过将溶液经孔口、烧结玻璃、滤器或毛细管分发对其进行搅动。这里描述的表面活性剂泡沫提取方法也可用于气溶胶取样器和收集器中其他收集表面的提取和清洁。使用泡沫提取这些表面可以提供显著提高的提取效率和显著减小的最终样品体积。在我们的实验中，已显示使用加压二氧化碳制造的泡沫与活的萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)孢子的收集相容。美军Natick研究和开发工程中心报告Natick/TR-94/019也指明，嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstereothermophilus)孢子在缓冲的充二氧化碳溶液中的悬液不受损害，但萌发受到抑制。这种抑制在铺板计数后逆转。也已知道，二氧化碳抑制许多微生物的生长。已在下面这一情形中利用了这一事实：通过使用改良气氛包装(MAP，例如Baker,R.C.等，1986，“含高水平二氧化碳的气氛在2、5和13℃下对腐败和病原细菌生长的影响”(Effectof an elevated level of carbon dioxide containing atmosphere on thegrowth of spoilage and pathogenic bacteria at 2,5,and 13C)，Poult.Sci.65:729-737)来防止食品中的细菌性食物腐败。基于在参考报告中包含的数据，本发明人相信，提取缓冲液在二氧化碳压力下的储存会保护提取流体免于污染物的生长。此外，由于泡沫产生方法由气体从表面活性剂提取流体中的溶解状态产生来驱动，因此在通过滤器期间，当旧的气泡破裂时，新的气泡继续产生。破裂的气泡的能量有助于将粒子从纤维滤器提取到体积缩小的样品中。提取泡沫中的大部分气泡在从提取池释放后很快破裂，产生体积小得多的样品，所述样品在本质上基本是液体。

本申请进一步将本申请人拥有的所有下列申请的全部内容通过参考并入本文，正如在本公开中讨论的，所述申请公开了泡沫洗脱的各种不同技术：13/368,197，12/814,993，12/882,188，12/883,137，13/028,897。这样的技术通过参考并入本申请。

前面关于本公开主题内容的示例性实施方式的公开内容是出于说明和描述的目的而示出的。它不打算是穷举性的或将本公开的主题内容限制到所公开的准确形式。根据上面的公开内容，本文中描述的实施方式的许多改变和修改对于本领域普通技术人员来说是显而易见的。本公开主题内容的范围仅由权利要求书及其等同物定义。

此外，在描述本公开主题内容的代表性实施方式中，说明书可能将本公开主题内容的方法和/或过程表述为一系列特定步骤。然而，在所述方法或过程不依赖于本文中阐述的步骤的特定顺序的意义上，所述方法或过程不应限于所描述的特定步骤顺序。正如本领域普通技术人员将会认识到的，其他步骤顺序可能是可行的。因此，说明书中阐述的步骤的特定顺序不应被解释为对权利要求书的限制。此外，涉及本公开主题内容的方法和/或过程的权利要求项不应限于以所描述的顺序执行它们的步骤，并且本领域技术人员可以容易地认识到，所述顺序可以进行改变，并且仍在本公开主题内容的精神和范围之内。

Claims (17)

1.一种用于从流体样品分级和浓缩粒子的装置，所述装置包含：

含有分级式滤器的滤筒，所述滤器具有多孔表面且按递减的孔眼尺寸排列，用于从流体样品捕获粒子；以及

与所述滤筒流体连通的渗透压力源；

其中将所述粒子从所述多孔表面洗脱并分发到减小的流体体积中。

2.权利要求1的装置，其还包含用于连接到浓缩单元的连接部分。

3.权利要求1的装置，其中所述滤器被小的间隙空间隔开。

4.权利要求1的装置，其中所述膜滤器被滤器支承物隔开，所述滤器支承物具有将一个滤器的透过物与相邻的较小孔眼滤器的阻留物相连的流动通路。

5.权利要求1的装置，其中将样品垂直于每个滤器的表面导入到所述装置中。

6.权利要求1的装置，其中带阀门的流体连接器连接滤器之间的间隙空间或流动通路。

7.权利要求1的装置，其中将气动阀、液压阀或机械阀集成在滤筒装置中。

8.权利要求1的装置，其中所述滤器是平板式膜滤器、平板式陶瓷滤器、基于亲和性的滤器、平板式深度滤器、带静电荷的滤器或微筛中的一种或多种。

9.权利要求1的装置，其还包含包括流动控制孔的洗脱缓冲液分配歧管。

10.权利要求1的装置，其中与每个滤器的表面相切进行洗脱。

11.一种用于从流体样品分级和浓缩粒子的系统，所述系统包含：

容纳流体样品的储存器；

包括两个或更多个分级式滤器的分级和浓缩滤筒；

与所述滤筒流体连通的渗透压力装置；

浓缩单元，其包括驱动集成阀，以将样品移动通过所述滤筒；以及

流体分发器源，用于从滤筒分级式滤器收集浓缩的样品；

其中将所述流体样品移动通过所述浓缩单元，然后将所述浓缩的样品从所述滤器洗脱并分发。

12.权利要求11的系统，其中流动传感器与流入到所述滤筒中的样品流体连通。

13.权利要求11的系统，其中流动传感器与流出所述滤筒的透过物流体连通。

14.一种用于从流体样品快速分级和浓缩粒子的方法，所述方法包括：

将样品导入到样品储存器中；

启动分级和浓缩循环；

将所述流体样品通过一系列滤器；

从每个滤器级洗脱粒径逐渐减小的大量粒子；以及

从每个滤器级提取浓缩的样品。

15.权利要求14的方法，其中所述洗脱还包括用洗脱流体切向冲洗滤筒内的多孔表面。

16.权利要求15的方法，其中所述洗脱流体是液态洗脱流体和湿泡沫中的一种或多种。

17.权利要求14的方法，其中使用高频反向脉冲和振荡切向流中的一种或多种防止所述滤器的堵塞。