CN104878083B - 检测folfox化疗药物对于结直肠癌有效性的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于检测FOLFOX化疗药物对于结直肠癌有效性的试剂盒，包括一对检测MAP4K1基因拷贝数的扩增引物序列，一对检测CDKL4基因拷贝数的扩增引物序列以及一对检测内参基因GAPDH基因拷贝数的引物序列。通过本发明设计的试剂盒，可以快捷有效的对FOLFOX化疗药物对于结直肠癌有效性进行检测，评价该待检患者是否适合应用奥沙利铂作为一线化疗药物，为临床用药提供了有效的参考。
Description
[技术领域]
本发明涉及用于检测FOLFOX化疗药物对于结直肠癌有效性的试剂盒。
[背景技术]
结直肠癌(CRC)是世界第三大常见的恶性肿瘤，也是由癌症引起死亡的第二大原因，严重威胁人类健康(Jemal A,Bray F,Center MM,Ferlay J,Ward E,Forman D.Globalcancer statistics.CA:a cancer journal for clinicians.2011；61(2):69-90.)。近几十年来，结直肠癌的临床结果已有显著改善，不仅是由于外科技术的进步，还要归因于引入化疗和靶向药物疗法(Moertel CG,Fleming TR,Macdonald JS,et al.Levamisole andfluorouracil for adjuvant therapy of resected colon carcinoma.The New Englandjournal of medicine.1990；322(6):352-358；Andre T,Boni C,Navarro M,etal.Improved overall survival with oxaliplatin,fluorouracil,and leucovorin asadjuvant treatment in stage II or III colon cancer in the MOSAICtrial.Journal of clinical oncology:official journal of the American Societyof Clinical Oncology.2009；27(19):3109-3116；Hurwitz HI,Fehrenbacher L,Hainsworth JD,et al.Bevacizumab in combination with fluorouracil andleucovorin:an active regimen for first-line metastatic colorectalcancer.Journal of clinical oncology:official journal of the American Societyof Clinical Oncology.2005；23(15):3502-3508；Van Cutsem E,Kohne CH,Lang I,etal.Cetuximab plus irinotecan,fluorouracil,and leucovorin as first-linetreatment for metastatic colorectal cancer:updated analysis of overallsurvival according to tumor KRAS and BRAF mutation status.Journal of clinicaloncology:official journal of the American Society of Clinical Oncology.2011；29(15):2011-2019.)。依据美国国家综合癌症网络指南(NCNN)，建议Ⅲ期结直肠癌患者在经根治性切除术后进行辅助性化疗。MOSAIC和NSABP C-07临床试验结果证明采用奥沙利铂作为一线辅助化疗的方案得到认可(Andre T,Boni C,Navarro M,et al.Improvedoverall survival with oxaliplatin,fluorouracil,and leucovorin as adjuvanttreatment in stage II or III colon cancer in the MOSAIC trial.Journal ofclinical oncology:official journal of the American Society of ClinicalOncology.2009；27(19):3109-3116；Kuebler JP,Wieand HS,O'Connell MJ,etal.Oxaliplatin combined with weekly bolus fluorouracil and leucovorin assurgical adjuvant chemotherapy for stage II and III colon cancer:results fromNSABP C-07.Journal of clinical oncology:official journal of the AmericanSociety of Clinical Oncology.2007；25(16):2198-2204.)。然而，在Ⅲ期结直肠癌患者接受含有奥沙利铂的辅助性化疗法后的三年无病生存率依旧仅有65％(Uncu D,Aksoy S,Cetin B,et al.Results of adjuvant FOLFOX regimens in stage III colorectalcancer patients:retrospective analysis of 667patients.Oncology.2013；84(4):240-245)。一个有效的治疗策略就是区分奥沙利铂辅助性化疗法中可能获益较多或获益较少的患者群体，对CRC患者进行个性化药物治疗，但目前仍缺少预测以奥沙利铂为基础的化疗药物的疗效标志物。为此，临床研究急需能够简便准确地进行预后及疗效预测的方法，为结直肠癌患者术后用药提供重要参考。
丝裂原激活蛋白激酶MAP4K1，系丝/苏氨酸激酶亚家族STE20中的一员，属于丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号传导通路的一个上游激活因子，MAPK是一组可以被多种细胞外信号(包括生长因子，激素，紫外线福射，DNA损伤剂，炎性细胞因子和环境应激等)激活的丝/苏氨酸激酶。MAPK信号转导通路在生物进化过程中高度保守，外界环境改变刺激细胞膜受体发生磷酸化，进而刺激MAPK激酶MAPKKK活化，继而活化下游MAPK激酶MAPKK，然后活化MAPK,活化的MAPK可以转到核内作用靶点，促进基因的转录。这种激活模式参与细胞的多种生物学行为，包括细胞凋亡(Kyosseva SV.Mitogen-Activated Protein KinaseSignaling.In:S.John,editor^,editors".International Review of Neurobiology，City；Academic Press；2004，p.201-20；Willaime-Morawek S，et al.C-jun N-terminalkinases/c-Jun and p38pathways cooperate in ceramide-induced neuronalapoptosis.Neuroscience 2003；119:387-97.)、分化和增殖(Aouadi M,etal.p38Mitogen-Activated Protein Kinase Activity Commits Embryonic Stem Cellsto Either Neurogenesis or Cardiomyogenesis.STEM CELLS 2006；24:1399-406；AouadiM,et al.Inhibition of p38MAPK Increases Adipogenesis From Embryonic to AdultStages.Diabetes 2006；55:281-9；Roux PP and Blenis J.ERX and p38MAPK-ActivatedProtein Kinases:a Family of Protein Kinases with Diverse BiologicalFunctions.Microbiology and Molecular Biology Reviews2004；68:320-44.)、细胞周期调控、细胞生存的维持以及细胞恶性转化等。
细胞周期蛋白依赖性蛋白样激酶4(Cyclin dependent kinase like 4，CDKL4)是CDC2相关
丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族中的一员，属于细胞周期依赖性蛋白激酶(CDK)超家族，CDKL超家族蛋白主要包括CDKL1-5五个蛋白家族，这类蛋白在调控细胞周期、细胞增殖和凋亡、信号转到、性别分化、神经发育等生物学过程中发挥着重要的作用(Lee DE,LeeKW,Jung SK,et al.6,7,4'-trihydroxyisoflavone inhibits HCT-116human coloncancer cell proliferation by targeting CDK1and CDK2.Carcinogenesis.2011；32(4):629-635.)。该家族的基因缺失或突变会导致相应的疾病的发生,如CDKL1和CDKL4基因不能够正常表达就会使细胞对外界的信号无法感知或信号转导缓慢。在结肠癌细胞中，CDK抑制剂能够抑制细胞增殖和阻滞细胞周期并诱导细胞凋亡。
本发明在142份结直肠癌患者肿瘤组织中发现MAP4K1、CDKL4基因的拷贝数变化与结直肠癌患者手术后采用奥沙利铂作为一线化疗药物的疗效密切相关。因此，本发明采用MAP4K1、CDKL4基因为结直肠癌的标记物，总结得出一种疗效评估的方法，从而有效地为结直肠癌患者术后用药提供重要参考。进一步的，本发明采用荧光定量PCR技术，采用自行设计并优化的内参和目的引物，整合了实时荧光定量PCR试剂，制成检测试剂盒，方便临床检测使用。
[发明内容]
本发明的目的在于提供一种能够用于检测FOLFOX化疗药物对于结直肠癌有效性的试剂盒。
该试剂盒包括一对检测MAP4K1基因拷贝数的扩增引物序列，一对检测CDKL4基因拷贝数的扩增引物序列以及一对检测内参基因GAPDH基因拷贝数的引物序列。
在研究过程中发现，MAP4K1基因、CDK4基因拷贝数增加相对应的是患者死亡风险明显提高。实验过程可参见具体实施例。通过本发明设计的试剂盒，可以快捷有效的对FOLFOX化疗药物对于结直肠癌有效性进行检测，评价该待检患者是否适合应用奥沙利铂作为一线化疗药物，为临床用药提供了有效的参考。
进一步的，该试剂盒还具有如下优化方案：
所述的检测MAP4K1基因拷贝数的扩增引物序列的正向序列如SEQ ID NO:1所示，反向序列如SEQ ID NO:2所示。
所述的检测CDKL4基因拷贝数的扩增引物序列的正向序列如SEQ ID NO:3所示，反向序列如SEQ ID NO:4所示。
所述的检测内参基因GAPDH基因拷贝数的扩增引物序列的正向序列如SEQ ID NO:5所示，反向序列如SEQ ID NO:6所示。
还包括2×SYBR Green qPCR Mix以及超纯水组成的实时荧光定量PCR扩增体系。
所述的实时荧光定量PCR扩增体系，每20μL反应体系终浓度为：检测MAP4K1基因拷贝数的扩增引物序列，一对检测CDKL4基因拷贝数的扩增引物序列以及一对检测内参基因GAPDH基因拷贝数的引物序列的正向引物浓度均为2uM，反向引物浓度均为2uM，2×SYBRGreen qPCR Mix的浓度为10μL，其余为超纯水。
[附图说明]
图1 MAP4K1、CDKL4基因风险评分分组进行Kaplan–Meier曲线
[具体实施方式]
试剂盒包含：2×SYBR Green qPCR Mix、超纯水和两对qPCR检测引物(见表1)组成的实时荧光定量PCR扩增体系。
表1 三对qPCR检测引物
所述的实时荧光定量PCR扩增体系，每20μL反应体系终浓度为：正反向引物各4uM，2×SYBR Green qPCR Mix 10μL，超纯水补足至20uL。
所述的mM和μM是摩尔浓度的单位，指的是每升溶液中所含溶质的摩尔数。
本发明检测MAP4K1、CDKL4基因拷贝数的变化预测直肠癌化疗疗效的方法，主要包括以下步骤：
(1)收集结直肠癌患者的手术切除癌组织标本并石蜡包埋处理，跟踪随访患者生存时间；
(2)组织切片并提取组织的DNA样本：用Qiagen公司的DNA石蜡抽提试剂盒(DNAFFPE kit，Qiagen,German)抽提DNA；
(3)DNA质量控制：用Thermo Scientific Varioskan Flash酶标仪检测抽提的DNA的质量；
(4)定量PCR检测：用Bio-rad公司生产的iQ5定量PCR仪检测DNA样本中的基因拷贝数；
(5)计算所有样本中MAP4K1、CDKL4基因相对于内参基因GAPDH的拷贝数变化值；
(6)利用卡方检验评价病人临床特征的差异，学生t检验评价连续变量的差异，初步判断能否作为区分患者生存周期的指标；
(7)将收集的样本分为训练样本集、验证样本集、总样本集分别进行多变量Cox比例风险生存分析，分析调整了年龄、性别、临床阶段和组织分期对结果的影响。得出对应基因的危险比率(HRs)及其95％置信区间(CI)。
(8)利用Kaplan–Meier生存曲线评估MAP4K1、CDKL4基因拷贝数与总生存期之间的关系，利用log-rank检验统计的显著性。
(9)采用受试者工作曲线(ROC)下面积(AUC)评估患者生存的特异性及敏感性。P值采用双边检验,P<0.05认为具有统计显著性。
具体实施案例
以下实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照制造试剂盒生产公司所建议的条件或按照常规实验条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件。
1、实验对象
本实施例的研究对象选择于2006年6月至2011年12月期间收集的142例经组织学鉴定为结直肠癌的患者。其中76例收集于上海交通大学附属瑞金医院的病人作为统计模型训练集，另外66例收集于上海同济大学附属第十人民医院的病人作为验证集对模型进行验证。
纳入及排除标准：
所有病例均初次诊断为大肠癌并且之前没有接受过放疗和化疗。
为了最大程度的减少样本间差异，我们只研究经根治性切除手术的III期大肠癌患者，并且均以奥沙利铂作为一线辅助化疗药物使用至少6个周期，所有患者均按照美国癌症联合委员会肿瘤节点转移分期系统(TNM)进行分期。
无其他器官肿瘤病史；无以下家族史：1～2级亲属中无结直肠肿瘤史，无腺瘤性息肉病史和家族遗传性综合征史，主要包括家族性腺瘤性息肉病(FAP)、遗传性非息肉性结直肠癌(HNPCC)等；
我们回顾了病人的医疗记录并收集临床诊断信息，包括诊断日期、临床阶段、肿瘤位置、组织学分期、病理分期和治疗信息。病人复发、死亡信息通过医疗记录和电话随访获取，随访至2014年1月。
2、实验方法
(1)采用上述142例结直肠癌患者经手术切除的肿瘤组织标本，每个石蜡包埋的样本切50-100张切片，苏木精伊红(HE)染色后经由3名病理科医师阅片。手工刮取三名病理医师一致认为的肿瘤细胞面积超过切片面积70％的切片。肿瘤组织切片浸入二甲苯中脱蜡，用Qiagen公司的QIAamp-DNA-FFPE-Tissue Kit，按照试剂盒的说明，抽提组织中的DNA样本。抽提后的DNA样本保存在-20℃的低温冰箱中。
(2)用Thermo Scientific Varioskan Flash酶标仪检测抽提的DNA的浓度及质量。
(3)用Bio-rad公司生产的iQ5定量PCR仪检测142份DNA样本中的MAP4K1、CDKL4基因和内参GAPDH基因的拷贝数。每个样本吸取20ng基因组DNA，利用SYBR Green试剂盒(Qiagen,German)进行定量PCR，所用引物见表1。PCR程序为：95℃变性15s，58℃引物退火20s，72℃延伸20s。
3、结果分析
考虑到许多因素能可能引起基因表达的变化，同时评估这些因素十分困难，因此其不能简便准确地反映肿瘤的疗效评价。而基因拷贝数的变化与肿瘤密切相关，有可能作为肿瘤诊断及疗效判定的靶标。本发明通过检测与结直肠癌相关的重要基因MAP4K1、CDKL4基因拷贝数变化，将其拷贝数变化作为评价结直肠癌疗效的相对指标，提供用药参考。
(1)每个样本设置三个复孔，复孔Ct值差异若超过一个循环，将被剔除出实验分析。拷贝数分析过程如下(Livak K,Schmittgen TD.Analysis of relative geneexpression data using real-time quantitative CR and the 2(-DeltaDelta C(T))method.Methods 2001；25:402–8.)：1、计算每个样本目的基因三重复Ct值的平均值，同时计算对应内参基因三重复的平均值；2、算出所有样本目的基因及内参基因的平均值；3、用每个样本的目的基因平均Ct值减去所有样本目的基因的平均Ct值，即为目的基因△Ct，内参△Ct同样算法处理；4、计算每个基因的2-ΔCt(目标基因)，也计算内参基因的2-ΔCt(内参基因)；5、目的基因2-ΔΔCt＝2-ΔCt(目标基因)/-ΔCt(内参基因)。142例样本中MAP4K1、CDKL4基因拷贝数见表2。
(2)表2中按样本分析分组列出了142名III期结直肠癌患者的临床特征，训练集的76名患者年龄中值为60岁(范围在24-79岁)，随访时间的中值为57个月。随访期间28名患者死亡(36.8％)，没有达到无复发生存的中值。验证集的66名患者年龄中值为63岁(范围在30-84岁)，随访时间的中值为39个月。随访期间，15名患者死亡(22.7％)。训练集与验证集中患者年龄、性别、临床阶段之间在统计学上没有显著性差异，生存统计之间有显著性差异，经调整后进行后续分析。
表2.两个来源的Ⅲ期结直肠癌患者临床特征
(3)目标基因拷贝数与临床结果之间的关系：我们采用经年龄、性别、肿瘤位置及组织学分期调整后的多变量Cox模型评估了MAP4K1、CDKL4基因拷贝数与患者无复发生存之间的联系。训练集样本中，MAP4K1基因(HR＝1.11；95％CI,1.03-1.19；P＝0.01)、CDKL4基因(HR＝1.14；95％CI,1.00-1.29；P＝0.05)拷贝数增加的患者死亡风险明显提高。在验证集及总样本集中均验证出MAP4K1基因与患者死亡风险之间有密切联系。验证集中患者MAP4K1基因(HR＝1.20；95％CI,1.04-1.38；P＝0.01)、总样本集中患者MAP4K1基因(HR＝1.11，95％CI,1.05-1.18；P＝0.0005)拷贝数增加的患者死亡风险明显提高。验证集中患者CDKL4基因(HR＝1.53；95％CI,1.06-2.19,P＝0.02)及总样本集中患者CDKL4基因(HR＝1.15；95％CI,1.03-1.28,P＝0.01)拷贝数增加的患者死亡风险也明显提高。
(4)为了进一步评价MAP4K1、CDKL4基因对患者的生存风险预测价值，我们进行了风险评分分析。结合MAP4K1基因，利用风险评分阈值(0.45)将142名患者分为高风险组和低风险组。按照MAP4K1基因和CDKL4基因的风险评分选择最佳的截值点(表3)时，高风险组患者死亡风险比率为低风险组患者的2.70倍(95％CI 1.37–5.33)。
表3 MAP4K1和CDKL4基因风险评分对患者总生存周期预测能力
(5)利用Kaplan–Meier生存曲线评估基因拷贝数与生存周期的关系，利用log-rank检验统计的显著性，见图1。低风险组比高风险组有较好的预后，患者经奥沙利铂化疗后达到相同生存时间时，低风险组的生存概率明显高于高风险组。log-rank检验P值为0.04，说明模型中两分组间有显著性差异。
(6)利用ROC回归模型评估新指标预测患者预后的能力：根据文献报道，患者年龄、性别、肿瘤分期和组织学分级等临床参数可能会影响大肠癌患者的预后，因此，我们将患者的临床参数与新发现的预测指标一起构建预测模型。为了显示加入新发现的预测指标能提高模型的预测能力，我们分别构建了两个逻辑回归模型的曲线下面积(AUC)，只用临床参数构建患者死亡模型(1)的AUC为0.73；临床参数、MAP4K1与CDKL4基因风险评分结合构建患者死亡模型(2)的AUC为0.76。表明增加新预测指标构建的患者死亡模型的预测能力明显提高(表4)。
表4 两个逻辑回归预测模型曲线下面积
4、在疗效判断中的应用
采集待检结直肠癌患者的手术切除癌组织标本，按照前述方法，抽提DNA样本，并检测MAP4K1、CDKL4基因在该患者肿瘤组织DNA样本中的拷贝数，然后，评价该待检患者是否适合应用奥沙利铂作为一线化疗药物，为临床用药提供参考。
5、检测试剂盒
本发明试剂盒由以下试剂组成(见表5)，来源如下，本发明试剂盒供100人份检测应用，-20℃保存：
表5 试剂盒组成
| 组分 | 体积(mL) | 来源 |
| 2×SYBR Green qPCR Mix | 1 | 东盛生物 |
| 超纯水 | 1 | 东盛生物 |
| 正向引物3个(每个2uM) | 0.2 | 自制 |
| 反向引物3个(每个2uM) | 0.2 | 自制 |
Claims (4)
1.一种用于检测FOLFOX化疗药物对于结直肠癌有效性的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括一对检测MAP4K1基因拷贝数的扩增引物序列和一对检测CDKL4基因拷贝数的扩增引物序列以及一对检测内参基因GAPDH基因拷贝数的引物序列，
所述的检测MAP4K1基因拷贝数的扩增引物序列的正向序列如SEQ ID NO:1所示，反向序列如SEQ ID NO:2所示，
所述的检测CDKL4基因拷贝数的扩增引物序列的正向序列如SEQ ID NO:3所示，反向序列如SEQ ID NO:4所示。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的检测内参基因GAPDH基因拷贝数的扩增引物序列的正向序列如SEQ ID NO:5所示，反向序列如SEQ ID NO:6所示。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于还包括2×SYBR Green qPCR Mix以及超纯水组成的实时荧光定量PCR扩增体系。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述的实时荧光定量PCR扩增体系，每20μL反应体系为：检测MAP4K1基因拷贝数的扩增引物序列，一对检测CDKL4基因拷贝数的扩增引物序列以及一对检测内参基因GAPDH基因拷贝数的引物序列的正向引物浓度均为2uM，反向引物浓度均为2uM，2×SYBR Green qPCR Mix 10μL，其余为超纯水。
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