CN104870635A

CN104870635A - 具有增加比例的e1b蛋白质的156r剪接同工型的溶瘤腺病毒

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Publication number: CN104870635A
Application number: CN201380062906.XA
Authority: CN
Inventors: 汉斯·丹尼尔·奥伯格
Original assignee: Ai Kesegen Co Ltd
Current assignee: Ai Kesegen Co Ltd
Priority date: 2012-11-30
Filing date: 2013-11-29
Publication date: 2015-08-26
Anticipated expiration: 2033-11-29
Also published as: GB2509388B; JP2015536666A; WO2014083362A1; GB201321144D0; US20150315547A1; EP2925865B1; US10047347B2; BR112015012410A2; CN104870635B; AU2013350929A1; BR112015012410B1; US20180371425A1; AU2013350929A2; US10738283B2; ES2731528T3; EP2925865A1; GB2509388A; CA2930967A1; JP6388593B2; CA2930967C

Abstract

本发明涉及在癌细胞中具有溶瘤作用的重组腺病毒。通过调节由E1B基因表达的E1B基因产物的剪接同工型的水平和类型，可增强此类病毒的溶瘤活性。本发明提供重组腺病毒，其中E1B-156R同工型的比例相对于野生型水平有所增加。此类重组腺病毒可以在癌细胞中选择性复制，从而杀死癌细胞同时避免杀死正常细胞。

Description

具有增加比例的E1B蛋白质的156R剪接同工型的溶瘤腺病毒

技术领域

本发明涉及溶瘤腺病毒及其在治疗肿瘤性疾病中的用途。更特别地，本发明涉及E1B基因的突变，所述突变调节该基因的剪接同工型的水平，从而改善溶瘤腺病毒的治疗指数。

发明背景

溶瘤病毒

溶瘤病毒疗法为用于癌症治疗的新兴的治疗平台。溶瘤病毒为在具有特异性致癌表型的癌细胞中选择性复制，从而杀死癌细胞同时避免杀死正常细胞的病毒。初步研究集中于天然存在的非致病性病毒，然而，这些研究成果有限。虽然观察到肿瘤生长减缓并且正常组织未受损，但病程未发生改变。

因此，最近的研究已经集中于选择性地靶向癌细胞的工程重组病毒。该类工程病毒的一个实例为在病毒基因组的E1B区突变的腺病毒。

腺病毒的E1B和p53

哺乳动物肿瘤抑制蛋白p53的一种功能为介导响应于DNA损伤或外源DNA合成的细胞周期停滞和/或细胞凋亡。因此，一些病毒，诸如腺病毒，编码在受感染细胞中使p53失活的蛋白质以允许高效的病毒复制。这些蛋白质中的一种蛋白质，来自腺病毒的E1B区的55千道尔顿蛋白质(E1B-55K或E1B-496R)，结合于p53，因此引起p53的大量丧失。这从而防止p53-介导的受感染细胞的细胞凋亡。因此，E1B-496R对于在含有功能性p53的细胞中的腺病毒的复制而言是必需的。

人肿瘤细胞对于突变的(如置换、删除、移码突变)p53等位基因经常为纯合或杂合的，并缺乏对于正常控制细胞周期必需的p53功能(Hollstein等人(1991)Science 253:49；Levine等人(1991)Nature；351(6326):453-6)。因此，许多瘤细胞为p53^(-)，因为它们缺乏足够水平的p53和/或因为它们表达突变形式的p53，所述突变形式不能够发挥基本的p53功能。

E1B突变的腺病毒

利用瘤细胞与正常细胞之间的p53功能性差异已经对溶瘤腺病毒进行工程改造。通过使E1B-496R蛋白质突变以除去与p53的结合相互作用或通过在E1B基因座内做出各种删除(参见，例如US5,677,178)，所得腺病毒可复制并最终裂解基本上缺乏p53功能的癌细胞，但在具有正常p53功能的细胞中并不发生裂解。

一个实例为ONYX-015(最初命名为dl1520并且也称为H101)，一种不表达E1B-496R蛋白质的突变腺病毒(Heise等人(1997)Nat.Med.3(6):639-645)。病毒在翻译起始密码子之后立即含有终止密码子并且也具有大量缺失的E1B-496R编码序列。结果该病毒缺乏结合p53并使p53失活的能力，因此仅可在p53功能缺陷的细胞(诸如瘤细胞和肿瘤)中高效地复制。不幸的是，E1B-496R发挥除了结合p53并使p53失活以外的其它功能(Eager等人(2001)Cancer Gene Ther.18(5):305-317)。因此，ONYX-015病毒在病毒晚期mRNA的细胞质积聚、宿主细胞关闭以及晚期mRNA的翻译中存在缺陷。因此，ONYX-015中的突变降低突变病毒在肿瘤细胞中自身繁殖的能力。另外的问题为大量缺失使病毒基因组不稳定。

另外的实例为ONYX-051和ONYX-053，它们为在E1B-496R蛋白质中含有点突变(分别为R240A和H260A)而防止结合于p53的突变腺病毒。这些突变使病毒能够在p53功能有缺陷的细胞中选择性复制，而不会降低病毒在这些细胞中复制的能力(Shen等人(2001)J.Virol.75(9):4297-4307和US 7,785,887)。

然而，仍迫切需要改进的突变病毒，其溶瘤能力已经得到增强并且可用于癌症的治疗。

发明的公开内容

本发明人已经发现通过调节E1B基因表达的E1B基因产物的剪接同工型的水平和类型，此类病毒的溶瘤活性可得到增强。因此，本发明的第一方面提供了重组腺病毒，在所述重组腺病毒中E1B-156R同工型的比例相对于野生型水平有所增加，其中腺病毒在癌细胞中具有溶瘤作用。重组腺病毒可以携带突变，如此E1B-156R同工型的比例相对于野生型水平有所增加，使得腺病毒在癌细胞中具有溶瘤作用。突变可以在腺病毒的E1B基因的序列中。因此，根据本发明的病毒在非瘤细胞中为复制受抑制的，但能够在瘤细胞(包括基本上缺乏功能性p53的瘤细胞)中表达复制表型。

在本文描述的腺病毒的特异性实例中，E1B-156R的过表达被认为是由在腺病毒的E1B基因中突变的93R剪接位点引起的失衡。156R能够补足某些496R功能，但并非对肿瘤选择性(oncoselectivity)必需的功能。与现有技术相似类型的病毒相比，根据本发明的病毒包括较好的体内功效的功能性E3B区。例如，Onyx-015缺乏E3B。事实上，Onyx-015病毒及其选择性在所有方面远不如根据本发明的病毒。此外，发明人已经在正常细胞中测试根据本发明制备的病毒，结果显示病毒具有显著的安全概况，特别是与已知的病毒Onyx-015相比较。

本文中，术语“复制受抑制的病毒”或“复制缺陷的”是指在转化成癌症状态或瘤状态的预定的细胞群中优先地抑制细胞增殖或诱导细胞凋亡的病毒。此类病毒在特征为非复制的、非转化的细胞的包含正常的p53功能水平的细胞中基本上不能抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡或表达复制表型。此类转化细胞可以基本上缺乏p53功能，所述缺乏支持病毒复制表型的表达。然而，根据本发明的病毒对瘤组织的选择性可能比仅为p53状态更广泛；像这样的转化状态可能为选择的基础。例如，已经表明用ONYX-015病毒观察到的溶瘤选择性可能是由于一些癌细胞系支持晚期病毒RNA从细胞核输出的能力(在正常细胞中ONYX-015由于E1B-496R缺失而丧失的功能)。相似的机制可以在本发明的重组腺病毒中操作，所述重组腺病毒具有降低水平的E1B-496R蛋白质。本发明的重组腺病毒中E1B-156R水平的增加如何导致溶瘤选择性还未完全清楚。

通常，根据本发明的复制受抑制的病毒在包含正常的p53功能的细胞上的噬斑效率显示出显著减少(针对合适的测定，参见Wang,Y.,G.Hallden等人(2003)."E3gene manipulations affect oncolytic adenovirusactivity in immunocompetent tumor models."Nature biotechnology 21(11):1328-1335)。可以使用的合适测定的另一实例为使用例如四唑鎓染料诸如MTT、XTT、MTS或WST进行细胞毒性测定以测量活细胞的丧失(参见Berridge等人,Biotechnology Annual Review,11:127-152(2005)。

如本文所用，术语“复制表型”是指被病毒诸如复制受抑制的腺病毒感染的细胞的以下表型特征中的一种或多种：(1)晚期基因产物，诸如衣壳蛋白(如，腺病毒的五邻体基质多肽)或由病毒晚期基因启动子起始的RNA转录物的显著表达；(2)病毒基因组的复制或复制中间体的形成；(3)病毒衣壳或包装的病毒体颗粒的装配；(4)在受感染细胞中细胞病变效应(CPE)的出现；(5)病毒裂解周期的完成；以及(6)其它表型改变，在感染有编码功能性癌蛋白的野生型复制-感受态DNA病毒的非瘤细胞中p53功能丧失后，所述表型改变通常为偶然的。根据本发明的复制表型包括至少一种上文列出的表型特征，优选多于一种表型特征，诸如2、3、4、5、6或更多种特征。

测量这些表型的技术对本领域技术人员将为已知的。例如，评价CPE出现的方法在本文的实施例中进行了描述并使用50％的组织培养感染剂量(TCID₅₀)以及噬斑形成单位(pfu)/细胞的数目(在感染日的细胞计数)进行评估。

术语“瘤细胞”是指显示出相对自发性生长，使得它们显示出特征为细胞增殖显著失控的异常生长表型的细胞。瘤细胞包括可以活性复制或处于暂时非复制休止态(G1或G0)的细胞；相似地，瘤细胞可以包括具有分化良好表型的细胞、低分化表型的细胞或两种类型的细胞的混合物。因此，并非所有瘤细胞在给定的时间点处必定复制细胞。于此定义为瘤细胞的细胞组由在良性肿瘤中的细胞以及在恶性(或浸润性(frank))肿瘤中的细胞组成。浸润性瘤细胞经常被称为癌症，如果源于内胚层的或外胚层的组织学起源的细胞，则通常为癌，或如果源于衍生自中胚层的细胞类型，则通常为肉瘤。术语瘤细胞和癌细胞在本文中可互换地使用。

于此，术语“p53功能”是指具有基本上正常水平的由p53基因编码的多肽的性质(即，相对于相同组织学类型的非瘤细胞)，其中p53多肽能够结合于野生型腺病毒E1B-496R多肽。例如，通过产生p53的无活性(即，突变)形式或通过显著降低或全部丧失p53多肽的表达，p53功能可丧失。p53功能也可以在包含编码野生型多肽的p53等位基因的瘤细胞中基本上不存在；例如，p53基因座外的遗传改变，诸如导致p53的异常的亚细胞处理或定位的突变(如，导致p53主要定位在细胞质而非细胞核的突变)可导致p53功能的丧失。因此，许多瘤细胞为p53^(-)，因为它们缺乏足够水平的p53和/或因为它们表达不能发挥显著的p53功能的突变形式的p53。在本发明的上下文中，p53的主要功能为能够介导响应于DNA损伤或外源DNA合成的细胞周期停滞和/或细胞凋亡。如果p53功能的所述降低防止细胞周期和细胞凋亡的正常控制，则瘤细胞缺乏功能性p53。与相应的相同类型的非瘤细胞相比，这可组成降低2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更多倍恰当处理、定位和表达的p53，所述p53可结合于E1B-496R。这些细胞因此被称为“p53^(-)”。

据信缺乏使p53复合化但基本上保留其它基本的病毒复制功能的能力的复制缺陷的腺病毒物种将在缺乏p53功能的细胞中显示出复制表型(如，对于基本上缺失p53等位基因为纯合的细胞，或包含基本上无功能的突变的p53蛋白质的细胞)，但在非复制的、非瘤细胞中基本上不会显示出复制表型。为了方便，此类复制受抑制的腺病毒物种在本文中被称为E1B-p53^(-)复制缺陷的腺病毒。

“溶瘤病毒”为优先地感染并裂解癌细胞的病毒。当比较在癌细胞与在正常细胞中的功效时，看到溶瘤作用。如果裂解的癌细胞与非癌细胞的比率为2:1、4:1、10:1、20:1、50:1、100:1或更高时，则病毒被认为是溶瘤的。优选地，通过评价溶瘤指数(见下文)，病毒被鉴定为溶瘤的。于此，溶瘤作用包括a)细胞的病毒感染；b)病毒基因组在(p53功能缺陷的)癌细胞中选择性复制，从而导致优先的病毒-介导的癌细胞(其可以为p53缺陷的)的细胞裂解并释放病毒颗粒用于进一步感染事件。可使用各种测定测量溶瘤作用。在这些测定中，应使用对照病毒，经常为野生型/天然存在的形式。因此，可使用以下测定实例中的任一者：MTS(细胞毒性)、TCID₅₀(复制力)、LDH测定(乳酸脱氢酶(LDH)为在所有细胞类型中存在的稳定的酶，其在质膜损害后被迅速地释放至细胞培养基中)、FACS(细胞分选)、蛋白质印迹以及QPCR(晚期基因表达或基因组拷贝数)。其它实例对被领域技术人员来说为清楚的。

根据本发明的病毒的优势为此类病毒具有极少的遗传畸变。优选地，根据本发明的病毒将在其遗传序列中突变，诸如点突变形式(包括插入、删除、添加和置换)；点突变对于病毒的健康为较好的。较大的变化给病毒增加进化菌株。另外，基因组大小和完整性可为重要的。

与可用的现有溶瘤病毒(诸如H101病毒)相比，根据本发明的病毒具有显著改进的癌症选择指数或溶瘤指数(两个术语为可互换的)。这是指与癌细胞相比在正常细胞中的复制能力，其可以根据以下等式表示：

(OVc/OVn)/(WTc/WTn)＝癌症选择指数

其中OV＝溶瘤病毒复制能力；WT为对照病毒复制能力；c为癌细胞；n为正常细胞。

根据本发明的病毒的癌症选择指数可以为2至10,000，优选为5至5000、10至1000或50至500，这取决于细胞类型。就根据本发明的病毒的代表性实例而言，Ixovex，该病毒在HeLa细胞中的癌症选择指数对比对照显示为3.5；在A549细胞中显示为14；在H1299细胞中显示为2000以及在H460细胞中显示为450。在相同的细胞类型中，Onyx-015病毒比Ixo-ctrl的值为HeLa＝0.1倍；A549＝0.1倍；H1299＝0.05倍；以及H460＝0.004倍。

因此，将根据本发明的病毒应用于大部分肿瘤类型是可能的。一种理论为本发明的溶瘤病毒对p53阴性状态以及快速复制的细胞为选择性的。

此外，根据本发明的病毒将会遇到宿主免疫防御并最终被清除，这发生在完全的肿瘤根除之前。这不仅作为除去病毒的方式而呈现，因此否定由于病毒超负荷而引起的任何可能的肝脏毒性，而且提供在宿主中诱导抗癌免疫应答的机会，因为免疫系统对肿瘤中的病毒存在将为警觉的。

腺病毒

根据本发明的病毒为重组腺病毒。在书写本文时，存在超过65种描述的分布在七种(人腺病毒A至G)的人血清型(HAdV-1至65)以及来自其它哺乳动物和鸟的许多(参见Strauss,"Adenovirus infections inhumans,"The Adenovirus(1984)Ginsberg编辑,第451-596页PlenumPress,New York。对于腺病毒生物学的一般描述，参见Virology,第二版,Fields和Knipe编辑.第2卷,第1651-1740页,Raven Press,NewYork)。本文使用的术语“腺病毒”涵盖这些腺病毒物种中的任一种。优选地，根据本发明的腺病毒为亚科C组的人腺病毒，即血清型1、2、5、6或57中的一种。更优选地，术语腺病毒适用于两种人血清型，Ad2和Ad5。

在本发明的一个优选实施方案中，腺病毒为腺病毒血清型Ad5。腺病毒可以为腺病毒血清型Ad5株系pTG3602。株系pTG3602具有大约15个分散在35,000个核苷酸腺病毒基因组中的点突变，然而这些突变无一落在E1B基因内。于此，5型腺病毒为E1B病毒基因区的病毒多核苷酸的核苷酸编号惯例以及病毒编码的多肽的氨基酸编号提供常见的参考点。本领域技术人员将容易地识别在其它腺病毒的血清型中的相应的位置。于此，术语“重组体”指示通过人的部分有意修饰已经生成的多核苷酸构建体(如腺病毒基因组)。

E1B基因

根据本发明的病毒优选地携带E1B基因序列内的突变。所有的血清型编码将交叉血清型称为早期区1B(E1B)的基因，其编码DNA复制早期的基因产物。于此，“E1B基因”是指在任何腺病毒，优选为人腺病毒中的E1B基因的全长转录单位。E1B基因的代表性实例为来自5型腺病毒(Ad5)的基因，其具有根据SEQ ID NO:1的多核苷酸序列。其它实例对技术人员读者而言将为已知的并且详细内容可见于通常使用的数据库中，诸如，例如Entrez Gene(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)。在人5型腺病毒中，E1B编码区在基因组核苷酸数目1714处开始并在基因组核苷酸数目4043的E1B聚腺苷酸位点处结束。相似区存在于目前测试的所有腺病毒中，例如，包括各种物种，如绵羊腺病毒，蛇腺病毒，甚至蝙蝠腺病毒。

人腺病毒的E1B转录单位编码至少五个不同的剪接同工型(参见图2)(Takayesu等人(1994)J.Gen.Virol.75:789-798)。再次地，给定的Ad5的实例，主要的2.28kb E1B前体mRNA编码两个重叠的阅读框，一个针对176个残基的E1B-19K蛋白质(E1B-176R)，另一个针对E1B-55K蛋白质(496个残基；E1B-496R)。通过选择性剪接E1B-496R的常见的剪接供体(SD1)与三个剪接受体位点(SA1-3)中的一者之间的前体mRNA生成E1B-156R、E1B-93R、E1B-84R同工型(以表达产物中的氨基酸的数目命名)。所得mRNA编码E1B-496R N端的79个氨基酸，同时E1B-93R和E1B-84R具有独特的C端，E1B-156R通过E1B-496R的77个C端残基完成。在Kelemen,O.,P.Convertini等人(2012)."Function of alternative splicing."Gene中解释了选择性剪接。对技术人员显而易见的是在其它腺病毒血清型中的E1B同工型可以具有与上文针对Ad5讨论的那些略微不同的长度(如，在Ad2中E1B-156R的等效物的长度为155个氨基酸，因此经常被称为155R)。于此，同工型名称E1B-156R、E1B-93R、E1B-84R、E1B-176R和E1B-496R是指在所有腺病毒中大约相同大小的等效同工型，而不管等效同工型中实际的氨基酸数目。

通过使用对各个E1B-55k基因特异的起始和终止引物，使用PCR以扩增对E1B-156R特异的cDNA，已经确认E1B-156R同工型在广泛的腺病毒变体中存在(图14)。我们的实验在来自各个不同属的代表性病毒(A-Ad12、B1-Ad3、B2-Ad11、C-Ad5、D-Ad37、E-Ad4和F-Ad40)中显示相似的剪接模式。事实上，Ad1wt和Ad57wt具有同一的E1B-156R蛋白质序列；Ad2wt和Ad6wt也具有同一的序列；而Ad5wt仅略微不同于它们全部。这在整个亚科C中产生仅三种不同的E1B-156R蛋白质序列，在总共五个单氨基酸位置以及内部聚丙氨酸片段的长度中存在不同。因此，完全预料到的是本文在血清型Ad2和Ad5中证明的结果将反映在其它腺病毒变体。

已经进行了许多互补实验以显示E1B-156R的增加是已经观察到的溶瘤指数(OI)增加的原因(至少部分)，使得Ad5-156R的过表达通常使腺病毒的OI产生有效的增加。在本文的图11A、B和C以及图12中，显示5型腺病毒E1B-156R为亚科C组中OI的有效增强剂。此外，显示来自Ad2wt的E1B-156R等效物对Ad5wt的OI具有积极效果，这意指出现的效果不应限制为一种特定的腺病毒血清型。

于此，人Ad5的E1B-156R同工型具有根据SEQ ID NO:2的多核苷酸序列以及根据SEQ ID NO:3的多肽序列。于此，496R同工型具有根据SEQ ID NO:4的多核苷酸序列以及根据SEQ ID NO:5的多肽序列。于此，E1B-93R同工型具有根据SEQ ID NO:6的多核苷酸序列以及根据SEQ ID NO:7的多肽序列。于此，E1B-84R同工型具有根据SEQ ID NO:8的多核苷酸序列以及根据SEQ ID NO:9的多肽序列。技术人员读者应理解序列中一定程度的变异在天然存在的病毒变体中存在；因此，本发明包括与在有关提及的参考序列中列出的特异性序列不同，但与那些序列具有80％、85％、90％、95％、98％、99％或更多同源性或同一性的同工型序列，如通过常见的序列比对程序，例如，BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)计算，所述序列比对程序可为核苷酸BLAST(blastn)或蛋白质BLAST(blastp)。如果序列中的一者与其它序列具有足够高程度的同一性或相似性，则两个序列被认为是“同源的”，如本文使用的术语。“同一性”指示在比对的序列的任何特定位置处，序列之间的核苷酸为同一的。“相似性”指示在比对的多肽序列的任何特定位置处，序列之间的氨基酸残基为相似的类型。可容易地计算同一性和相似性的程度(Computational Molecular Biology,Lesk,A.M编辑,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing.Informatics and Genome Projects,Smith,D.W编辑,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,Part 1,Griffin,A.M和Griffin,H.G编辑,Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,AcademicPress,1987；以及Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J编辑,M Stockton Press,New York,1991)。

因此，本发明的实施方案包括不同的重组腺病毒，其中E1B-156R同工型具有与SEQ ID NO:2具有至少80％的序列同一性的多核苷酸序列以及与SEQ ID NO:3具有至少80％的序列同一性的多肽序列；其中E1B-496R同工型具有与SEQ ID NO:4具有至少80％的序列同一性的多核苷酸序列以及与SEQ ID NO:5具有至少80％的序列同一性的多肽序列；其中E1B-93R同工型具有与SEQ ID NO:6具有至少80％的序列同一性的多核苷酸序列以及与SEQ ID NO:7具有至少80％的序列同一性的多肽序列；以及其中E1B-84R同工型具有与SEQ ID NO:8具有至少80％的序列同一性的多核苷酸序列以及与SEQ ID NO:9具有至少80％的序列同一性的多肽序列。不同的E1B-156R同工型序列的代表性实例在本文给出(图13)。包括的与Ad5E1B-156R等效的序列为与图13中提供的那些序列具有80％、85％、90％、95％、98％、99％或更多同一性的那些(如上文针对Ad5描述)。通过工程学的同工型水平的调节。

根据本发明，对由E1B基因表达的E1B基因产物的剪接同工型的水平和/或类型进行了修饰，结果为病毒变为溶瘤的。可以通过任何方法调节E1B同工型的水平和/或类型，例如使用设计成在选定位置特异性地切割E1B同工型mRNA的核酶，从而防止mRNA翻译成功能性多肽。替代方法对本领域技术人员而言将为显而易见的并且包括多拷贝的E1B基因序列或编码E1B-156R的形式的插入；调节E1B基因表达或编码E1B-156R的形式的活化，例如通过调节启动子或增强子序列；调控序列的插入等。

于此，我们以根据本发明的不同的腺病毒的特定的实例提供了在实现效果的E1B基因的剪接区域中包括一个或多个突变的腺病毒。因为剪接体对剪接位点识别受到mRNA二级结构的影响为已知的，所以影响其mRNA的二级结构的E1B基因的突变也可以调节E1B同工型的水平和类型。例如，突变可以通过改变E1B基因的多核苷酸的多肽序列而除去剪接位点；或可以通过改变E1B基因的多核苷酸序列并保留原始的多肽序列而除去剪接位点。

在一个实施方案中，当E1B基因在一个或多个剪接识别区突变时，可以实现该效果，所述剪接识别区包括：a)剪接供体位点1(SD1)；E1B-93R剪接受体(SA1)；c)E1B-156R剪接受体(SA2)；d)E1B-84R剪接受体(SA3)；和/或e)剪接供体位点2(SD2)。

在Ad5的实例情况中，这些剪接位点在以下位置并具有以下序列：SD1在Ad5基因组的位置2251-2255处(Ad5基因组登录号AC_000008.1(SEQ ID NO:41)的位置2256-2260处以及E1B基因(SEQID NO:1)的位置543-547处)具有序列GTGGC。E1B-93R剪接受体(SA1)在Ad5基因组的位置3218-3222处(Ad5基因组登录号AC_000008.1(SEQ ID NO:41)的位置3213-3217处以及E1B基因(SEQ ID NO:1)的位置1500-1504处)具有序列AACAG。E1B-156R剪接受体(SA2)在Ad5基因组的位置3276-3280处(Ad5基因组登录号AC_000008.1(SEQ IDNO:41)的位置3271-3275处以及E1B基因(SEQ ID NO:1)的位置1558-1562处)具有序列TTGAG。E1B-84R剪接受体(SA3)在Ad5基因组的位置3595-3599处(Ad5基因组登录号AC_000008.1(SEQ ID NO:41)的位置3590-3594处以及E1B基因(SEQ ID NO:1)的位置1877-1881处)具有序列TGCAG。剪接供体位点2(SD2)在Ad5基因组的位置3506-3510处(Ad5基因组登录号AC_000008.1(SEQ ID NO:41)的位置3511-3515处以及E1B基因(SEQ ID NO:1)的位置1798-1802处)具有序列GTACT。在其它人血清型中的等效位置的等效位点对灌输有本发明教导的本领域技术人员而言将为显而易见的。

因此，本发明的一个方面为重组腺病毒，其中E1B基因剪接识别区在Ad5基因组的一个或多个下述位置处为突变的：a)腺病毒Ad5基因组(登录号AC_000008.1)(SEQ ID NO:41)的核苷酸3216(E1B基因(SEQ ID NO:1)的位置1503)；b)腺病毒Ad5基因组(登录号AC_000008.1)(SEQ ID NO:41)的核苷酸3218(E1B基因(SEQ ID NO:1)的位置1505)；和/或c)腺病毒Ad5基因组(登录号AC_000008.1)(SEQID NO:41)的核苷酸3221(E1B基因(SEQ ID NO:1)的位置1508)。E1B基因可以含有一个或多个下述突变：a)腺病毒Ad5基因组的A3216G(E1B基因(SEQ ID NO:1)的位置1503处)；b)腺病毒Ad5基因组的G3218A(E1B基因(SEQ ID NO:1)的位置1505)；和/或c)在腺病毒Ad5基因组的G3221A(E1B基因(SEQ ID NO:1)的位置1508)。于此，所有点突变的位置根据Ad5基因组登录号AC_000008.1(SEQ ID NO:41)进行编号。

下表鉴定了Ad5基因组中E1B基因的剪接识别区的序列和位置。“Ad 5基因组位置”和“E1B基因位置”对应于紧挨着剪接供体位点(SD1和SD2)上游的并且紧挨着剪接受体位点(SA1、SA2和SA3)下游的五个残基。

“斜杠”指示实际的剪接位点。

E1B基因的剪接识别区内的病毒序列的突变可包括a)通过改变E1B基因的多核苷酸和多肽序列除去剪接位点；或b)通过改变E1B基因的多核苷酸序列并且保留原始的多肽序列除去剪接位点。如技术人员所了解，遗传密码中存在冗余，即，一些氨基酸由多个密码子编码。通过突变相应的腺病毒DNA可从转录的E1B mRNA中除去剪接位点序列以使用在这些位点多核苷酸序列编码的针对氨基酸的替代性密码子。因此，所得的翻译蛋白质将优选不含有任何氨基酸变化。下文的密码子表显示冗余的遗传密码。

在优选的实施方案中，由于E1B基因中突变的93R剪接位点，所以实现增加的E1B-156R同工型水平。

在优选的实施方案中，E1B基因剪接识别区在一个或多个下述位置为突变的：a)腺病毒Ad5基因组(登录号AC_000008.1)(SEQ ID NO:41)的核苷酸3216(如cagGAGG->cggGAGG)；b)腺病毒Ad5基因组(登录号AC_000008.1)(SEQ ID NO:41)的核苷酸3218；和/或c)腺病毒Ad5基因组(登录号AC_000008.1)(SEQ ID NO:41)的核苷酸3221。在其它腺病毒血清型中的等效突变对技术人员读者而言将为清楚的。

在更优选的实施方案中，E1B基因含有一个或多个下述突变：a)A3216G(cagGAGG->cggGAGG)；b)G3218A；和/或c)G3221A，分别对应于E1B基因(SEQ ID NO:1)中的位置1503、1505和1508。在其它腺病毒血清型中的等效突变对技术人员读者而言将为清楚的。

同工型的水平

被引入腺病毒基因组序列内的任何突变应具有以下效果：至少一种E1B剪接同工型、E1B-156R、E1B-496R、E1B-93R、和E1B-84R(以及可能两种、三种或所有四种同工型)的比例对于相似条件下在野生型中存在的水平而变化。优选地，E1B-496R同工型的比例相对于野生型水平有所降低，或甚至完全地关闭。可选地，E1B-156R同工型的比例相对于E1B-496R同工型有所增加，E1B-156R同工型的比例相对于E1B-93R同工型有所增加和/或E1B-156R同工型的比例相对于E1B-84R同工型有所增加。特定同工型的水平上的这些变化具有增强溶癌作用的效果，其也可表示为增强溶瘤指数。

E1B-156R同工型的水平相对于等效的野生型腺病毒序列中的E1B-156R可有所增加。于此，“增加的”意指E1B-156R同工型的比例相对于野生型水平增加到至少2倍、4倍、10倍、20倍、50倍、100倍、1,000倍或10,000倍。

于此，“降低的”意指E1B-496R同工型的比例相对于野生型水平降低至少2倍、4倍、10倍、20倍、50倍、100倍、1,000倍或10,000倍。

于此，“野生型水平”是指E1B-156R、E1B-496R、E1B-93R和E1B-84R同工型的水平，其通过表达来自野生型腺病毒(在E1B基因参考序列(即，SEQ ID NO:1)中没有突变)的这些蛋白质来证明。例如，突变的Ad5E1B-156R同工型的比例可以相对于野生型Ad5腺病毒的水平有所增加，使得突变的腺病毒在癌细胞中具有溶瘤作用。突变的Ad2E1B-156R同工型可以相对于野生型Ad2腺病毒的水平有所增加。

根据本发明的优选的病毒可以减少E1B-93R的表达或抑制E1B-93R的表达，并且优选地不表达E1B-93R。“不表达”在本文中意指E1B-93R序列的可检测水平比等同条件下的野生型腺病毒的E1B-93R序列的水平低50％、10％、1％，优选低于0.1％，低于0.01％或甚至更低。这具有升高E1B-156R表达的效果。

优选地，与野生型病毒的约5:70:10:15相比，E1B-156R、E1B-496R、E1B-93R和E1B-84R同工型蛋白质水平的最适比率将按照约67:0:0:33。然而，如技术人员读者将了解，关于这种类型的相对水平，要求精确是困难的或不可能的，因为所述相对水平依赖于评价的感染循环的点，即早期/中间/晚期。对较短的剪接型有益的比率变化以496R(其为未剪接的、全长RNA)为代价。特别地，E1B-156R同工型与E1B-496R同工型的有利比率为2:1、5:1、10:1、20:1、50:1、100:1、1000:1或10,000:1或更高。100:1或更高的比率为优选的。

本文提及的E1B-156R、E1B-496R、E1B-93R或E1B-84R同工型的“比例”是指：a)表达的同工型蛋白质的水平；和/或b)产生的同工型mRNA的水平。

测量mRNA水平的技术对本领域技术人员用于多核苷酸的定量将为已知的，诸如，例如，核酸扩增，例如PCR、RT-PCR，基于TaqMan的方法学，RNase保护，Northern印迹和原位杂交技术以及这些方法的定量形式。mRNA表达水平的变化可以为时间、空间或定量性质。可计算每个E1B同工型mRNA的拷贝数目并与参考，例如，管家基因诸如β-肌动蛋白或GAPDH或携带特异性“目标扩增子”的质粒进行比较。

如果将监控多肽水平，则可使用可确定特异性多肽水平任何测定技术，其包括放射性免疫测定(RIA)、竞争性结合测定、蛋白质印迹分析、FACS以及酶联免疫吸附(ELISA)测定。例如，可以使用特异性结合于特定的剪接同工型的抗体。可以使用具有或不具有修饰的抗体，以及可以通过将所述抗体与分析上可检测的试剂诸如放射性同位素、荧光分子或酶或其它报告分子共价地或非共价地连接来进行标记。可以使用本领域已知的多种报告分子。

E1B同工型

关于E1B-156R、E1B-93R、E1B-84R同工型知之甚少。在感染过程期间调控生成不同的E1B mRNA。虽然2.28kb形式主要在感染早期生成，但随着时间的推移较短剪接的mRNA的比例增加，而在感染晚期E1B-84R转录物变为主要的。同工型蛋白质表达紧接着mRNA的转录模式(Chow等人(1979)J.Mol.Biol.134:265-303；Montell等人(1984)Mol.Cell.Biol.4:966-972；Spector等人(1978)J.Mol.Biol.126:395-414；Virtanen和Pettersson(1985)J.Virol.54:383-391；Wilson和Darnell(1981)J.Mol.Biol.148:231-251)。

已经显示不同的剪接类型(spliceotype)可通过N端彼此不同类地或同类地相互作用，而C端应携带不能通过选择性E1B剪接类型互补的特异性功能。当感染有缺乏特异性剪接类型的表达的病毒时，可通过与表达质粒共感染相应的剪接类型来互补活力丧失。与选择性剪接类型的共感染不会互补该丧失。

突变的腺病毒

下表概述了在以本发明的教导的实例提供的一些代表性腺病毒突变体连同一些实验性对照病毒的详细内容。

^a根据在Ad5基因组登录号AC_000008.1(SEQ ID NO:41)中的位置编号

在此被称为Ixovex病毒的腺病毒具有减少E1B-93R的表达或抑制E1B-93R的表达，并且优选地不表达E1B-93R。“不表达”在本文意指E1B-93R序列的可检测水平比等同条件下的野生型腺病毒的E1B-93R序列的水平低50％、10％、1％，优选低于0.1％，低于0.01％或甚至更低。这具有升高E1B-156R表达的效果。

另外，在该病毒中，全长E1B蛋白质E1B-496R为非稳定的。“非稳定的”意指由于突变而引起蛋白质变为基本上不可检测的。这仅留下来自496个阅读框的E1B-156R和E1B-84R仍表达。E1B-55k的不稳定性质在Gabler等人，1998J.Virol.；和Gonzalez 2002,J.Virol中进行了讨论。

与H101相比的Ixovex的功效表明在一定程度上，E1B-496R和E1B-156R具有重叠的功能(Sieber等人，(2007)J.Virol.81(1):95-105)。已经发现E1B-496R和E1B-156R结合许多相似的因素。E1B-156R可结合于E4orf6(结合伴侣)，含有结合伴侣的E1B-496R利用其大部分重要的功能。有趣地，也已经发现E1B-156R结合p53，虽然亲和力较低。在细胞转化实验中E1B-156R可代替E1B55k。另外，当与E1A一起过表达时，E1B-156R在体内模型中诱导肿瘤。具体地，于此发现E1B-156R剪接体(spliceomer)具有从E1B-496R蛋白质分离的细胞转化潜能。

本发明的优势为：为了实现描述的致癌效果，根据本发明的病毒不需要删除整个E1B基因。

生成重组病毒的方法

本发明提供编码重组腺病毒，任选地在适合于病毒产生的宿主细胞中的载体内编码的多核苷酸。

本发明提供包含编码重组腺病毒的多核苷酸的宿主细胞。

本发明还包括使腺病毒溶瘤的方法。此类方法包括工程改造突变的腺病毒，其中已经修改了E1B基因的序列以便增加相对于等效的野生型腺病毒的水平的E1B-156R同工型的水平。腺病毒类型可为上文描述的那些中的任一种，并且优选为亚科C组的人腺病毒，即血清型1、2、5、6或57中的一者，甚至更优选地，术语腺病毒适用于两种人血清型，Ad2和Ad5。相似地，突变可以为本文描述的或例示的那些中的任一种。在某些实施方案中，杂交病毒可以为工程化的，例如，其中来自一种腺病毒变体的E1B-156R在另一腺病毒变体中表达。例如，Ad2E1B-156R可以在Ad5腺病毒中表达；已经在本文显示将Ad2E1B-156R加入至Ad5使溶瘤活性增加到10倍。

工程改造选择性腺病毒的突变的合适的技术对本领域技术人员而言将为已知的。优选的方法可为使用广泛使用的pShuttle系统(AgilentTechnologies)或使用由Dr.(IXOvex的发明人以及IXOgen的董事会成员))开发的使用pSuperShuttle系统(参见Ingemarsdotter,C.K.,S.K.Baird,C.M.Connell,D.Oberg,G.Hallden和I.A.McNeish.2010.Low-dose paclitaxel synergizes with oncolytic adenoviruses via mitoticslippage and apoptosis in ovarian cancer.Oncogene 29:6051-6063)的方法。这允许在腺病毒任何地方插入或突变任何序列(这是pShuttle不能做到的)，但受腺病毒基因组的末端区域的限制。简言之，可以将目标区域的侧翼序列(左臂和右臂)克隆入在抗生素选择基因(ASG)各侧处的pSuperShuttle质粒。如果期望任何种类的突变(置换、删除或添加)，则可将其掺入任一臂中。对于将目标基因或全部表达盒插入病毒而言，可以使用ASG各侧处的大量的多克隆位点。当全部的pSupershuttle构建体定序并准备好时，通过同源性重组将其与病毒融合。插入的ASG允许阳性选择。消化掉ASG，留下独特的限制酶位点形式的小的疤痕，所述限制酶位点可用于病毒的未来修饰。该技术的其它合适的变异对于本领域技术人员而言将为已知的。

腺病毒E1B-55K突变体的构建

用于构建腺病毒突变体的方法通常为本领域已知的。参见，Mittal(1993)Virus Res.,28:67-90以及Hermiston等人，Methods inMolecular Medicine:Adenovirus Methods and Protocols(1999)ed.Wold,Humana Press。此外，腺病毒5基因组被登记为NCBI参考序列：AC_000008.1，并且病毒可以以登录号VR-1516从American TypeCu1ture Collection,Rockville,Md.,U.S.A获得。

通常，腺病毒载体构建包括使用标准的技术将在质粒盒中的腺病毒基因组，优选为Ad5基因组的期望区域进行初始删除或修饰。

用于构建腺病毒突变体的某些材料类和方法描述于Hanke等人，(1990)Virology,177:437-444和Bett等人,(1993)J.Virol.67:5911-5921以及在PCT/CA96/00375中。用于构建腺病毒突变体的许多材料为商业提供的。也参见Hermiston等人，Methods in MolecularMedicine:Adenovirus Methods and Protocols(1999)ed.Wold,HumanaPress。本文提供其它详细内容。

用于进行本文描述的实验的细胞系可容易地从认可的保藏机构获得。例如，本文使用以下细胞系以评价细胞毒性：H1299、FaDu、H460、A549、HeLa、Hek293、JH293和NHBE。

构建本发明的腺病毒E1B基因突变体的优选的程序为使用良好建立的分子生物学技术或这些技术的改进(本文提及的)以在质粒盒的腺病毒基因组中进行位点特异性突变。这可使用各种材料和方法实现。

治疗癌症的方法

本发明提供在癌细胞中产生溶瘤作用的重组腺病毒。癌细胞可以为瘤细胞。本发明还提供治疗特征为瘤细胞的癌症的新型方法。瘤细胞可以优选为基本上缺乏p53功能(p53^(-))。此类方法可以包括：

a)向需要治疗的患者施用一剂根据本发明的重组腺病毒，其携带E1B基因的突变；

b)使重组腺病毒感染所述癌症的瘤细胞充足的时间，其中突变的腺病毒具有溶瘤作用，相对于非瘤细胞，所述溶瘤作用对癌细胞具有选择性；以及

c)任选地施用其它剂量的重组腺病毒。

癌细胞或瘤细胞可以基本上缺乏p53功能。

本发明提供用作治疗患有癌症的患者的治疗剂的重组腺病毒。优选地，癌症的特征在于瘤细胞。优选地，那些瘤细胞基本上缺乏p53功能。

本发明也提供包含本发明的重组腺病毒的组合物。

本发明提供包含本发明的重组腺病毒的药物组合物。

本发明也提供制备药物组合物的方法，所述方法包括将本发明的重组腺病毒与药学上可接受的载体组合。

组合物可以另外地包含用于化疗的药剂。

本发明通过用重组腺病毒感染瘤细胞来提供除去瘤细胞的若干新型方法和组合物，所述重组腺病毒在非瘤细胞中基本上为复制缺陷的并且在瘤细胞中至少显示出部分复制表型。本发明的腺病毒构建体在瘤细胞和非瘤细胞中的复制表型差异为基于病毒的癌症的治疗提供生物学基础。

在感染条件(即，适合于细胞群的腺病毒感染的条件，通常为生理条件)下，细胞群(诸如混合的细胞培养物、人癌症患者或非人哺乳动物受试者)可与包含感染性剂量的E1B-p53(-)复制受抑制的腺病毒的组合物进行接触，所述细胞群包括缺乏p53功能的瘤细胞的亚群以及表达基本上正常的p53功能的非瘤细胞的亚群。此类接触步骤导致细胞群感染E1B-p53(-)复制缺陷的腺病毒。感染在包含缺乏p53功能的瘤细胞的亚群的显著比例的细胞中产生复制表型的优先表达，但在具有基本上正常的p53功能的非瘤细胞的亚群中不产生复制表型的显著表达。在感染p53(-)细胞的复制表型的表达诸如通过细胞病变效应(CPE)、细胞裂解、细胞凋亡或相似导致细胞死亡，从而导致从细胞群中选择性除去瘤p53(-)细胞。

期望的是突变的病毒为可复制的并且形成含有突变的病毒基因组的感染性病毒颗粒，其可以传播并感染其它细胞，因此放大突变病毒的初始剂量的抗瘤行为。

于此，适合于选择性杀死p53^(-)瘤细胞的E1B-p53^(-)复制受抑制的腺病毒构建体为上文描述的那些。

可以进一步评估候选抗瘤腺病毒突变体减少携带缺乏p53功能的瘤细胞的移植的nu/nu小鼠与携带瘤细胞的等效移植的未处理的小鼠相比的肿瘤生成或瘤细胞负担的能力。

可以配制抗瘤复制缺陷的腺病毒突变体用于治疗性、预防性以及，潜在地诊断性施用于患有肿瘤性疾病的患者。对于治疗性或预防性用途，将含有药理有效剂量的抗瘤复制受抑制的腺病毒突变体的一种或多种物种的无菌组合物施用于患者用于瘤病患的治疗。经常将药学上可接受的载体或赋形剂用于此类无菌组合物中。可使用多种水溶液，如，水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸等。这些溶液为无菌的并且通常不含除了期望的腺病毒病毒颗粒之外的颗粒物质。组合物可以含有按需要接近生理条件的药学上可接受的辅助物质pH调节剂和缓冲剂、张度调节剂等，例如醋酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。可以包括增强腺病毒感染细胞的赋形剂。

可以通过向患者或受试者施用包含本发明的复制缺陷的腺病毒的组合物提供肿瘤性疾病的治疗。包括缺乏p53功能的细胞的各种人和哺乳动物肿瘤可以用复制受抑制的腺病毒构建体处理。例如(但不限于)，患有支气管癌、鼻咽癌、喉癌、小细胞和非小细胞肺癌、肺腺癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、结肠癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌或淋巴细胞性白血病的人患者或非人哺乳动物可以通过施用有效抗瘤剂量的适当的复制受抑制的腺病毒来治疗。

感染性腺病毒颗粒的混悬剂可以通过各种途径施用于瘤组织，所述途径包括静脉内、腹膜内、肌内、皮下和局部。含有约10³至10¹⁵或更多个病毒体颗粒/ml(诸如约10⁵至10¹²或更多个病毒体颗粒/ml、约10⁷至10¹⁰或更多个病毒体颗粒/ml或约10⁹个病毒体颗粒/ml)的腺病毒混悬剂，优选为水性混悬剂可以以雾剂吸入(如用于肺递送以治疗支气管癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌或喉癌症)。可选地，可以将此类混悬剂直接擦拭在肿瘤位点用于治疗肿瘤(如支气管癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌)或可以通过输注(如，至腹腔内用于治疗卵巢癌症，至门静脉内用于治疗肝癌或来自其它非肝原发性肿瘤的肝转移)或其它合适的途径，包括直接注入肿瘤团块(如，乳腺肿瘤)、灌肠剂(如，结肠癌症)或导管(如，膀胱癌症)施用。

也可以通过脂质体或免疫脂质体递送将复制受抑制的病毒递送至瘤细胞；基于瘤细胞群上存在的细胞表面性质(如结合免疫脂质体中的免疫球蛋白的细胞表面蛋白质的存在)，此类递送可以选择性地靶向瘤细胞。例如，可通过常规方法(例如参见美国专利第5,043,164号、美国专利第4,957,735号、美国专利第4,925,661号；Connor和Huang(1985)J.Cell Biol.101:582；Lasic DD(1992)Nature 355:279；Novel Drug Delivery(1989).Prescott和Nimmo编辑,Wiley,New York；以及Reddy等人,(1992)J.Immunol.148:1585)将复制受抑制的腺病毒病毒颗粒的混悬剂包封在胶束中以形成免疫脂质体。包含特异性结合于在个体的癌细胞上存在的癌细胞抗原(如，CALLA、CEA)的抗体的免疫脂质体可以用于靶向那些细胞的病毒颗粒。

可施用含有本抗瘤复制缺陷的腺病毒或其混合物的组合物用于肿瘤性疾病的预防性治疗和/或治疗性治疗。在治疗性应用中，以足以治愈或至少部分地阻滞病患及其并发症的量将组合物施用于已经受特定的肿瘤性疾病影响的患者。足以实现此的量被定义为“治疗有效剂量”或“有效剂量”。对该用途有效的量将取决于病患的严重度、患者的一般状态以及施用途径。

在预防性应用中，将含有抗瘤复制受抑制的腺病毒或其混合物的组合物施用于目前未处于肿瘤性疾病状态的患者以增强患者对肿瘤复发的抗性或延长缓解时间。此量被定义为“预防有效剂量”。在该用途中，精确量再次取决于患者的健康状态以及免疫的一般水平。

组合物的单次或多次施用可用由治疗医师选定的剂量水平和模式进行。在任何情况下，药物制剂应提供一些本发明足以有效地治疗患者的抗瘤复制受抑制的腺病毒。

本发明的抗瘤复制受抑制的腺病毒的治疗可以与其它抗瘤方案，诸如常规化疗组合。

概述

术语“包含”涵盖“包括”以及“由……组成”，如“包含”X的组合物可以仅由X组成或可以包括某些另外的如X+Y。

单词“基本上”不排除“完全地”，如“基本上不含”Y的组合物可以完全地不含Y。必要时，单词“基本上”可以从本发明的定义中省略。

除非另外指明，否则本发明的实施将使用分子生物学、微生物学、重组DNA技术和免疫学的常规技术，其在本领域的技术范围内。

大多数一般的分子生物学，微生物学重组DNA技术和免疫学技术可见于Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(2001)Cold Harbor-Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y或Ausubel等人,Current protocols in molecular biology(1990)John Wiley和Sons,N.Y。

除非另外限定，否则本文所用的科学技术术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。

附图简述

图1.溶瘤病毒的示意性描述。

图2.显示替代的E1B基因产物的E1B剪接示意图。全长E1B转录物携带E1B-176R和E1B-496R开放阅读框(ORF)。通过替代E1B-496ORF中的剪切，表达另外三种蛋白质，E1B-93R、E1B-156R和E1B-84R。较小的蛋白质具有79个与E1B-496R相同的氨基端氨基酸，但羧基端不同，除了E1B-156R(其在含E1B-496R的框中剪接)外。

图3.在Ixovex的E1B-55k蛋白质中氨基酸变化抑制其表达。用各个病毒以5pfu/细胞感染A549细胞并在感染后48小时(hpi)收集总的细胞裂解物。显示的是用多克隆α-衣壳蛋白Ab6982抗体(上图)、单克隆α-E1B-55k抗体2A6(中图)以及作为上样对照的单克隆α-肌动蛋白抗体I-19-SC(下图)染色的蛋白质印迹。

图4.Ixovex的E1B55k开放阅读框中的点突变抑制对93R剪接受体的剪接。用各个病毒以5pfu/细胞感染A549细胞并在48hpi时收集总RNA。使用oligo-dT引物制备cDNA。使用55k剪接供体上游的常见同义引物以及各个剪接受体下游的特异性引物进行PCR。在用GelRed染色的2％琼脂糖TBE凝胶上运行PCR反应。

图5.在诱导p53的降解中抑制Ixovex。用各个病毒以5pfu/细胞感染A549细胞并在48hpi时收集细胞裂解物。显示的是用单克隆α-p53抗体#9282CS(上图)以及作为上样对照的单克隆α-肌动蛋白抗体I-19-SC(下图)染色的蛋白质印迹。

图6.癌细胞系中的复制测定。用5pfu/细胞的各个病毒感染每种细胞系。在24、48和72hpi时收获细胞和培养基并通过有限稀释测定进行分析。在10天之后肉眼记录CPE并如材料和方法所述计算TCID₅₀(pfu/细胞)结果。

图7.Ixovex、Ad5wt和Onyx-015病毒在癌细胞中的相对细胞毒性。用指定的病毒以5倍稀释系列感染各个细胞系。在感染后6天(dpi)使用MTS测定测量细胞毒性并计算EC₅₀值。

图8.在正常的人支气管上皮细胞中的复制效率。用5pfu/细胞的各个病毒感染每种细胞系。在24、48和72hpi时收获细胞和培养基并通过有限稀释测定进行分析。在10天之后肉眼记录CPE并如本文所述计算TCID₅₀(pfu/细胞)结果。

图9.与未修饰的病毒(Ad5wt)相比，Ixovex对正常细胞细胞毒性显示小500倍。呈现的是相对于Ad5wt(底行)和原始EC₅₀值(顶行)的细胞毒性的倍数抑制。在6dpi时使用MTS测定测量细胞毒性。

图10.E1B-156R蛋白质被Ixovex过表达。在48hpi时由用10pfu/细胞的Ixovex或Ad5wt感染的H1299细胞提取的总蛋白质上进行蛋白质印迹。

图11.Ad5-156R和Ad2-156R蛋白质增强与正常细胞相比的癌细胞的溶瘤指数(OI)。A)使Ad5-156R和Ad2-156R表达质粒转染入Ad5wt感染的HeLa和NHBE细胞。平行地，另外的癌细胞系(H460，大细胞肺癌)被包括在Ad5-156R互补中。B)使Ad5-156R转染入ONYX-015感染的细胞。C)使Ad5-156R转染入Ad2wt感染的细胞。用2.5pfu/细胞感染并用针对各个E1B-156R的表达质粒互补或交叉互补细胞。在指定的hpi处用Burst(病毒复制)测定分析样品。

图12.显示针对图11A-C(除了在72hpi时收集的H460数据点以外)的48hpi数据点以及溶瘤指数的计算的表格，其中OI＝((a/b)/(c/d)).a＝pfu/细胞癌细胞+156R，b＝pfu/细胞正常细胞+156R，c＝pfu/细胞癌细胞-156R，d＝pfu/细胞正常细胞-156R。

图13.与亚科B、D和E的血清型的序列比对的腺病毒亚科C的血清型的E1B-156R的蛋白质序列。阴影区：C组内的相似性。缺口指示不同之处。在Ad5加下划线的：将从亚科C的其它E1B-156R蛋白质中挑选出Ad5-156R的氨基酸。

图14.DNA凝胶，其显示对应于Ad2、Ad4和Ad11中E1B-156R的扩增的cDNA带。将凝胶中的所有带克隆入Topo-II PCR BluntVector(Invitrogen)并测序以确认相应于各个病毒的E1B-156R的指定的带。

实施例

材料和方法

病毒构建

使用Ad5起始(SEQ ID NO:15-ccacctcgagttaattaacatcatcaataatataccttattttg)以及Ad5wt5055as(SEQ ID NO:16-gtgggtttaaacggatttggtcagggaaaacatg)寡核苷酸用Phusion PFU聚合酶PCR扩增腺病毒血清型5(Ad5)的核苷酸1-5055。将从CsCl纯化的Ad5批提取的病毒基因组DNA用作模板。使用限制性酶NotI和PmeI(NEB)，将PCR产物克隆入pShuttle(Stratagene)。为了在pShuttle-5055中产生E1B 93R剪接位点突变，根据制造商的说明书，将寡核苷酸Mut93Rs(SEQ ID NO:17-ccttgcatttgggtaatagaagaggagtgttcctaccttaccaatg)以及Mut93Ras(SEQ IDNO:18-cattggtaaggtaggaacactcctcttctattacccaaatgcaagg)用于PCRMutagenesis XL反应(Stratagene)。筛选克隆并送去测序。将5μg正确的克隆使用PmeI(NEB)线性化，用苯酚/氯仿处理以及乙醇沉淀。将200ng与100ng pTG3602质粒一起混合。将混合物电穿孔入BJ5183细胞(Stratagene)并在含有卡那霉素(25μg/ml)的琼脂板上涂板。通过破碎凝胶上的尺寸排阻筛选克隆。简言之，将1ml细菌培养物的沉淀物重悬浮于50μl水中并用50μl苯酚/氯仿处理。将混合物在13,000rpm旋转1min并收集水相。将含有来自细菌所有DNA和RNA的水相用含有RNaseH的DNA上样染料处理5min，然后在0.7％琼脂糖凝胶上运行。由选择的克隆制备DNA(Qiagen Maxi Prep试剂盒)并测序以确保已经引入正确的突变。将5μg正确的pT3602突变用PacI消化以切除病毒基因组，用苯酚/氯仿处理以及乙醇沉淀。使用Transfectene(Biorad)，将2μg消化的质粒转染入6孔板中的10⁵个Hek293细胞。五天后，收获细胞，经历三轮冷冻/解冻并应用于与A549细胞80％亚融合的T175瓶用于形成大量(bulking up)感染的细胞裂解物。

将CF-10(Thermo Scientific)用Hek293细胞接种并与1/3的细胞裂解物在80％的融合下感染。三天后，收获CF-10。将细胞沉淀物冷冻/解冻三次，离心以清除裂解物，应用至1.25/1.4g/ml CsCl梯度并在超速离心机中以25,000rpm旋转。将病毒带用21G注射器收集并分配入1.35g/ml CsCl柱。将柱在40,000rpm旋转过夜并用21G注射器收集病毒带。将提取的病毒注入Slide-A-Lyzer(Thermo Scientific)盒并在4℃过夜透析入50mM TRIS pH 7.8，150mM NaCl，1mM MgCl₂，10％甘油。然后，通过使用在下文病毒复制部分描述的JH293细胞确定病毒活性，其通过50％的组织培养感染剂量(TCID₅₀)(pfu/ml)评价。从小的等分试样纯化病毒DNA并使用分光光度计确定病毒基因组/μl(颗粒/μl)的数目。本文使用的所有病毒颗粒与活性之间的比率小于20。Ixo-ctrl病毒为来自腺病毒血清型5株系pTG3602的野生型克隆。

平行地，根据制造商的建议使用PCR Mutagenesis XL Kit(Stratagene)制备pShuttle质粒，其中所有剪接位点单独突变而不会改变E1B-496R蛋白质的氨基酸序列。

所有这些pShuttle质粒在同源性重组中使用以生成一大组病毒(参见表格1)。

表1.本发明提供的腺病毒突变体.

^a根据在Ad5基因组登录号AC_000008.1(SEQ ID NO:41)中的位置编号

组织培养

将所有细胞在37℃和5％CO₂下培养并对支原体污染进行定期测试。本研究中使用的细胞系如下所列。

细胞毒性测定

我们使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓(tetrazolim)(MTS)测定(CellTiter 96AqueousNon-Radioactive Cell Proliferation Assay；Promega,Wisconsin,USA)以评价Ixovex和对照病毒的细胞毒性。为了使细胞在第6天融合的目标，将1,000-4,000个细胞/孔(取决于生长速率)接种在含90μl培养基和5％FCS的96孔板中。18小时后以10,000个病毒颗粒(vp)/细胞开始以九个1:10系列稀释加入病毒(在10μl培养基和5％FCS中)，连同阳性对照(仅含有无病毒的细胞)以及阴性对照(仅培养基而无细胞)。

在感染后六天，使用MTS测定确定存活率。将MTS与吩嗪硫酸甲酯(phenazinemethosulphate)(PMS)以20:1的比率混合并加入至细胞。在孵育三小时之后，使用Opsys MR 96孔微量滴定板读数器以及Revelation Quicklink 4.04软件(Dynex Technologies,Virginia,USA)在490nm处测量吸光度。对于各个稀释建立数值并与阴性对照(100％细胞死亡)和阳性对照(0％细胞死亡)比较。利用下式使用GraphPad Prism(GraphPad Software,California,USA)通过非线性回归(S形剂量反应曲线)计算EC₅₀值(杀死50％的细胞的半最大效应浓度-EC₅₀)：

Y＝底部+(顶部-底部)/1+10^[log ₁₀ ^EC ₅₀ ^{-X)×希耳斜率]}

Y为反应，开始于“底部”并以S形方式到“顶部”。

所有实验一式三份进行。

病毒复制测定

在感染前，将细胞接种在含10％的FCS培养基的6孔板中保持24小时。将100vp/细胞用于感染在2％的FCS培养基中的80％的融合细胞。在感染后两小时，将培养基用10％的FCS培养基替换(初次感染)。在感染后的几个小时(在各个图中指定)处，收获培养基和细胞(通过刮削)，分别在液氮和37℃冷冻和解冻三次并在-80℃储存直至使用。将JH293细胞以10,000个细胞/孔接种在200μl含5％FCS的培养基的96孔板中。在第一行的TCID50中，不同样品的初始稀释物为未稀释的至1:1000，这取决于hpi和病毒，来自初次感染的这些稀释物用于感染JH293细胞。最后一行作为阴性对照保持未感染的。在第9天至第11天之间，检查板的致细胞病变效应(CPE)。使用Reed-Muench累计法计算50％的组织培养感染剂量(TCID₅₀)以及pfu/细胞的数目(在感染当天的细胞计数)。参见以下实例：

96孔板的实例(+充分指示具有CPE的证据)：

稀释 CPE的％

·计算适当的距离：(下一个大于50％的％-50％)/(下一个大于50％的％-下一个低于50％的％)＝(100％-50％)/(100％-42％)＝0.86

·计算50％的端点log₁₀(下一个大于50％的稀释位置)＝log₁₀10^-5＝-5

·将所述值组合以获得log₁₀TCID₅₀＝-5-0.86＝-5.86

·TCID₅₀滴定度＝10^-5.86(或加入至顶行的量的1/7.24×10⁵稀释)。因为将22μl(0.022ml)加入至顶行，所以TCID₅₀/ml＝7.24×10⁵/0.022＝3.29×10⁷

·乘以常数：3.29×10⁷×0.69＝2.27×10⁷pfu/ml

对于pfu/细胞，将上述乘以加入至6孔板的每个孔的病毒的体积(2ml)并除以在感染当天的细胞计数(如2.4×10⁵)：(2.27×10⁷×2)/2.4×10⁵＝189pfu/细胞。

蛋白质印迹

用5pfu/细胞感染A549细胞或H1299，在感染后48h使用RIPA缓冲液提取总蛋白质。使用Bradford试剂确定蛋白质浓度。将20μg来自每个样品的总蛋白质上样至10％的PAGE凝胶。通过湿法印迹(wet blotting)将蛋白质转移至PVDF(BioRad)膜。使用3％的BSA TBS溶液将膜封闭1h。使用的第一抗体为：Ad衣壳蛋白(AbCam-6982)、E1B-55k(2A6,Sarnow,Sullivan Levine 1982,1:500的稀释度)、E1A(Santa cruz,M73)、肌动蛋白(Santa Cruz,I-19)和p53(Cell Signalling,#9282)。将所有抗体如所建议的在1.5％BSA TBS中稀释。将膜与第一抗体在4℃孵育15-24小时，随后用1倍TBS 3％吐温-20对其进行三次10min的洗涤。针对各个第一抗体的HRP偶联的第二抗体在1.5％的BSA TBS中以1:5000稀释并应用于膜保持1h。在除去抗体稀释后，用1倍TBS 3％吐温-20对膜进行三次10min的洗涤。将每个膜暴露于ECL Plus(GE,RPN2132)1min。在已经包覆于塑料箔后，将膜连同Hyperfilm(GE)一起放在Hypercassette中，并在选定的时间间隔处对膜进行显色。可选地，使用标记有来自LI-COR的IRDyes的第二抗体。使用Odyssey Imager进行分析。

RT-PCR

用5pfu/细胞的各个病毒感染A549细胞，在感染后48h使用Trizol(Invitrogen)提取总RNA。将RNA用DNAse(NEB,DNase I)处理、苯酚/氯仿处理以及乙醇沉淀。根据制造商的建议，使用1μg总RNA来合成cDNA(Invitrogen,III)。cDNA用作PCR(NEB TaqDNA聚合酶)反应的模板，具有常见的正义寡核苷酸(55kSense,SEQ IDNO:29-gcctgctactgttgtcttccg)以及以下反义核苷酸的任一者：93Ras，SEQ ID NO:30-cacccccctcctgtacaac；156Ras，SEQ ID NO:31–gacatgctctcgggctgtacaac，或84Ras，SEQ ID NO:32caaacgagttggtgctcatg的。各个扩增子长度为约200个核苷酸。在20个循环之后终止PCR反应并将等分试样在2％琼脂糖凝胶上运行。

制备腺病毒E1B-93R剪接位点受体突变

将Ad5wt基因组(NCBI参考序列：AC_000008.1)的前5000个核苷酸进行PCR扩增(引物Ad5wt5000起始:SEQ ID NO:15-ccacctcgagttaattaaCATCATCAATAATATACCTTATTTTG；Ad5wt5000as:SEQ ID NO:16–gtgggtttaaacGGATTTGGTCAGGGAAAACATG)并进行琼脂糖凝胶纯化。将纯化的产物用限制性酶NotI和PmeI(New England Biolabs)消化并克隆入pShuttle质粒(Stratagene)，从而替换现有的左臂用于同源性重组，产生pShuttle-LA，如通过Agilent Technologies,AdEasy http://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx？PageType＝Product&SubPageType＝ProductData&PageID＝592所述。将该质粒与含有完整的Ad5wt基因组的质粒pTG3602重组，如Agilent Technologies在其使用BJ5183重组感受态细胞的AdEasy系统中所建议的。在重组之后，将BJ5183细菌在含有卡那霉素的琼脂板上涂板。挑选单克隆、生长并从大量培养物中制备DNA。筛选每个DNA制备物的正确的重组事件。用PacI(New EnglandBiolabs)进行基因组的消化。在正确的克隆已经在琼脂板上生长后，消化出基因组并根据制造商的说明书使用Transfectin TransfectionReagent(Bio-Rad)转染入HEK293细胞。在转染后四天，收获病毒裂解物[通过刮削收集细胞连同培养基并收集在15ml离心管中。将样品冷冻/解冻三次并用于感染与Hek293细胞约90％融合的T175瓶。三天后，收获细胞和培养基并冷冻/解冻三次]，然后用于感染称为CF-10(Nunc)的病毒产生工厂。这些具有大概40个T175瓶的表面积，即7000cm²，并用于生长用于大量病毒产生的大量细胞。简言之，将在1L 5％的FCS DMEM培养基中的四个融合的T175瓶的细胞转移至CF10。将25ml(1/40)含有细胞的培养基应用于新的T175作为生长对照。在T175为90％融合的当天，CF10处于相同时期。然后将一半细胞裂解物注入CF10并为了均匀分布四处移动培养基。三天后，摇振CF10以去除由于病毒感染还未开始漂浮的细胞。清除CF10，细胞旋转减慢，在PBS中洗涤并最终悬浮在50mM Tris-HCl，pH7.8中。通过氯化铯条带进行纯化。然后，纯化病毒并分析滴定度(颗粒)和活性(pfu)。所有病毒的vp:pfu单位比率(vp:pfu单位)介于10-20之间。病毒克隆中的一个克隆的测序显示其在E1B-93R剪接受体位点中具有点突变。

在Ad2、Ad4和Ad11中确认存在E1B-156R

用5pfu/细胞的各个病毒感染A549细胞。在48hpi时，提取总RNA并使用Superscript-II(Invitrogen)用随机六聚体将1μg转化为cDNA。将1μl(总共50ml)用作具有血清型特异性引物(Ad2正义，SEQ ID NO:33-ctcgaggaattcgccaccatggagcgaagaaacccatc；Ad2反义，SEQ ID NO.34-cacttctagatcaatctgtatcttcatcgctag；Ad4正义，SEQ ID NO.35-ggagatttggacggtcttgg；Ad4反义，SEQ ID NO.36-ggatcccatcacattttgacg；Ad11正义，SEQ ID NO.37-catccatggaggtttgggc；Ad11反义，SEQ ID NO.38-ccttaaaagaagcgtttccac)的PCR中的模板。图14显示示出cDNA带的DNA凝胶并突显对应于E1B-156R cDNA的带。将凝胶上的所带纯化(NucleoSpin Gel and PCR Clean-up,Macherey-Nagel)并克隆入Topo-II PCR Blunt Vector(Invitrogen)。将克隆送去测序。使用EcoRI和XbaI将Ad2-156R和Ad5-156R克隆入p3xFlag-CMV-14载体。

测试E1B-156R蛋白质是否增强溶瘤指数

使用如上文讨论的对各个E1B-55k特异的起始和终止引物对来自Ad2和Ad5的E1B-156R的cDNA进行PCR扩增。引物包括在起始引物中的EcoRI以及在终止引物中的XbaI位点。用两种酶消化PCR片段并连接到p3xFlag-CMV-14(Sigma-Aldrich)中。测序正确插入物的构建体。

用2μg Ad2-156R或Ad5-156R表达质粒(或对照质粒)转染并用Ad5wt、ONYX-015或Ad2wt共感染癌细胞(Hela和H460)以及正常细胞(NHBE)。根据制造商的说明书使用JetPRIME试剂(POLYPlus)进行转染。用病毒的感染如上文讨论进行。简言之，将6孔板中的每个孔用2μl JetPRIME试剂以及200μl转染缓冲液转染。将对照孔用2μg插入质粒以pUC19的形式转染。

在感染后的各种时间点处使用上文描述的测定测量病毒复制。数据显示在图11A、B和C中。溶瘤指数如图12中显示的计算。

结果

丧失E1B-55k蛋白质

来自感染Ad5wt、Onyx-015、Ixovex和Ixo-ctrl的A549细胞的总蛋白质裂解物显示，在48hpi时，所有病毒表达晚期蛋白质(图3，上图)，即已经到达腺病毒复制的晚期。Ixovex和Onyx-015病毒表达的晚期蛋白质比Ad5wt和Ixo-ctrl表达的晚期蛋白质少，这反映图6中所见的A549细胞的复制效率降低。Ixovex单核苷酸点突变(SNP，基因组位置3216)诱导其非稳定化，所述单核苷酸点突变将在E1B-55k蛋白质的位置400处的氨基酸从精氨酸改变为甘氨酸(图3，中图)。与Ad5wt相比，在Ixo-ctrl中E1B-55k量的减少反映Ixo-ctrl在A549细胞中的复制效率略微降低(图6，A549图)。

E1B剪接受体使用的动力学

通过将推测的剪接受体序列从CAG:GA改变为CGG:GA，SNP也抑制E1B-93R剪接受体的使用(图4，第二图)。有趣地，作为抑制93R剪接位点的继发效应，存在使用E1B-156R剪接受体的补偿开关(图4，中图)。在不存在E1B-93R剪接受体突变(即Ixo-ctrl)的情况下，93R剪接位点的相对使用恢复(图4，下图)，如与Ad5wt病毒相比(图4，上图)。在本实验中不可使用Onyx-015，因为该病毒缺失整个E1B-55k基因区。

Ixovex不能诱导p53的降解

蛋白质印迹分析显示Ixovex中的SNP抑制病毒诱导p53的降解(图5)。在不存在E1B-93R剪接受体突变(即Ixo-ctrl)的情况下，病毒抑制p53的能力恢复。有趣地，在感染Onyx-015的细胞中存在p53的高得多的表达。

癌细胞中的复制效率

使用Ad5wt、Onyx-015、Ixovex和Ixo-ctrl病毒在A549、HeLa、H460、H1299和FaDu细胞中进行复制测定。所有病毒的复制效率低于FaDu细胞的检测极限。在A549和HeLa细胞中，所有病毒显示比Ad5wt病毒低高达两个数量级的复制效率(图6，上图)。在H460和H1299细胞中未看到复制减弱或很不明显(图6，下图)。与Onyx-015相比，在多于两种允许癌细胞系中，产生100至1000倍的Ixovex病毒。

在癌细胞中的细胞毒性

图7显示Onyx-015和Ixovex病毒相对于Ad5wt病毒在癌细胞中的细胞毒性。与Onyx-015相比，Ixovex在所有测试的细胞中为更高效的(除H460细胞之外，Onyx-015在H460细胞中的毒性高至2.5倍)。Ixovex病毒在A549、HeLa和H1299癌细胞系的细胞毒性与Ad5wt病毒在A549、HeLa和H1299癌细胞系的细胞毒性相似(或高得多)。

在正常细胞中的毒性概况

在NHBE细胞(正常的人支气管上皮细胞)中测量Ad5wt、Onyx-015、Ixovex和Ixo-ctrl病毒的细胞毒性。如图9中所见的，与癌细胞相比，在正常细胞中Ad5wt、Onyx-015和Ixo-ctrl病毒为相对有毒的。然而，Ixovex病毒的EC₅₀值显示为23pfu/细胞，其高于其在A549、HeLa和H1299癌细胞系中的EC₅₀。Ad5wt和Ixo-ctrl病毒的EC₅₀值分别为0.042和0.031pfu/细胞，而Onyx-015具有0.63pfu/细胞。因此，Ad5wt对正常细胞的毒性为Ixovex的500倍，Ixo-ctrl对正常细胞的毒性为Ixovex的700倍，而Onyx-015对正常细胞的毒性为Ixovex的35倍。

NHBE细胞中的复制效率

在48hpi时，与Ixovex病毒相比，在Ixo-ctrl和Onyx-015中的病毒活性高至30倍以及在Ad5wt中的病毒活性高至500倍(图8)。这些差异在72hpi时甚至更明显，其中在Ixo-ctrl和Onyx-015中的病毒活性高至50倍以及在Ad5wt中的病毒活性高至大于2000倍。事实上，这些差异可以甚至更明显，因为Ixovex复制在所有时间点难以达到检测极限。

Ixovex过表达E1B-156R蛋白质

通过蛋白质印迹分析由Ad5wt和Ixovex感染的H1299细胞表达的E1B-156R、腺病毒衣壳蛋白和E1A的蛋白质水平。图10显示Ixovex表达除了E1B-156R蛋白质以外相似量的所有病毒蛋白质，与Ad5wt相比，所述E1B-156R蛋白质的水平增加到多于20倍。

E1B-156R蛋白质增强溶瘤指数

我们假设如果E1B-156R蛋白质造成溶瘤作用，则加入E1B-156R反式蛋白质将增强对Ad5wt的溶瘤指数(OI)。使用Hela和NHBE细胞转染表达Ad5-156R的质粒以及与Ad5wt共感染使OI增加至4倍(图11A和图12)。当在选择性癌细胞系，H460(大细胞肺癌)中进行相同实验时，也观察到溶瘤指数的增加。将Ad5-156R加入至Ad5wt感染的细胞也具有增强病毒复制的效果(图11A)。将Ad5-156R转染入共感染有ONYX-015病毒的细胞，所述ONYX-015病毒完全缺乏E1B-156R基因。在48hpi时间点时，Ad-156R的加入使ONYX-015的OI增加至大于5倍(图11B和图12)。相似地，向Ad2-感染的细胞加入Ad5-156R使OI增加至15倍。相比之下，来自相同亚科的腺病毒血清型在蛋白质序列中具有非常小的差异(图13)。与Ad5最近的腺病毒家族成员为Ad2。将Ad2-156R加入至Ad5wt-感染的细胞使OI增加至几乎3倍。

讨论

早期发现由腺病毒E1B基因区表达的RNA具有复杂的剪接模式。全长2.28kb长的RNA为携带两个重叠的阅读框的多顺反子。早期弱的或强的下游翻译起始位点的替换使用分别产生E1B-19k和E1B-55k(Perricaudet,Akusjarvi等人，1979；Bos,Polder等人1981)。在55k ORF早期常见的剪接供体被用于剪接三种选择性剪接受体，93R SA、156RSA和84R SA(Anderson,Schmitt等人1984；Virtanen和Pettersson 1985；Anderson,Maude等人1987)。93R AS从55k ORF的框剪出，加入15个氨基酸的C端。156R AS在含有E1B-55k的框中剪接，除去340个中间氨基酸。84R SA为将6个氨基酸加入至常见N端的下游位点。

当基于野生型腺病毒血清型5株系pTG3602制备一大组基因修饰的病毒时，一个病毒克隆在E1B-55k基因区的单核苷酸位置(SNP)突变。在E1B-93R的剪接受体序列内部产生突变，或更精确地，其将推测位点从cag/ga改变至cGg/ga。突变不仅改变剪接位点，而且它还将E1B-55k氨基酸400从精氨酸改变至甘氨酸。该病毒已经被命名为Ixovex。我们已经表征该病毒的溶瘤潜能的特性，意指保留在癌细胞中的复制能力和细胞毒性同时在正常细胞中在两个方面均受抑制时。

我们的结果显示突变导致感染的细胞中缺乏表达的E1B-55k蛋白质(图3)。我们相信这是因为氨基酸变化使E1B-55k蛋白质不稳定。其他人已经把氨基酸变化引入E1B-55k，且这些中的若干使得蛋白质水平不稳定。此外，我们的突变改变E1B-55k剪接受体位点93R中重要的核苷酸，这使对该特定剪接位点的剪接无效(图4)。为了补偿，剪接似乎再定向E1B-156R剪接受体。因为感染中缺乏E1B-55k，Ixovex抑制p53表达的能力严重降低(图5)。与Onyx-015相比由Ixovex诱导的p53的水平降低可能是因为Ixovex在A549细胞中略微降低的复制效率，即细胞受影响较少，因此表达的p53较少。可选地，并且我们相信，对156R剪接受体增加的剪接(图4)也可增加E1B-156R蛋白质的表达。156R剪接在E1B-55k的C-(羧基)端部分的框内剪接。这除去中间的340个氨基酸，留下C端的78个氨基酸与N-(氨基)-端的79个氨基酸融合。Dobner实验室已经显示(Sieber和Dobner2007)E1B-156R蛋白质通过其C端保留抑制p53的一些能力。E1B-156R保留E1B-55k蛋白质的其它功能也是可能的。E1B-55k和E1B-156R蛋白质与许多相似因素相互作用(Sieber和Dobner 2007；Schreiner,Wimmer等人，2010；Schreiner,Wimmer等人，2011；Wimmer,Blanchette等人，2012)。E1B-55k已经被指定除介导p53的降解之外的若干功能。其也与调控晚期病毒RNA的选择性核输出(Dobner和Kzhyshkowska 2001；Flint和Gonzalez 2003)以及抑制细胞RNA的翻译同时促进病毒RNA翻译(Blackford和Grand 2009)有关。当蛋白质与另一病毒蛋白质E4orf6复合时，介导E1B-55k的主要功能。有趣地，已经示出E1B-156R蛋白质与E4orf6蛋白质相互作用(Sieber和Dobner2007)。E1B-156R可补偿这些功能的一些，这符合Ixovex的E1B-156R表达的增加。

在正常细胞中，每个病毒的毒性主要地反映各自的复制能力。正常细胞中毒性的缺乏以及复制的几乎完全关闭指示Ixovex的惊人的安全概况。Onyx-015病毒在正常细胞中复制的比Ixovex在正常细胞中复制更好引发考虑：删除Onyx-015病毒携带除去表达E1B-55k、-93R和-156R蛋白质的所有可能性(Barker和Berk 1987)。这指示与其它病毒相比，E1B区的表达失衡对减弱正常细胞中的Ixovex具有广泛影响。有趣地，在正常细胞中一方面Onyx-015和Ixo-ctrl与另一方面Ixovex的复制差异在癌细胞中未看到。这指示正常细胞中的Ixovex感染已经变得非允许的，即在感染早期可能存在主要的阻断以给予细胞清除病毒的时间，而癌细胞的转化状态补偿一些E1B-55k功能的缺乏。

癌细胞中失衡的E1B表达的效果根据癌细胞系的不同而不同。在两种高度复制-允许的细胞系H1299和H460中的Ixovex的细胞毒性为低的，而在复制减弱的细胞系A549和HeLa中的细胞毒性为高的。这种情况的原因可能是因为毒性，细胞在产生高数目的病毒之前死亡。

腺病毒家族被分为7个属，命名为A-G，其中总计超过65个不同的血清型。血清型5(Ad5)属于C属。我们认为在Ad5中看到的剪接模式在所有腺病毒血清型中为保守的以及通过剪接位点突变引起对Ad5非常有利的肿瘤选择性的失衡将在大部分(如果不是全部的话)其它血清型中反映。我们的初步实验显示在来自各个不同属的代表性病毒(A-Ad12、B1-Ad3、B2-Ad11、C-Ad5、D-Ad37、E-Ad4和F-Ad40)中相似的剪接模式。

Ad5wt病毒比所有其它病毒的总体较高功效可能是由于野生型株系pTG3602(Oberg，Yanover等，2010)，用作Ixovex和Ixo-ctrl的基因组主链。该主链携带分散在整个基因组中的一些点突变。我们的Ixo-ctrl病毒实际上本质为pTG3602。Ixovex中的SNP回复至野生型状态，产生Ixo-ctrl病毒。在其中pTG3602已经被用作恒量的许多实验中，已经看到如与Ad5wt相比较低的功效。

与相似方法的专利腺病毒载体相比，Ixovex的另外的优势为Onyx-015(Heise,Sampson-Johannes等人，1997)、-051和-053(Shen,Kitzes等人，2001)均丢失病毒的E3B基因区。该区初始被缺失以增强Onyx-015的安全概况。后来发现该区的消除使得载体过早地通过免疫防御从肿瘤清除(Wang,Hallden等人，2003)。

通过对H1299细胞中感染的蛋白质印迹分析，显示Ixovex以与Ad5wt相同的水平复制并表达病毒蛋白质。当使用对E1B-55k的N-端区特异的抗体(小鼠-m2A6)时看到病毒之间的唯一差异，E1B-55k蛋白质的E1B-156R剪接形式大幅增加(图10)。我们决定进行许多互补实验以证实E1B-156R的增加是否确实可造成溶瘤指数(OI)的增加。在图11A、B和C以及图12中，我们显示5型腺病毒E1B-156R为亚科C组中OI的有效增强子。来自Ad2wt的E1B-156R等效物也显示对Ad5wt的OI具有积极效果。有趣地，将Ad5-156R加入至Ad5wt感染的H460细胞增加病毒的复制，这与在H460细胞中Ixovex的较高的复制水平相一致(与ONYX-015病毒(缺乏E1B-156R基因)相比)(参见图6)。

重要的是要注意，这些实验，其中E1B-156R被补充到病毒感染的细胞中，不完全地类似用Ixovex或表达E1B-156R的另一工程化病毒的感染。例如，在用Ixovex病毒感染期间，当病毒复制时，Ad5-156R水平增加，即表达模板(病毒DNA)的量增加。相比之下，在互补实验中，E1B-156R以恒定的模板水平提供，即因为在感染早期期间细胞继续分裂，所以携带E1B-156R基因的质粒得到稀释。因此，当病毒开始复制时，E1B-156R表达将不会呈指数增加(病毒拷贝将为此类情况)。然而，这些实验清楚地显示E1B-156R的加入具有增加溶瘤指数的效果并且表明E1B-156R造成该效果。

参考文献

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Claims

1.重组腺病毒，其中E1B-156R同工型的比例相对于野生型水平有所增加，其中所述腺病毒在癌细胞中具有溶瘤作用。

2.根据权利要求1所述的重组腺病毒，其携带突变使得所述E1B-156R同工型的比例相对于野生型水平有所增加。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的重组腺病毒，其中所述突变在所述腺病毒的E1B基因的序列内。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的重组腺病毒，其中所述E1B基因在一个或多个剪接识别区为突变的，所述剪接识别区包含：

a)剪接供体位点1(SD1)，其在Ad5基因组的位置2251-2255(在Ad5基因组登录号AC_000008.1(SEQ ID NO:41)的位置2256-2260以及所述E1B基因(SEQ ID NO:1)的位置543-547)处具有序列GTGGC；

b)E1B-93R剪接受体(SA1)，其在所述Ad5基因组的位置3218-3222(Ad5基因组登录号AC_000008.1(SEQ ID NO:41)的位置3213-3217以及所述E1B基因(SEQ ID NO:1)的位置1500-1504)处具有序列AACAG；

c)E1B-156R剪接受体(SA2)，其在所述Ad5基因组的位置3276-3280(Ad5基因组登录号AC_000008.1(SEQ ID NO:41)的位置3271-3275以及所述E1B基因(SEQ ID NO:1)的位置1558-1562)处具有序列TTGAG；

d)E1B-84R剪接受体(SA3)，其在所述Ad5基因组的位置3595-3599(Ad5基因组登录号AC_000008.1(SEQ ID NO:41)的位置3590-3594以及所述E1B基因(SEQ ID NO:1)的位置1877-1881)处具有序列TGCAG；和/或

e)剪接供体位点2(SD2)，其在所述Ad5基因组的位置3506-3510(Ad5基因组登录号AC_000008.1(SEQ ID NO:41)的位置3511-3515)以及所述E1B基因(SEQ ID NO:1)的位置1798-1802)处具有序列GTACT。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的重组腺病毒，其中所述E1B基因剪接识别区在一个或多个下述位置为突变的：

a)所述腺病毒Ad5基因组(登录号AC_000008.1)(SEQ ID NO:41)的核苷酸3216(所述E1B基因(SEQ ID NO:1)的位置1503)；

b)所述腺病毒Ad5基因组(登录号AC_000008.1)(SEQ ID NO:41)的核苷酸3218(所述E1B基因(SEQ ID NO:1)的位置1505)；和/或

c)所述腺病毒Ad5基因组(登录号AC_000008.1)(SEQ ID NO:41)的核苷酸3221(所述E1B基因(SEQ ID NO:1)的位置1508)。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的重组腺病毒，其中所述突变：

a)通过改变所述E1B基因的多核苷酸和多肽序列除去剪接位点；或

b)通过改变所述E1B基因的多核苷酸序列并且保留所述原始的多肽序列除去剪接位点。

7.根据前述任一项权利要求所述的重组腺病毒，其中所述E1B基因含有一个或多个下述突变：

a)所述腺病毒Ad5基因组(登录号AC_000008.1)(SEQ ID NO:41)的A3216G(所述E1B基因(SEQ ID NO:1)的位置1503)；

b)所述腺病毒Ad5基因组(登录号AC_000008.1)(SEQ ID NO:41)的G3218A(所述E1B基因(SEQ ID NO:1)的位置1505)；和/或

c)所述腺病毒Ad5基因组(登录号AC_000008.1)(SEQ ID NO:41)的G3221A(所述E1B基因(SEQ ID NO:1)的位置1508)。

8.根据前述任一项权利要求所述的重组腺病毒，其中所述腺病毒为腺病毒血清型Ad5。

9.根据前述任一项权利要求所述的重组腺病毒，其中所述腺病毒为腺病毒血清型Ad5株系pTG3602。

10.根据前述任一项权利要求所述的重组腺病毒，其中所述E1B基因具有SEQ ID NO:1的多核苷酸序列。

11.根据前述任一项权利要求所述的重组腺病毒，其中所述E1B-156R同工型的比例相对于E1B-496R同工型有所增加。

12.根据前述任一项权利要求所述的重组腺病毒，其中E1B-496R同工型的比例相对于野生型水平有所降低。

13.根据前述任一项权利要求所述的重组腺病毒，其中所述E1B-156R同工型的比例相对于所述E1B-93R同工型有所增加。

14.根据前述任一项权利要求所述的重组腺病毒，其中所述E1B-156R同工型的比例相对于所述E1B-84R同工型有所增加。

15.根据前述任一项权利要求所述的重组腺病毒，其中所述E1B-156R同工型的比例增加到至少2倍、4倍、10倍、100倍、1,000倍或10,000倍。

16.根据前述任一项权利要求所述的重组腺病毒，其中所述E1B-496R同工型的比例降低至少2倍、4倍、10倍、100倍、1,000倍或10,000倍。

17.根据前述任一项权利要求所述的重组腺病毒，其中所述E1B-156R、E1B-496R、E1B-93R或E1B-84R同工型的比例是指：

a)表达的所述同工型蛋白质的水平；和/或

b)转录的所述同工型mRNA的水平。

18.根据前述任一项权利要求所述的重组腺病毒，其中所述E1B-156R同工型具有与SEQ ID NO:2具有至少80％的序列同一性的多核苷酸序列。

19.根据前述任一项权利要求所述的重组腺病毒，其中所述E1B-156R同工型具有与SEQ ID NO:3具有至少80％的序列同一性的多肽序列。

20.根据前述任一项权利要求所述的重组腺病毒，其中所述E1B-496R同工型具有与SEQ ID NO:4具有至少80％的序列同一性的多核苷酸序列。

21.根据前述任一项权利要求所述的重组腺病毒，其中所述E1B-496R同工型具有与SEQ ID NO:5具有至少80％的序列同一性的多肽序列。

22.根据前述任一项权利要求所述的重组腺病毒，其中所述E1B-93R同工型具有与SEQ ID NO:6具有至少80％的序列同一性的多核苷酸序列。

23.根据前述任一项权利要求所述的重组腺病毒，其中所述E1B-93R同工型具有与SEQ ID NO:7具有至少80％的序列同一性的多肽序列。

24.根据前述任一项权利要求所述的重组腺病毒，其中所述E1B-84R同工型具有与SEQ ID NO:8具有至少80％的序列同一性的多核苷酸序列。

25.根据前述任一项权利要求所述的重组腺病毒，其中所述E1B-84R同工型具有与SEQ ID NO:9具有至少80％的序列同一性的多肽序列。

26.根据前述任一项权利要求所述的重组腺病毒，其中所述癌细胞为基本上缺乏p53功能的瘤细胞。

27.根据前述任一项权利要求所述的重组腺病毒，其中所述溶瘤作用包括：

a)细胞的病毒感染；

b)病毒基因组在(p53缺陷的)癌细胞中选择性复制，从而在(p53缺陷的)癌细胞中导致优先的病毒-介导的细胞裂解，并释放病毒颗粒用于另外的感染事件。

28.编码前述任一项权利要求所述的重组腺病毒的多核苷酸，其任选地为适合于宿主细胞中腺病毒产生的载体。

29.宿主细胞，其包括编码前述任一项权利要求所述的重组腺病毒的多核苷酸。

30.在需要治疗的患者中治疗特征为基本上缺乏p53功能的瘤细胞的癌症的方法，所述方法包括：

a)给予一剂前述任一项权利要求所述的重组腺病毒；

b)使所述重组腺病毒感染所述癌症的瘤细胞充足的时间；以及

c)任选地给予其它剂量的所述重组腺病毒。

31.组合物，其包含前述任一项权利要求所述的重组腺病毒作为治疗剂。

32.组合物，其包含用于治疗患有癌症的患者的前述任一项权利要求所述的重组腺病毒，所述癌症的特征为基本上缺乏p53功能的瘤细胞。

33.使腺病毒溶瘤的方法，其通过修饰E1B基因的序列以相对于等效的野生型腺病毒的水平增加E1B-156R同工型的水平。