CN104840468A - 齐墩果酸在制备治疗肥胖症药物中的应用 - Google Patents

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CN104840468A CN201510144338.9A CN201510144338A CN104840468A CN 104840468 A CN104840468 A CN 104840468A CN 201510144338 A CN201510144338 A CN 201510144338A CN 104840468 A CN104840468 A CN 104840468A
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陈小松
傅湘辉
郭志辉
李铭
闫柳
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Union Medical College Hospital of Fujian Medical University
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Abstract

本发明公开一种齐墩果酸在制备治疗肥胖症药物中的应用。本发明的特点和优点为：本发明所述的齐墩果酸能在体外激活TGR5，从而控制小鼠体重及降低高血糖，TGR5因能够调节胆汁酸稳态及能量代谢为大家所知。实验表明：TGR5作为天然化合物齐墩果酸（OA）的主要受体（而非唯一受体）对抗肥胖及降低血糖的作用。1）齐墩果酸（OA）能够减少野生型小鼠体脂的聚积，但这种作用在TGR5小鼠身上不能得以体现。这些结果明确指出TGR5能够调节OA诱导的减肥效应。2）齐墩果酸（OA）对TGR5也有些微功效，这归因于OA对FXR或其他蛋白质有着轻微的激活作用。

Description

齐墩果酸在制备治疗肥胖症药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药领域，具体地说，是涉及一种齐墩果酸在制备治疗肥胖症药物中的应用。
背景技术
最新研究将胆汁酸信号分子作为治疗代谢紊乱的新靶标加以强调，包括肥胖与2型糖尿病的治疗。现已确定两种主要的胆汁酸信号调节分子：FXR与GPBAR-1/TGR5。FXR是转录因子，能直接调节基因表达。相反，TGR5为胆汁酸膜受体，能启动下游信号通路从而间接影响基因表达。TGR5在不同组织中表达广泛而又不尽相同。疏水性胆汁酸，如LCA和DCA，是TGR5强效内源性激动剂。从功能上讲，TGR5能够调节胆汁酸代谢、糖代谢、褐色脂肪组织能量代谢及炎症。近来，TGR5在调节肥胖及糖尿病中的作用备受关注，但机制尚不清楚。
肥胖及其合并症——糖尿病，因缺乏有效治疗而达到惊人的流行程度，寻找新的医学治疗措施迫在眉睫。近来，miRNAs作为人类疾病潜在的治疗新靶标得到了大量的关注，包括治疗肥胖与糖尿病。其中，miR-26a在众多生物效应中发挥多种功能，包括调节代谢。最近，我们发现miR-26a能够阻止肥胖诱导的胰岛素抵抗及肝脏过多合成脂质，表明miR-26a可作为提高胰岛素敏感性及抑制脂质、糖合成的潜在新靶标。然而，miR-26a表达的调节仍不清楚，发展增加miR-26a表达的技术仍有挑战。而齐墩果酸（OA）是从橄榄叶中提取的三萜类化合物，其是否能在体外激活TGR5，从而控制小鼠体重及降低高血糖，是本发明下述研究的目的。
发明内容
本发明的目的在于提供齐墩果酸在制备治疗肥胖症药物中的应用。
本发明所述的齐墩果酸（OA）是从橄榄叶中提取的三萜类化合物，能在体外激活TGR5，从而控制小鼠体重及降低高血糖，能在制备治疗肥胖症药物中的应用。
本发明的特点和优点为：GPBAR1/TGR5是胆汁酸膜G蛋白偶联受体。TGR5因能够调节胆汁酸稳态及能量代谢为大家所知。最新研究特别强调了TGR5在减肥及调节糖代谢中的作用，但是，这两种作用机制尚不明了。这里我们将探讨天然化合物齐墩果酸（OA）治疗肥胖及降低血糖过程中TGR5的必要性。通过对比齐墩果酸（OA）治疗后野生型小鼠与TGR5-/-小鼠肝脏miRNAs谱的表达，我们认为miR-26a为TGR5激活的新型下游靶基因。胆汁酸喂养小鼠诱导miR-26a的表达依赖TGR5而非FXR。TGR5的激活能大大增加巨噬细胞及Kupffer细胞中miR-26a的表达。此外，我们认为TGR5激活诱导miR-26a的表达需要通过JNK信号通路。值得注意的是，我们还把TGR5反应的DNA元件定位在miR-26a前体的近侧端，此处与宿主基因的转录无关。这些结果将首次阐述TGR5调节miR-26a表达的新机制，同时将胆汁酸信号调节代谢作用与miRNAs调节通路联系起来。实验表明：TGR5作为天然化合物齐墩果酸（OA）的主要受体（而非唯一受体）对抗肥胖及降低血糖的作用。1）齐墩果酸（OA）能够减少野生型小鼠体脂的聚积，但这种作用在TGR5-/-小鼠身上不能得以体现。这些结果明确指出TGR5能够调节OA诱导的减肥效应。2）齐墩果酸（OA） 对TGR5-/-也有些微功效，这归因于OA对FXR或其他蛋白质有着轻微的激活作用。经过OA治疗，可显著提高野生组小鼠、而非TGR5-/-的糖耐量，表明OA提高糖耐具有TGR5依赖性。
附图说明
图1-A为野生型小鼠各组每周体重变化图，以说明TGR5介导OA对肥胖的抑制效应。
图1-B为TGR5-/-小鼠各组每周体重变化图，以说明TGR5介导OA对肥胖的抑制效应。
图1-C为喂养第16周时各组平均体重比较图，与普通饮食组比较，﹡P＜0.05，，以说明TGR5介导OA对肥胖的抑制效应。
图2-A为野生型小鼠各组GTT结果图，以说明TGR5介导OA提高糖耐受效。
图2-B为TGR5-/-小鼠各组GT结果图，以说明TGR5介导OA提高糖耐受。
图3-A为野生型与TGR5KO小鼠肝脏miR-26a表达水平图，以说明TGR5对小鼠肝脏表达miR-26a的激活效应。
图3-B为野生型与TGR5KO小鼠肝脏miR-16表达水平图，以说明TGR5对小鼠肝脏表达miR-26a的激活效应。
图3-C为野生型小鼠各组肝脏表达miR-26a相对水平图，以说明TGR5对小鼠肝脏表达miR-26a的激活效应。
图3-D为野生型与TGR5-/-小鼠肝脏表达miR-26a相对水图，以说明TGR5对小鼠肝脏表达miR-26a的激活效应。
图4-A为Kupffer细胞中4种miRNA表达的倍数变化图，与CON组比较，﹡P＜0.05 ，以说明TGR5激活对巨噬细胞表达miR-26a的诱导效应。
图4-B为10uMOA作用于骨髓巨噬细胞后miR-26表达结果图；与CON组比较，﹡P＜0.05，以说明TGR5激活对巨噬细胞表达miR-26a的诱导效应。
图4-C为不同剂量OA作用于RAW264.7细胞后miR-26a表达结果图，与DMSO组比较，﹡P＜0.05，以说明TGR5激活对巨噬细胞表达miR-26a的诱导效应。
图4-D为OA作用不同时间RAW264.7细胞miR-26a表达结果图，以说明TGR5激活对巨噬细胞表达miR-26a的诱导效应。
图5-A为OA作用不同时间及是否加H89对RAW264.7表达miR-26a的影响图，以说明JNK信号通路参与TGR5介导的miR-26a表达诱导效应。
图5-B为RAW264.7细胞中不同抑制剂对OA诱导miR-26a表达的影响图；与BMS、PD组比较，﹡P＜0.05，以说明JNK信号通路参与TGR5介导的miR-26a表达诱导效应。
图5-C为Kupffer细胞中不同抑制剂对OA诱导miR-26a表达的影响图；与BMS、PD组比较，﹡P＜0.05，以说明JNK信号通路参与TGR5介导的miR-26a表达诱导效应。
图5-D为骨髓巨噬细胞中不同抑制剂对OA诱导miR-26a表达的影响图，与DMSO、对照组比较，﹡P＜0.05，以说明JNK信号通路参与TGR5介导的miR-26a表达诱导效应。
图5-E为Kupffer细胞中JNK对OA诱导miR-26a表达的影响图，与JNK-/-比较，﹡P＜0.05，以说明JNK信号通路参与TGR5介导的miR-26a表达诱导效应。
图6-A为RAW 264.7细胞中OA作用不同时间对前体miR-26a表达的影响图，以说明OA反应元件位于miR-26a启动子近侧端。
图6-B为RAW 264.7细胞中OA作用对宿主基因miR-26a表达的影响图，以说明OA反应元件位于miR-26a启动子近侧端。
图6-C为miR-26a不同调控区域PGL-3荧光素酶载体转染OA作用后，RAW264.7细胞中相对荧光素酶活性的鉴定图，以说明OA反应元件位于miR-26a启动子近侧端。
图6-D为以PGL3荧光素酶为载体克隆miR-26a-2上游调控区图，以说明OA反应元件位于miR-26a启动子近侧端。
图6-E为不同载体转染OA作用后RAW264.7细胞中相对荧光素酶活性的鉴定图，以说明OA反应元件位于miR-26a启动子近侧端。
具体实施方式
本发明将讨论TGR5作为天然化合物OA的主要受体（而非唯一受体）对抗肥胖及降低血糖的作用。TGR5可通过JNK依赖信号通路增加巨噬细胞中miR-26a的表达，而FXR不可以。TGR5与miR-26a的这种新的联系能够增强OA对代谢的影响。
本说明书中的主要英文缩写与中文名词对照：BA，胆汁酸；CA，胆酸；DCA，脱氧胆酸；OA，齐墩果酸；HFD，高脂饮食；GP-BAR1，G蛋白胆汁酸活化受体；FXR，法尼酯受体；T2D，2型糖尿病；JNK，c-jun氨基末端激酶；MAPK，丝裂原活化蛋白激酶；ERK1/2，细胞外调节蛋白激酶。
材料与方法
动物喂养与处理
C57BL/6与JNK1基因敲除小鼠，购于Jackson Laboratory。TGR5-/-小鼠由Merck的Dr. Vassileva Galya友情提供。小鼠于SPF环境饲养，12h光照/12h黑暗交替，自由饮食及饮水。所有程序遵照NIH实验动物管理规定。动物实验得到了希望城动物实验管理小组（IACUC）的许可。HFD与OA喂养对照实验，取8-12周龄高脂喂养小鼠或控制饮食8周，每组5只。之后改以HFD+OA继续喂养8周。CA喂养实验，取8-10周1％CA饲养小鼠或控制饮食3天。所有实验动物均得到人文关怀，以及所有实验方案均符合相关规定。
组织学观察
肝组织以10％福尔马林固定，而后脱水、浸蜡、苏木精-伊红染色进行标准组织学学观察。
 Kupffer细胞及腹腔巨噬细胞的分离与培养
取4-5月龄C57BL/6小鼠，采用胶原酶灌注和两步细胞分离液梯度离心法分离Kupffer细胞。肝细胞取材于8周龄C57BL/6小鼠，采用之前所述的胶原酶灌注法。驻留型巨噬细胞通过磷酸盐缓冲液冲洗8周龄C57BL/6小鼠腹腔获得。这3中细胞均于DMEM+10％FBS+1％双抗培养液中培养48小时。
代谢评估
血糖水平可通过便携式血糖仪测得。小鼠禁食16小时后腹腔注射D-葡萄糖（2g/kg体重）或丙酮酸盐（2g/kg体重）进行GTT实验。分别于注射前，注射后15min、30min、60min、90min及120min测量血糖值。
 RT-PCR
根据产品说明书用TRI试剂提取总RNAs。通过SuperScript第一链合成系统用2μg合成cDNA，通过Applied Biosystem 7300 RT-PCR系统对mRNA进行定量。基因分析后对miR-26a的初步定位见于图1。利用Applied Biosystem软件绘制标准曲线对每一个检测基因及内部控制基因M36b4进行定量。
转染
瞬时转染于96孔板中进行。简言之，根据产品说明书，通过脂质体转染法LTX试剂利用质粒PGL3-TK-26a-Luc转染RAW264.7细胞。为了标准化转染效能，细胞与PGL3-TK质粒共同转染。细胞需经DMSO或OA（10μM）处理24小时。荧光素酶活性可根据产品说明书通过双荧光素酶报告基因检测系统加以评估。每次转染至少重复进行3次。
 Western blotting
用10％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离蛋白并转印至NC膜上。用5％脱脂牛奶封闭2小时后，在转印膜上加入特异性一抗，浓度为1:1000。随后冲洗转印膜，将膜泡于过氧化物酶标记的二抗。最后利用医学胶片处理器得到免疫印迹图像。
数据分析
数据采用均值±SEM表示。无特殊说明时，通过t检验求得P值。对于组间的多重比较，采用两两比较检验Post-hoc方差分析。P值小于0.05认为有统计学意义。
结论
TGR5对于OA调节肥胖与糖耐受是必要的
OA是从橄榄叶中提取的三萜类化合物。在体外能够激活TGR5，从而控制小鼠体重及降低高血糖。首先我们需鉴定TGR5是否为OA调节高脂饮食诱导肥胖的唯一受体。取8-10周龄高脂喂养小鼠或如前所述控制饮食8周，分野生型与TGR5-/-两组，每组5只。随后改以HFD+OA继续喂养8周。喂养过程中监测小鼠体重。在野生型小鼠组，HFD喂养显著增加了动物体重。与高脂饮食组相比，OA喂养第8周时可显著减少动物体重。而在TGR5-/-组，OA的减肥作用明显受到抑制。给予OA干预，动物体重可下降至普通饮食组水平。然而，尽管OA能够显著减少高脂饮食组小鼠体重，但与普通饮食组仍存在较大差异。为了更好的阐述OA对体脂的调节功能，，我们测量了内脏脂肪，结果显示OA在高脂饮食动物体脂形成中有着相似的作用。这进一步证实OA能够减少野生型小鼠体脂的聚积，但这种作用在TGR5-/-小鼠身上不能得以体现。这些结果明确指出TGR5能够调节OA诱导的减肥效应。OA 对TGR5-/-也有些微功效，这归因于OA对FXR或其他蛋白质有着轻微的激活作用。接着，我们对比了野生组与TGR5-/-组小鼠的糖耐量。正如所料，两组小鼠经HFD喂养均引起糖耐量增高。而经过OA治疗，可显著提高野生组小鼠、而非TGR5-/-的糖耐量，表明OA提高糖耐具有TGR5依赖性。
 TGR5的激活可增加miR-26a表达
上述结果指出OA可作为TGR5的特异性配体用于减肥。因此，我们可将OA作为一种工具来筛选可被TGR5激活调节的下游肝脏miRNAs。在我们研究的这些miRNAs中，miR-26a能够被OA显著上调，但这种上调效应只存在于野生型小鼠，不存在于TGR5-/-。相比之下，miR-16a并不受OA或TGR5状态的影响。为了进一步阐述胆汁酸信号对miR-26a的调节，我们给予小鼠1％CA饮食并监测miR-26a的表达水平。结果示CA显著上调miR-26a的表达水平。相反，GW化合物对miR-26a的表达并无影响。为了排除FXR对miR-26a的调节作用，我们也对比了CA对野生型和FXR-/-小鼠的影响有无不同。结果示CA对miR-26a表达的影响并无FXR依赖性。为了阐述TGR5在体内对胆汁酸诱导的miR-26a的调节，我们以1％CA喂养野生型或TGR5-/-小鼠3天，然后测量肝脏miR-26a水平。结果示野生组小鼠肝脏miR-26a表达显著增高，而TGR5-/-组小鼠并无此效应。喂养3天后，我们没有观察到毒副作用（数据无显示）。
 TGR5的激活上调巨噬细胞中miR-26a表达
TGR5表达于鼠类巨噬细胞系RAW264.7。与空白对照组相比，用TGR5激动剂OA处理RAW264.7细胞在第6、12、24小时时可致miR-26a水平明显增高。相反，Kupffer细胞中一些其他miRNAs，包括miR-16，miR-21及miR-126，则不会受OA 的影响。同样，骨髓巨噬细胞于分离后4小时内给予OA（10μM）处理，也能观察到miR-26a表达上调。这些结果都表明TGR5的激活确实能够诱导巨噬细胞系及Kupffer细胞中miR-26a的表达，证明了TGR5在上调巨噬细胞中miR-26a表达的新功能。因此，我们用OA处理巨噬细胞系RAW264.7也能诱导miR-26a表达，跟OA治疗效果一样。相反，其他细胞系经OA处理后对miR-26a的表达没有影响。诱导动力学示3小时时出现诱导斑块。因此，我们将RAW264.7
作为进一步研究的细胞模型。
 JNK信号通路与TGR5诱导miR-26a表达下游信号相关
通过G蛋白转换信号导致cAMP产生，随后激活PKA。因此，我们提出疑问，PKA在TGR5调节促炎性细胞因子产生过程中是否是必要的。RAW264.7细胞经PKA抑制剂H89预处理后并不会抑制OA诱导miR-26a的表达，说明TGR5激活对miR-26a的诱导并不需要PKA。
JNK是丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）的一员，MAPKs可被TGR5激活。因此，我们质疑，JNK对TGR5依赖性促炎性因子的诱导是否是必要的。在RAW264.7及Kupffer细胞中经OA处理后JNK磷酸化作用迅速增强。OA刺激可增强野生型小鼠腹腔巨噬细胞中JNK氧化磷酸化水平，TGR5-/-小鼠并无此效应。这些结果提示JNK只有在TGR5激活后才会被特异性激活。我们进一步研究了抑制JNK信号通路是否会阻断TGR5依赖性促炎性细胞因子的诱导。给予JNK诱导剂SP600125(10μM)，可显著减少RAW264.7细胞中OA诱导的miR-26a转录。甚至，在CA喂养的正常小鼠肝脏中，miR-26a的诱导是增加的，而在JNK1-/-小鼠肝脏该诱导受损。这些结果表明JNK为肝脏中TGR5调节细胞因子产生的关键下游作用分子。
我们同样检测了ERK、p38 MAPK及NF-κB的抑制剂。在TGR5激活之前，对RAW264.7细胞给予NF-κB抑制剂BMS-345541、ERK抑制剂（PD）预处理，将不会阻断OA诱导的miR-26a的产生。P38抑制剂（PB）却能显著减少OA对miR-26a的诱导作用。
启动子分析确定了OA的反应DNA序列位于miR-26a近侧端
人类miR-26家族有两个成员，miR-26a和miR-26b，他们相异于三个核苷酸。在人及鼠类染色体组中，有两个基因位点与miR-26a-1和miR-26a-2相一致。miR-26a-1和miR-26a-2分别定位于CTDSPL和CTDSP2的内含子区域。为了更好的理解miR-26a对OA的反应机制，我们对比了RAW264.7细胞中OA对miR-26a-1和miR-26a-2的诱导。两者都能被OA显著诱导。然而，当我们检测宿主基因CTDSP2、CDTSP1和CTDSPL miR-26a的表达时，OA 对这些宿主基因的表达不起作用，说明miR-26a对OA的反应有自己的启动子。因此，我们克隆了miR-26a-1和miR-26a-2的启动子DNA片段，生成的荧光素酶报告基因包含它们的启动子。转染分析结果示两种启动子均能对OA有所反应。我们选择miR-26a-2启动子做进一步分析。在缺失报道分子之后，启动子最短的部分仍然保留着对OA的反应部件。这些结果表明miR-26a或许拥有自己的启动子，并且与宿主基因的调节机制不同。
结   论
TGR5对于OA调节肥胖与糖耐受是必要的
OA是从橄榄叶中提取的三萜类化合物。在体外能够激活TGR5，从而控制小鼠体重及降低高血糖。首先我们需鉴定TGR5是否为OA调节高脂饮食诱导肥胖的唯一受体。取8-10周龄高脂喂养小鼠或如前所述控制饮食8周，分野生型与TGR5-/-两组，每组5只。随后改以HFD+OA继续喂养8周。喂养过程中监测小鼠体重。在野生型小鼠组，HFD喂养显著增加了动物体重。与高脂饮食组相比，OA喂养第8周时可显著减少动物体重。而在TGR5-/-组，OA的减肥作用明显受到抑制。给予OA干预，动物体重可下降至普通饮食组水平。然而，尽管OA能够显著减少高脂饮食组小鼠体重，但与普通饮食组仍存在较大差异。为了更好的阐述OA对体脂的调节功能，，我们测量了内脏脂肪，结果显示OA在高脂饮食动物体脂形成中有着相似的作用。这进一步证实OA能够减少野生型小鼠体脂的聚积，但这种作用在TGR5-/-小鼠身上不能得以体现。这些结果明确指出TGR5能够调节OA诱导的减肥效应。OA 对TGR5-/-也有些微功效，这归因于OA对FXR或其他蛋白质有着轻微的激活作用。接着，我们对比了野生组与TGR5-/-组小鼠的糖耐量。正如所料，两组小鼠经HFD喂养均引起糖耐量增高。而经过OA治疗，可显著提高野生组小鼠、而非TGR5-/-的糖耐量，表明OA提高糖耐具有TGR5依赖性。其结果请见图1-A：野生型小鼠各组每周体重变化；图1-B：TGR5-/-小鼠各组每周体重变化；图1-C：喂养第16周时各组平均体重。与普通饮食组比较，﹡P＜0.05；上述的图1-A到图1-C，可以说明TGR5介导OA对肥胖的抑制效应。图2-A：野生型小鼠各组GTT结果，图2-B：TGR5-/-小鼠各组GT结果，上述的图2-A到图2-B，可以说明 TGR5介导OA提高糖耐受效。
 TGR5的激活可增加miR-26a表达
上述结果指出OA可作为TGR5的特异性配体用于减肥。因此，我们可将OA作为一种工具来筛选可被TGR5激活调节的下游肝脏miRNAs。在我们研究的这些miRNAs中，miR-26a能够被OA显著上调，但这种上调效应只存在于野生型小鼠，不存在于TGR5-/-小鼠。相比之下，miR-16a并不受OA或TGR5状态的影响。为了进一步阐述胆汁酸信号对miR-26a的调节，我们给予小鼠1％CA饮食并监测miR-26a的表达水平。结果示CA显著上调miR-26a的表达水平。相反，GW化合物对miR-26a的表达并无影响。为了排除FXR对miR-26a的调节作用，我们也对比了CA对野生型和FXR-/-小鼠的影响有无不同。结果示CA对miR-26a表达的影响并无FXR依赖性。为了阐述TGR5在体内对胆汁酸诱导的miR-26a的调节，我们以1％CA喂养野生型或TGR5-/-小鼠3天，然后测量肝脏miR-26a水平。结果示野生组小鼠肝脏miR-26a表达显著增高，而TGR5-/-组小鼠并无此效应。喂养3天后，我们没有观察到毒副作用（数据无显示）。实验结果见图3-A：野生型与TGR5KO小鼠肝脏miR-26a表达水平，图3-B：野生型与TGR5KO小鼠肝脏miR-16表达水平，图3-C：野生型小鼠各组肝脏表达miR-26a相对水平，图3-D：野生型与TGR5-/-小鼠肝脏表达miR-26a相对水，上述的图3-A到图3-D，可以说明TGR5对小鼠肝脏表达miR-26a的激活效应。
 TGR5的激活上调巨噬细胞中miR-26a表达
TGR5表达于鼠类巨噬细胞系RAW264.7。与空白对照组相比，用TGR5激动剂OA处理RAW264.7细胞在第6、12、24小时时可致miR-26a水平明显增高。相反，Kupffer细胞中一些其他miRNAs，包括miR-16，miR-21及miR-126，则不会受OA 的影响。同样，骨髓巨噬细胞于分离后4小时内给予OA（10μM）处理，也能观察到miR-26a表达上调。这些结果都表明TGR5的激活确实能够诱导巨噬细胞系及Kupffer细胞中miR-26a的表达，证明了TGR5在上调巨噬细胞中miR-26a表达的新功能。因此，我们用OA处理巨噬细胞系RAW264.7也能诱导miR-26a表达，跟OA治疗效果一样。相反，其他细胞系经OA处理后对miR-26a的表达没有影响。诱导动力学示3小时时出现诱导斑块。因此，我们将RAW264.7作为进一步研究的细胞模型。实验结果见图4-A：Kupffer细胞中4种miRNA表达的倍数变化，与CON组比较，﹡P＜0.05，图4-B：10uMOA作用于骨髓巨噬细胞后miR-26表达结果，与CON组比较，﹡P＜0.05，图4-C：不同剂量OA作用于RAW264.7细胞后miR-26a表达结果，与DMSO组比较，﹡P＜0.05，图4-D：OA作用不同时间RAW264.7细胞miR-26a表达结果，上述的图4-A到图4-D可以说明TGR5激活对巨噬细胞表达miR-26a的诱导效应。
 JNK信号通路与TGR5诱导miR-26a表达下游信号相关
通过G蛋白转换信号导致cAMP产生，随后激活PKA。因此，我们提出疑问，PKA在TGR5调节促炎性细胞因子产生过程中是否是必要的。RAW264.7细胞经PKA抑制剂H89预处理后并不会抑制OA诱导miR-26a的表达，说明TGR5激活对miR-26a的诱导并不需要PKA。
JNK是丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）的一员，MAPKs可被TGR5激活。因此，我们质疑，JNK对TGR5依赖性促炎性因子的诱导是否是必要的。在RAW264.7及Kupffer细胞中经OA处理后JNK磷酸化作用迅速增强。OA刺激可增强野生型小鼠腹腔巨噬细胞中JNK氧化磷酸化水平，TGR5-/-小鼠并无此效应。这些结果提示JNK只有在TGR5激活后才会被特异性激活。我们进一步研究了抑制JNK信号通路是否会阻断TGR5依赖性促炎性细胞因子的诱导。给予JNK诱导剂SP600125(10μM)，可显著减少RAW264.7细胞中OA诱导的miR-26a转录。甚至，在CA喂养的正常小鼠肝脏中，miR-26a的诱导是增加的，而在JNK1-/-小鼠肝脏该诱导受损。这些结果表明JNK为肝脏中TGR5调节细胞因子产生的关键下游作用分子。
我们同样检测了ERK、p38 MAPK及NF-κB的抑制剂。在TGR5激活之前，对RAW264.7细胞给予NF-κB抑制剂BMS-345541、ERK抑制剂（PD）预处理，将不会阻断OA诱导的miR-26a的产生。P38抑制剂（PB）却能显著减少OA对miR-26a的诱导作用。实验结果见图5-A：OA作用不同时间及是否加H89对RAW264.7表达miR-26a的影响，图5-B：RAW264.7细胞中不同抑制剂对OA诱导miR-26a表达的影响，与BMS、PD组比较，﹡P＜0.05，图5-C：Kupffer细胞中不同抑制剂对OA诱导miR-26a表达的影响，与BMS、PD组比较，﹡P＜0.05，图5-D：骨髓巨噬细胞中不同抑制剂对OA诱导miR-26a表达的影响，与DMSO、对照组比较，﹡P＜0.05，图5-E：Kupffer细胞中JNK对OA诱导miR-26a表达的影响，与JNK-/-比较，﹡P＜0.05，上述的图5-A到图5-E可以说明JNK信号通路参与TGR5介导的miR-26a表达诱导效应。
启动子分析确定了OA的反应DNA序列位于miR-26a近侧端
人类miR-26家族有两个成员，miR-26a和miR-26b，他们相异于三个核苷酸。在人及鼠类染色体组中，有两个基因位点与miR-26a-1和miR-26a-2相一致。miR-26a-1和miR-26a-2分别定位于CTDSPL和CTDSP2的内含子区域。为了更好的理解miR-26a对OA的反应机制，我们对比了RAW264.7细胞中OA对miR-26a-1和miR-26a-2的诱导。两者都能被OA显著诱导。然而，当我们检测宿主基因CTDSP2、CDTSP1和CTDSPL miR-26a的表达时，OA 对这些宿主基因的表达不起作用，说明miR-26a对OA的反应有自己的启动子。因此，我们克隆了miR-26a-1和miR-26a-2的启动子DNA片段，生成的荧光素酶报告基因包含它们的启动子。转染分析结果示两种启动子均能对OA有所反应。我们选择miR-26a-2启动子做进一步分析。在缺失报道分子之后，启动子最短的部分仍然保留着对OA的反应部件。这些结果表明miR-26a或许拥有自己的启动子，并且与宿主基因的调节机制不同。实验结果见图6-A：RAW 264.7细胞中OA作用不同时间对前体miR-26a表达的影响，图6-B：RAW 264.7细胞中OA作用对宿主基因miR-26a表达的影响，图6-C：miR-26a不同调控区域PGL-3荧光素酶载体转染OA作用后，RAW264.7细胞中相对荧光素酶活性的鉴定，图6-D：以PGL3荧光素酶为载体克隆miR-26a-2上游调控区，图6-E：不同载体转染OA作用后RAW264.7细胞中相对荧光素酶活性的鉴定，上述的图6-A到图6-E 可以说明OA反应元件位于miR-26a启动子近侧端。
讨论
胆汁酸研究方式的改变在于对胆汁酸的概念已经从单纯表面活性剂扩展到信号分子。通过激活胆汁酸两种受体，FXR和TGR5，胆汁酸可调节代谢及许多其他生理活动。从功能上说，FXR与TGR5在多种信号通路中互补，包括维持胆汁酸恒定、肝脏再生以及肥胖与2型糖尿病。这是因为两种胆汁酸受体有着不同的调节通路与功能。不同于FXR可直接调节相关功能靶基因的转录，TGR5激活后启动细胞激酶通路来改变基因表达。此次研究中，我们发现胆汁酸对miR-26a的诱导完全依赖于TGR5，FXR并不影响miR-26a的表达。因此，这两种胆汁酸受体在表达谱、配体选择以及下游信号调节通路方面均不相同。进一步的研究将阐明两种受体在调节胆汁酸信号通路中更多功能差异。此外，以FXR和TGR5为靶标研发药物也是一个潜在的发展方向。为了更有效的模拟B胆汁酸的作用，需要同时激活两种胆汁酸受体。值得注意的是，OA是一种纯天然化合物，能同时激活FXR和TGR5。因此，OA对TGR5-/-小鼠残存的效应归因于对FXR的激活。另一种半合成胆汁酸诱导剂INT-777，也能同时激活FXR和TGR5。事实上，INT-777除了激活FXR外，其对TGR5的激活可作用于褐色脂肪组织和肌肉中的D2，并能促进肠内分泌细胞释放GLP-1。
之前已经发现，TGR5的激活可通过增加细胞内cAMP水平及PKA活性抑制LPS诱导的细胞因子的表达。然而，近来研究发现，配体在缺乏诸如LPS的其他促炎性因子时激活TGR5，将导致在PKA未激活的情况下上调鼠类Kupffer细胞中IL-1β和TNF-α的表达。相反，TGR5依赖的细胞因子的产生是由JNK的激活介导的。类似于我们的结果，一项研究表明TGR5可通过cAMP/EPAC依赖性通路松弛胃平滑肌。在miR-26a表达的激活中，JNK也需要TGR5的作用来增加miR-26a的表达。尽管抑制p38通路也显著降低对miR-26a的诱导，OA治疗并没有导致p38氧化磷酸化(数据未显示)。有报道称JNK能介导ATF2或c-Jun的磷酸化和激活。ATF2和c-Jun 对miR-26a表达是否有相似的作用会在未来进一步求证。TGR5下游通路的不同激活方式表明不同TGR5配体可将启动不同的信号通路和基因表达。研发TGR5配体的药物时应予以考虑。
TGR5可以调节不同靶基因，以治疗肥胖和糖尿病。关于TGR5对miRNAs表达的影响之前未有报道。我们已经证明了miR-26a能够调节肝脏代谢。此前已经发现miR-26a与其宿主基因一起转录，但这种调节并不是在所有情况下均一致。例如，我们发现肝脏miR-26a的表达在肥胖小鼠及人类身上一直显著下降。我还们发现miR-26a宿主基因CTDSP1和CTDSP2的表达，在肥胖时并不显著改变。最近的一项研究报道了类似的现象，在这项研究中miR-26b与其宿主基因CTDSP1一起转录，但其成熟却受到神经干细胞和非神经元组织的特异性抑制。值得注意的是，ZCCHC11和KSRP能够调节miR-26的成熟。这项研究提示了一种TGR5激活直接调节miR-26a依赖宿主基因的转录的新机制。具体机制值得今后进一步的研究。
总之，当前的研究证明TGR5可以通过JNK依赖途径增加miR-26a表达。因而，我们的研究结果提供了胆汁酸信号和miRNAs之间在代谢调解中一种新的联系。这些发现还表明，通过小分子激活TGR5可以调节miRNAs的表达，以治疗肥胖相关代谢疾病。

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