CN104837986B - 使用纳米粒子提取神经干细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

一种从活受试者提取神经干细胞的方法，所述方法包括以下步骤：将磁性纳米粒子引入到所述受试者体内，使用所述磁性纳米粒子靶向神经干细胞以形成磁性纳米粒子所靶向的细胞，分离所述磁性纳米粒子所靶向的细胞，从所述受试者提取所述磁性纳米粒子所靶向的细胞。

Description

使用纳米粒子提取神经干细胞的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年11月15日提交的美国临时申请号61/726,762的优先权，该美国临时申请的内容以引用的方式整体并入本文。
技术领域
本发明涉及一种从受试者提取生物细胞的方法，特别是但不仅仅是一种从活受试者提取神经干细胞的方法。
背景技术
在神经干细胞研究和再生医学中的一项重大挑战是从成人的脑中精确地分离和提取功能性神经干细胞。神经干细胞(NSC)在性质上具有自我更新性和多能性，从而使得用于神经系统中的疾病的细胞替代疗法成为可能，这些疾病在目前一般是无法被治愈的。目前，神经干细胞仅可以从胎儿组织中获得或从作为替代来源的其它细胞类型分化而来。在目前，实际上不可能直接从已经是成人的患者本身直接获得神经干细胞。本发明的目的在于提供一种用于从受试者提取生物细胞、特别是神经干细胞的方法，在所述方法中，上述缺点得以减少或至少提供了一种有用的替代方案。
发明内容
因此，本发明提供了一种从受试者提取生物细胞的方法。所述方法包括将磁性纳米粒子引入到所述受试者体内，使用所述磁性纳米粒子靶向生物细胞以形成磁性纳米粒子所靶向的细胞，分离所述磁性纳米粒子所靶向的细胞，以及从所述受试者提取所述磁性纳米粒子所靶向的细胞。
优选地，所述靶向步骤进一步包括将所述生物细胞与所述磁纳米粒子一起培育的步骤。
优选地，所述分离步骤进一步包括搅拌所述磁性纳米粒子所靶向的细胞的步骤。
优选地，所述搅拌步骤包括使用磁力。
优选地，在所述受试者的外部施加所述磁力。
优选地，所述磁性纳米粒子包被有二氧化硅。
优选地，所述磁性纳米粒子与细胞标志物表面缀合。
优选地，所述磁性纳米粒子带有荧光。
优选地，所述细胞标志物包括干细胞表面标志物。
优选地，所述干细胞表面标志物包括抗体CD133。
优选地，所述生物细胞是神经干细胞。
优选地，所述方法是在所述受试者的脑的脑室下区处进行的。
优选地，所述磁性纳米粒子具有超顺磁性。
优选地，所述磁性纳米粒子由选自由以下各项组成的组的材料制成：氧化铁纳米粒子、磁赤铁矿(Fe2O3)纳米粒子、磁铁矿(Fe3O4)纳米粒子以及它们的混合物。
优选地，所述引入步骤包括注射的步骤。
优选地，所述受试者是活生物体。
优选地，所述受试者包括青少年或成人。
优选地，所述培育步骤持续少于或等于约24小时。
优选地，所述培育步骤持续约6小时。
优选地，所述搅拌步骤持续少于或等于约15分钟。
优选地，经由旋转磁场施加所述磁力。
优选地，所述提取步骤包括使用选自下组的工具：注射器、磁体探针、钕磁体以及它们的组合。
优选地，在体外(in vitro)施用所述方法。
优选地，在体内(in vivo)施用所述方法。
优选地，将所述方法用于治疗、预防患者的神经相关疾病或延迟所述神经相关疾病进展。
优选地，所述患者包括青少年或成人。
优选地，将所述方法用于使用患者自身的神经干细胞进行移植和治疗神经相关疾病的定制的细胞替代疗法中。
优选地，将所述方法用于鉴定神经干细胞群体以进行靶向的神经干细胞提取。
附图说明
根据以下说明，在与附图相结合时，本发明将变得显而易见，其中：
图1示出了根据本发明的一个实施方案所合成的磁性纳米粒子(MNP)。(a)二氧化硅包被的典型的MNP的透射式电子显微照片，其中所述粒子的尺寸是约100nm的直径。(b)具有97±13nm的平均尺寸的二氧化硅包被的MNP的尺寸分布。
图2示出了MNP的表征：(a)示出了处于二氧化硅中的氧化铁的饱和磁化强度曲线，并且(b)和(c)示出了每克MNP随温度(5K至300K)而变化的磁化率。
图3示出了乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性测定，所述乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性测定表明了在使用不同浓度的MNP(200-5000μg/ml)处理24小时之后P0大鼠脑室中细胞死亡的百分比。
图4示出了使用缀合有FITC的与抗体缀合的MNP(Ab-MNP)对CD133+星形细胞进行的选择性分离。
图5示出了在解离之后，与Ab-MNP一起培育过的P0大鼠侧脑室壁的解离细胞的流式细胞术实验的结果：(a)示出了在不存在Ab-MNP的情况下进行的流式细胞术对照实验；(b)示出了与Ab-MNP一起培育过的、但未进行磁力分离的脑室细胞；(c)和(d)示出了在进行磁力分离处理之后的与Ab-MNP一起培育过的脑室细胞；(e)示出了揭示了纯化的脑室细胞的CD133表达的免疫细胞化学的结果。
图6示出了使用从提取物拍摄的相应图像对使用在体内施用的Ab-MNP(2000μg/ml，在5μl的PBS中)从SVZ中高效地提取NSC的最佳的培育时间进行的研究：(a)0小时；(b)1小时；(c)3小时；(d)6小时；(e)24小时。
图7示出了使用从SVZ内衬层拍摄的相应图像对用于从SVZ中高效地提取NSC的‘磁力搅拌’的时间事件进行的研究：(a)在未施用Ab-MNP的情况下；(b)0分钟；(c)5分钟；(d)10分钟；(e)15分钟。
图8示出了由所提取的细胞产生神经球：(a)和(b)示出了在磁力分离之后通过注射器获得的具有CD133免疫反应性的脱离的细胞；(c)示出了在未进行磁力搅拌时，在提取物中很难找到CD133+细胞；(d)示出了分化成不同细胞之前的形成神经球的分离的成年大鼠侧脑室CD133+细胞的放大图像；(e)示出了在培养基中6天之后CD133+细胞产生的神经球；(f)至(i)示出了在将由神经球产生的不同类型的细胞铺板到PDL包被的表面上之后5天时的结果，包括：(f)-(g)Tuj-1+/MAP2+神经元；(f)GFAP+星形细胞；(h)RIP+少突胶质细胞；以及(i)巢蛋白+未定型(uncommitted)的祖细胞。
图9示出了在为了提高CD133+NSC的纯度以进行分化、使用磁体吸引靶细胞时的结果：(a)在施加磁场之前；(b)在施加磁场之后；(c)将钕磁体探针插入SVZ中以对CD133+细胞进行原位提取。
图10示出了从脑组织中对NSC进行磁力分离的汇总。
具体实施方式
本发明涉及一种用于从成年哺乳动物采集CD133+室管膜细胞的基于纳米粒子的提取系统。CD133+室管膜细胞是在被称作脉络丛的脑结构中以相对大的量存在的神经干细胞，所述脉络丛沿着脑的脑室下区(SVZ)内衬。脑室下区在性质上是中空的，这允许在体内对细胞进行手术提取而不会引起重大脑损伤。磁性纳米粒子(MNP)包含由保护性的亲水性二氧化硅壳封装的氧化铁、磁赤铁矿(Fe2O3)、磁铁矿(Fe3O4)或它们的混合物，被用作用于细胞捕集的生物相容性纳米装置。优选地，所述纳米粒子具有超顺磁性。为了提高细胞提取的特异性，已经将抗CD133抗体(CD133是用于鉴定干细胞群体的细胞表面标志物)与MNP缀合。
将与抗体缀合的MNP(Ab-MNP)通过注射引入到受试者的SVZ中并且培育几小时以允许Ab-MNP对神经干细胞(NSC)进行靶向。将使所述受试者经受旋转过程以促进所靶向的细胞的分离，其中将所述受试者放置在磁场内以促进靶细胞的脱离，其中在所述受试者的外部施加所述磁场。优选地，所述磁场是旋转磁场。将通过使用注射器或钕磁体探针对脱离的细胞进行提取和收集以进行进一步培养。所述受试者被发现能够在所述提取过程之后保持存活。
然后将所提取的细胞在促进神经球的条件下培养。随后收集神经球以用于诸如神经元之类的所关注的细胞的分化。
MNP的合成和验证
根据在以下方法部分中所述的方法来进行合成：合成MNP，将MNP涂覆以二氧化硅、然后涂覆以荧光，随后的将抗体CD133缀合到带有荧光的二氧化硅包被的Ab-MNP上。如从图1中所看到，MNP被发现显示出窄的粒度分布，其中粒子的尺寸是如通过透射式电子显微照相术(TEM)(图1a，比例尺：(A-i)200μm；(A-ii)100μm)所揭示的约100nm的直径和如通过尺寸分布(图1b)所揭示的97±13nm的平均尺寸。
还对这些粒子的磁化率进行了测量和优化。如图2中所示，首先测量了二氧化硅包被的典型的氧化铁纳米粒子在递增的磁场中的饱和磁化强度曲线。此后在存在和不存在100奥斯特(Oe)的外部弱磁场的情况下通过超导量子干涉器件(SQUID)对所有功能性氧化铁粒子的磁化率曲线进行了探测(图2b和2c)。注意到，与裸露的氧化铁的70-80emu/g相比，在二氧化硅包被的氧化铁粒子上保持约30emu/g的高饱和磁化强度值(图2a)。FC磁化强度曲线和ZFC磁化强度曲线在阻隔温度(blocking temperature)处以及在低于阻隔温度处分开(TB是铁磁性向超顺磁性的转变)。因此明显的是，所有材料在整个温度范围(高于300K的TB)内均明确地表现出铁磁特性。如从图中所看到的那样，递增量的包括二氧化硅、抗体、荧光标签以及细胞在内的非铁磁性或略具反铁磁性的涂层(在FC条件下从13emug-1至0.2emug-1)已使MNP的磁化率值大幅降低。已使用不同尺寸的MNP(20nm、50nm、100nm)进行尝试并且发现所合成的MNP的尺寸越大，则磁化率值越高(未示)。具体来说，在施加和不施加外场的情况下100nm MNP均不存在明显的聚结，推测厚的二氧化硅涂层给予每个MNP以磁隔离作用(低矫顽磁力)。在施加强磁场时，以F＝I(δH/δX)＝χH(δH/δX)在磁体上给予力。F是在磁体上沿递增磁场方向的每单位体积的力，I是磁化强度，χ是磁化率并且H是磁场强度，如A.Al-Saadi等人,Layer-by-Layer Electrostatic Entrapment of Protein Moleculeson Superparamagnetic Nanoparticle:A New Strategy to Enhance AdsorptionCapacity and Maintain Biological Activity(在超顺磁性纳米粒子上逐层静电包覆蛋白质分子：一种提高吸附能力和维持生物活性的新策略),J Phys Chem C 113,15260(2009年8月27日)中所述。在该文中已经证实，使用具有2mm内径和10mm长度的典型的自制的约6,000G的NdFeB磁探针足以诱使小铁磁性粒子进行磁力分离。对在使用处于二氧化硅中的功能性氧化铁的情况下的磁力分离进行的进一步优化正在进行中。
在对这些粒子进行进一步处理之前，首先通过乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性测定来评估它们的细胞毒性。如图3中所示，在使用200μg/ml-5000μg/ml的浓度范围的MNP处理24小时之后P0大鼠脑室中细胞死亡的百分比与对照组相当，这表明MNP无毒。
还评估了Ab-MNP对NSC的特异性。利用原代的星形细胞(CD133+)和SH-SY5Y(CD133-)进行体外测试并且首先使用FITC(异硫氰酸荧光素)对Ab-MNP进行荧光标记。通过合并微分干涉相差(DIC)和共焦图像，对Ab-MNP在细胞溶液中的分布进行监测。在图4中示出了Ab-MNP有利地与CD133+星形细胞的细胞表面结合。在向细胞培养物施加磁场的情况下，溶液中带有Ab-MNP的CD133+细胞被有效驱动。虽然对于SH-SY5Y细胞培养物，Ab-MNP在溶液中均匀分布，但是在施加磁场的情况下，细胞是不动的。
然后通过流式细胞术分析对Ab-MNP通过磁性装置在体外识别和提取CD133+NSC的能力进行测试。如图5中所示，对在未进行磁力分离处理的情况下解离的与Ab-MNP一起培育过的侧脑室细胞进行的流式细胞术分析揭示，在溶液相中仅有1.92％±0.15％的细胞呈CD133+(图5b)。在磁力分离之后，CD133+细胞的百分比从1.92％±0.15％增加到37.43％±11.2％(图5c)，溶液浓度增加到几乎20倍(图5(d))。还进行了免疫细胞化学以使纯化的细胞的CD133+表达可视化(图5e)。结果表明Ab-MNP可以被用于经由简单的磁性装置识别和进一步磁力纯化或提取CD133+神经干细胞。
靶向成年SD大鼠的SVZ中的NSC
然后在成年SD大鼠中对NSC进行体内提取。培育和磁力搅拌的持续时间被发现对于从SVZ区中高效地提取NSC来说是关键的。在不同的时间点(0小时、1小时、3小时、6小时以及24小时)当中，在6小时的培育时间时观测到Ab-MNP与细胞的广泛结合(图6a-6e)。可以想到，标记/SVZ的内皮内衬层中的细胞的选择性结合和移出在大鼠体内是较为动态的。培育时间显然是为扩散和结合过程所必需的，但是在24小时的培育结束时获得了显著更低的产量(图6d)。还将动物放置在通过磁力搅拌器板所产生的外部弱旋转磁场下。如图7a-7e中所示，发现旋转15分钟对于使NSC最大程度脱离而不对组织造成严重损伤来说是最佳的时间。有趣的是，在磁力搅拌0至10分钟的情况下，在SVZ的内衬层上可以明显地观测到高浓度的Ab-MNP。但是发现在内衬层上的粒子浓度是逐渐递减的，这可能是因为它们悬浮并且进入到CSF液相中。相比之下，在未进行磁力搅拌的情况下，在内衬层上的粒子浓度没有太大的改变，这表示磁力搅拌是使表面可及的磁性标记的细胞释放到流体中的一个必需步骤。注意到，使同样的动物经受这一重复的磁性手术，但是它们当中的全部在处理之后被发现均保持存活并且看起来健康。
原位提取和分离NSC
因此，在6小时的培育时间之后进行15分钟的磁力搅拌被选择为用于进一步实验的处理条件。然后通过微型注射器从SVZ区中提取脱离的磁性标记了的细胞(图8a和8b)。通过磁性装置从所提取的细胞混合物中分离出所关注的细胞(图8b)，这是因为与Ab-MNP缀合的NSC具有可磁力分离的特性。值得注意的是，磁力搅拌再次被证明对于CD133+细胞的脱离来说是必需的(图8c)。每次提取的CD133+细胞的数目是约221.67±79.89个细胞/微升。在通过常规的磁力分离进行分选之后，将CD133+NSC浓缩用于进一步处理(图9)。此外，还可以通过钕磁探针来吸引磁性的CD133+细胞，所述钕磁探针可以被用作用于选择性细胞提取的工具(图9c)。一旦将所述探针插入受试者的SVZ中，具有可磁力分离的特征的NSC就会快速地附在探针上。因此，所述磁力显微手术方法被发现能够简单并且安全地对动物受试者实施。
使分离的成年大鼠侧脑室CD133+细胞分化成神经谱系和神经胶质谱系
如图8d中所示，在接种之后的6天时在成年大鼠CD133+细胞培养物中观测到CD133神经球(图8d)，并且它们的平均直径在第9天时超过100μm(图8e)，而被丢弃的提取物(在通过磁力分离将CD133+细胞分离之后残留的提取物)未能产生神经球。在这个实验中，只有具有超过50μm的直径的细胞簇作为神经球被计数。神经球形成率是约4.49％±2.02％。在分化诱导之后的5天时，明显观测到Tuj-1+和MAP2+神经元(图8f和8g)、GFAP+星形细胞(图8f)、RIP+少突胶质细胞(图8h)以及巢蛋白+未定型的祖细胞(图8i)，这证实了CD133+神经球的多能性。因此，成年大鼠脑室CD133+NSC的体外增殖和多能分化的能力表明磁力提取的细胞对于使用和修饰来说具有活性。
用于从脑中提取神经干细胞的新的磁力分离技术
作为概念验证，我们已经证实了一种使用磁性装置单步分离活性CD133+干细胞的高效方法(图10)，这些干细胞已经成功地在体外产生神经球。在进一步的细胞分化中还产生了神经元、少突胶质细胞、星形细胞以及巢蛋白+未定型的祖细胞。尽管获得了相对低程度的神经球(在目前，是约4.49％±2.02％)，但我们认为它是通往从成体的脑中分离多能性神经干细胞/祖细胞而无需屠宰动物或造成显著损伤的应用的第一步。已证实的是，所提取的成年大鼠脑室区CD133+NSC可以快速地增殖并且在培养6天内产生神经球。在第9天观测到超过100μm的神经球的平均直径。在诱导分化之后，神经细胞和神经胶质细胞快速地由神经球产生，而巢蛋白+未定型的祖细胞仍然大量可得。这一证据明确地表明利用轻度的磁力搅拌所磁力提取的、特别是从侧脑室(LV)和SVZ的表面内衬层中磁力提取的成体CD133+神经干细胞在基于自体干细胞的细胞替代疗法中具有活性并且是高效的。因此，可以在体外使分离的干细胞/祖细胞快速地扩增并且移植回以进行再生治疗。
从实际的角度来看，从LV和SVZ的表面内衬层中磁力提取作为NSC的室管膜细胞似乎是一种安全的操作并且还可以获得相对高浓度的细胞。这些所提取的活性细胞可以在体外被定制或工程化以适合具体的需要。MNP显示出低的细胞毒性并且提取所需的量一般是非常低的(对于在SVZ中提取CD133+细胞来说，是<0.19mg/kg；对于造影剂来说，通常是<4mg/kg，如J.S.Weinstein等人,Superparamagnetic iron oxide nanoparticles:diagnostic magnetic resonance imaging and potential therapeutic applicationsin neurooncology and central nervous system inflammatory pathologies,a review(超顺磁性氧化铁纳米粒子：在神经肿瘤学和中枢神经系统炎症性病变中的诊断性磁共振成像和潜在的治疗性应用的综述),J Cerebr Blood F Met 30,15(2010年1月)中所报道)。先前的研究，如J.S.Weinstein等人,Superparamagnetic iron oxide nanoparticles:diagnostic magnetic resonance imaging and potential therapeutic applicationsin neurooncology and central nervous system inflammatory pathologies,a review(超顺磁性氧化铁纳米粒子：在神经肿瘤学和中枢神经系统炎症性病变中的诊断性磁共振成像和潜在的治疗性应用的综述),J Cerebr Blood F Met 30,15(2010年1月)；L.Zecca,M.B.Youdim,P.Riederer,J.R.Connor,R.R.Crichton,Iron,brain ageing andneurodegenerative disorders(铁、脑衰老以及神经变性病症),Nat Rev Neurosci 5,863(2004年11月)；以及K.R.Wagner,F.R.Sharp,T.D.Ardizzone,A.Lu,J.F.Clark,Heme andiron metabolism:role in cerebral hemorrhage(血红素和铁代谢：在脑出血中的作用),Journal of cerebral blood flow and metabolism:official journal of theInternational Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism(脑血流与代谢杂志：国际脑血流与代谢学会官方杂志),23,629(2003年6月)还证实了MNP可以由血脑屏障中的内皮细胞快速地代谢，从而使得MNP的使用更可为临床实践所接受。因此，这种技术虽然处在研发的早期阶段，但在生物学和临床应用中，特别是在再生医学治疗领域中，从实验工作台到临床可能都会给予激动人心的潜力。
方法
MNP的合成
通过如L.L.Vatta,R.D.Sanderson,K.R.Koch,Magnetic nanoparticles:Properties and potential applications(磁性纳米粒子：特性和潜在的应用),PureAppl Chem 78,1793(2006年9月)中所述的马萨特法(Massart's method)来合成MNP，所述方法基于呈1:2摩尔比的铁(II)和铁(III)离子的共同沉淀。在机械搅拌下将4ml的1M氯化铁(III)(FeCl3)和1ml的2M氯化铁(II)(FeCl2)的溶液添加到50ml的0.7M氢氧化铵(NH4OH)中。将溶液搅拌1小时直到形成黑色氧化铁纳米粒子为止。将沉降物在外部磁场下用蒸馏水洗涤两次，其中去除上清液并且在70℃干燥过夜。
FITC-APTES乙醇溶液的合成
通过将2.79μl的(3-氨基丙基)三乙氧基甲硅烷(APTES)添加到1.11μl的23mM异硫氰酸荧光素(FITC)的乙醇溶液中并且在暗处搅拌24小时来制备预先缀合的N-1-(3-三甲氧基-甲硅烷基丙基)-N'-荧光素基硫脲(FITC-APTES)。
带荧光的二氧化硅包被的MNP的制备
通过如C.W.Lu等人,Bifunctional magnetic silica nanoparticles forhighly efficient human stem cell labeling(用于高效的人类干细胞标记的双官能磁性二氧化硅纳米粒子),Nano letters 7,149(2007年1月)中所呈现的油包水(w/o)反胶束法来合成二氧化硅包被的MNP。将0.2846g的MNP分散于1.7ml蒸馏水和8ml正己醇中。然后在机械搅拌下将38.5ml环己烷和9.4ml Triton X-100添加到混合物中以产生微乳液体系。然后，在搅拌下将2ml的TEOS添加到溶液中。在6小时之后，将5ml的28％氢氧化铵添加到混合物中。在24小时之后，将1ml的FITC-APTES添加到混合物中并且在暗处搅拌。在24小时之后，形成FITC-二氧化硅包被的MNP并且将所述MNP通过外部磁场分离。将粒子用蒸馏水和乙醇反复地洗涤并且重悬于5ml的蒸馏水中。
带荧光的二氧化硅包被的Ab-MNP的制备
以如Y.S.Lin,C.L.Haynes,Synthesis and Characterization ofBiocompatible and Size-Tunable Multifunctional Porous Silica Nanoparticles(生物相容的并且尺寸可调的多官能多孔二氧化硅纳米粒子的合成和表征),Chem Mater 21,3979(2009年9月8日)中所报道的方式通过EDC/NHS化学方法将抗体CD133共价缀合到二氧化硅包被的磁性纳米粒子上。通常，将6.41μl的15.6μg/μl N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和4.16μL的24μg/μl N-羟基丁二酰亚胺(NHS)添加到2.24mL的65.9μg/μl带荧光的二氧化硅包被的MNP(160μg)中。将混合物培育30分钟。因此，将10μl抗体CD133添加到混合物中并且在室温下培育1小时。
透射式电子显微镜法(TEM)和数据分析
将5μl的MNP溶液滴到碳包被铜网(T200H-Cu，美国华盛顿的电子显微镜科技公司(Electron Microscopy Science,Washington,USA))上并且在真空中干燥过夜。分别通过具有200kV的加速电压的Technia G2透射式电子显微镜(美国的FEI公司(FEI,USA))和具有210kV的加速电压的JEM2100TEM(日本的JEOL公司(JEOL,Japan))拍摄干燥了的样品的TEM图像以获得高分辨率的TEM图像。使用自由领域的软件Image J(http://rsweb.nih.gov/ij/)测量MNP的直径。使用该软件的手绘线(Freehand line)和测量(Measure)功能对一百个纳米粒子进行测量。使用软件OrginPro8对纳米粒子的分布进行拟合。观测到纳米粒子的尺寸是约97nm。
出生后第0天的大鼠前脑CD133+细胞和CD133+原代星形细胞的分离
a.出生后第0天的大鼠前脑CD133+细胞的分离
将侧脑室壁(前脑CD133+细胞)切成小块并且在0.25％的胰蛋白酶(英国的Biosera公司(Biosera,UK))中在37℃消化20分钟。然后通过使用火焰抛光的巴斯德吸移管(Pasteur pipette)轻轻地研磨消化之后的组织并且通过使用40μm的细胞过滤器(BDFalcon公司)过滤以产生解离的细胞。
b.CD133+原代星形细胞的分离
在去除脑膜之后，将全脑切成小块并且在0.25％的胰蛋白酶(英国的Biosera公司)中在37℃消化20分钟。通过使用火焰抛光的巴斯德吸移管轻轻地研磨消化过的组织并且通过使用70μm的细胞过滤器(BD Falcon公司)过滤。进行维生素和Ara C处理以纯化星形细胞。
乳酸脱氢酶细胞毒性测定
通过出生后第0天的大鼠SVZ细胞[n＝4]中乳酸脱氢酶的酶活性来指示纳米粒子的细胞毒性。用不同浓度的MNP将细胞处理24小时。然后通过可商购获得的细胞毒性检测试剂盒(LDH细胞毒性试剂盒，罗氏分子生化试剂公司(Roche Molecular Biochemicals))和分光光度计(Tecan Infinit F200)以在495nm处的吸光度的形式来测量细胞死亡的百分比。
出生后第0天的大鼠前脑CD133+细胞和CD133+星形细胞的基于纳米粒子的纯化
将来自侧脑室壁的解离的细胞与400单位/毫升的浓度的Ab-MNP一起在普通的DMEM-F12培养基(生命科技公司(Life Technologies))中培育1小时。然后将细胞以25,000个细胞/平方厘米的密度接种到6孔悬浮培养板(格瑞纳第一生化公司(Greiner Bio-One))上。将磁体放置在孔旁边以吸引任何与MNP结合的细胞。在30分钟之后，从孔的远侧缓慢地排出培养基。将靠近磁体的区域用普通的DMEM-F12培养基洗涤以将细胞回收在溶液中。对于流式细胞术分析，将纳米粒子纯化的细胞在4％PFA中在25℃固定10分钟。然后将固定的细胞经由40μm的细胞过滤器(BD Falcon公司)过滤并且通过BD FACSCanto II分析器使用所计数的30,000个细胞进行分析。
对于免疫细胞化学，通过使用细胞离心涂片机(cytospin)使纯化的细胞附着到显微镜载玻片(Superforst，赛默科技公司(Thermo Scientific))上并且在4％多聚甲醛(PFA)中在25℃固定10分钟。然后将固定的细胞使用CD133一抗(1:10,000，小鼠抗大鼠，密理博公司(Millipore))在4℃免疫标记过夜，继而使用Alexa 488二抗(1:400，山羊抗小鼠，生命科技公司)在25℃免疫标记30分钟。在对照实验中，使用小鼠IgG1同种型对照(生命科技公司)替代CD133一抗。在落射荧光显微镜(Olympus IX71倒置荧光显微镜)下观察经过免疫染色的细胞并且拍摄数字图像(具有Olympus分析LS专业成像软件的Olympus DP71照相机)。将实验重复至少3次。
所用的动物
在实验中利用体重是200-220g的成年斯泼累格-多雷(Sprague-Dawley，SD)大鼠。在这项研究中执行的动物实验方案由香港卫生署的动物(实验管制)条例(Animals(Control of Experiments)Ordinance,Department of Health,Hong Kong)、香港浸会大学的人类和动物受试者的教学和研究使用委员会(Committee on the Use of Human andAnimal Subjects in Teaching and Research,Hong Kong Baptist University)、以及实验室动物护理原则(Principles of Laboratory Animal Care)(NIH出版号86-23，1985年修订)的准则严格地确认并且批准。在所有程序中，动物的数目和痛苦这两者均旨在被减到最低程度。
在SVZ中原位提取NSC
在显微手术之前，首先使用戊巴比妥钠(60mg/kg；腹膜内；矢状位)使SD大鼠麻醉。在头皮上切割约1cm的小中线矢状皮肤切口以暴露颅骨。在颅骨中以立体定向方式钻出具有0.2cm直径的两个孔(前卤：+0.05cm，中线：±0.1cm)以将Ab-MNP注射到SVZ中。然后将Ab-MNP(5μl，2000μg/ml)以立体定向方式施用到目标部位(硬脑膜：-0.5cm；1微升/分钟)中并且允许在不同的时间点(0小时[n＝5]、1小时[n＝5]、3小时[n＝5]、6小时[n＝5]以及24小时[n＝5])当中培育。在提取NSC之前，进行旋转过程(0分钟[n＝5]、5分钟[n＝5]、10分钟[n＝5]以及15分钟[n＝5])以使CD133+NSC从内衬于CNS的脑室系统的单层多纤毛细胞松开。在使用培育和磁力搅拌的最佳持续时间的情况下，然后通过注射器收集NSC(1μl的提取物；0.5微升/分钟)以进行进一步培养[n＝8]。还验证了通过磁体探针对CD133+细胞的提取[n＝3]。将探针插入SVZ中，持续15分钟以吸引所关注的细胞。提取的深度与注射的深度相同(硬脑膜：-0.5cm)。没有将纳米粒子注射到对照组[n＝10]的SVZ中。
分离的成年大鼠前脑CD133+细胞的体外繁殖和分化
将所提取的CD133+细胞维持在神经球形成培养基(SFM)中，所述培养基由补充有20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，派普泰克公司(Peprotech))、20ng/ml表皮生长因子(EGF，派普泰克公司)以及B27(生命科技公司)的DMEM-F12培养基构成。将细胞以每孔10个细胞的克隆密度接种到96孔培养板中，这修改自Coskun等人,2008。在这个步骤中使用康宁公司(Corning)的超低附着型96孔培养板(Ultra-Low attachment 96well plate)。将补充物每3天添加一次，并且将培养物维持12天。收集所产生的神经球以供用于后续的实验。
为了诱导分化，将神经球铺板到聚-D-赖氨酸(西格玛公司(Sigma))包被的4孔培养板(Nunc公司)上并且维持在由补充有B27(生命科技公司)的Neurobasal培养基(生命科技公司)构成的分化培养基中。将细胞在分化培养基中维持5天，然后在4％PFA中在25℃固定10分钟。然后在4℃将固定的细胞用以下一抗免疫标记过夜：Tuj-1(1:500，小鼠抗大鼠，科文斯公司(Convance))、GFAP(1:400，兔抗大鼠，丹科公司(Dako))、RIP(1:400，小鼠抗大鼠，杂交瘤库公司(Hybridoma Bank))以及巢蛋白(1:300，小鼠抗大鼠，BD Phamingen公司)。然后在25℃将固定的细胞用Alexa 488(1:400，山羊抗小鼠，生命科技公司)和Alexa594(1:400，山羊抗兔，生命科技公司)免疫标记30分钟。在落射荧光显微镜(Olympus IX71倒置荧光显微镜)下观察经过免疫染色的细胞并且拍摄数字图像(具有Olympus分析LS专业成像软件的Olympus DP71照相机)。
灌流
首先使用过量的戊巴比妥钠(60mg/kg，腹膜内，矢状位)使大鼠深度麻醉。然后通过使用蠕动泵将它穿心灌流250ml的0.9％盐水以去除任何血液，继而穿心灌流250ml的固定剂(含0.1％戊二醛的3％多聚甲醛的0.1M磷酸盐缓冲液(PB)溶液，pH 7.4)。将盐水的灌流流速设置为25毫升/分钟，固定剂的灌流流速设置为15毫升/分钟。将固定的脑从颅骨内取出并且在4℃在后固定溶液(含3％多聚甲醛的0.1M PB，pH 7.4)中储存过夜。将脑用磷酸盐缓冲盐水(PBS；0.01M，pH 7.4)冲洗三次，然后通过使用振动切片机(vibratome)切割成70μm的切片。将所有切片在使用之前收集在4℃的PBS中。进行免疫荧光法以阐明对CD133和神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的免疫反应性。此外，还将所提取的细胞用封片介质(丹科公司)封固在干净的载玻片上并且用盖玻片盖上以用激光扫描共聚焦显微镜(Olympusfluoview 1000)在相同的参数下进行检查。
统计分析
平均值±SD或SEM在图中示出。使用斯图登氏t检验(Student's t-test)来计算实验组与对照组之间的p值。p值<0.5被认为有显著性。
本发明公开了一种原位提取活受试者的神经干细胞的方法。此外，本发明提供了一种手段来研发使用各受试者自身的神经干细胞进行移植和治疗神经相关疾病的定制的体内细胞替代疗法。可以想到所述方法可用于治疗、预防患者、特别是青少年或成人患者的神经相关疾病或延迟所述神经相关疾病的进展。
如果需要的话，本文所论述的不同功能可以按不同的顺序和/或彼此同时执行。此外，如果需要的话，上述功能中的一种或多种可以是任选的或可以被组合。
在本申请的任何其它部分中对任何参考文献的引用或标示均不应当被视为承认所述参考文献可用作本申请的现有技术。
虽然已就各个实施方案和实施例对上述本发明加以描述，但是应当了解的是，其它实施方案在如在以下权利要求和它们的等同方案中所表示的本发明的范围内。此外，上述具体实施例仅应当被视作是说明性的，而不会以任何方式限制本公开的其余部分。在未进行进一步详细描述的情况下，相信本领域技术人员能够基于本文的说明最大程度地利用本发明。本文所叙述的所有出版物在此以引用的方式整体并入本文。

Claims (16)

1.一种用于从受试者提取神经干细胞的磁性纳米粒子与细胞表面标志物的抗体缀合的Ab-MNP，其中磁性纳米粒子包被有二氧化硅，所述细胞表面标志物为干细胞表面标志物；所述粒子的平均尺寸分布范围为97±13nm，其中所述干细胞表面标志物的抗体包括CD133抗体。
2.根据权利要求1所述的Ab-MNP，其中所述磁性纳米粒子由选自由以下各项组成的组的材料制成：氧化铁纳米粒子、磁赤铁矿纳米粒子、磁铁矿纳米粒子或它们的任意混合物。
3.根据权利要求1所述的Ab-MNP，其中所述磁性纳米粒子还包被荧光。
4.根据权利要求1所述的Ab-MNP，其中所述磁性纳米粒子具有超顺磁性。
5.根据权利要求1所述的Ab-MNP，其中所述粒子的直径为100nm。
6.一种利用权利要求1～5中任一项所述的磁性纳米粒子与细胞表面标志物的抗体缀合的Ab-MNP从受试者的体外的细胞中提取神经干细胞的方法，其中所述方法包括：
(a)将Ab-MNP引入到所述受试者的体外的细胞中，
(b)使用所述Ab-MNP靶向神经干细胞以形成磁性纳米粒子所靶向的神经干细胞，
(c)分离所述Ab-MNP所靶向的神经干细胞，
(d)从所述受试者的体外的细胞中提取所述Ab-MNP所靶向的神经干细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述靶向步骤进一步包括将所述神经干细胞与所述Ab-MNP一起培育的步骤。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述分离步骤进一步包括搅拌所述Ab-MNP所靶向的神经干细胞的步骤。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述搅拌步骤包括使用磁力。
10.根据权利要求9所述的方法，其中在所述受试者的体外的细胞的外部施加所述磁力。
11.根据权利要求7所述的方法，其中所述培育步骤持续少于或等于24小时。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述培育步骤持续6小时。
13.根据权利要求8所述的方法，其中所述搅拌步骤持续少于或等于15分钟。
14.根据权利要求9所述的方法，其中所述磁力经由旋转磁场施加。
15.根据权利要求6所述的方法，其中所述提取步骤包括使用选自下组的工具：注射器、磁体探针、钕磁体以及它们的组合。
16.根据权利要求6所述的方法，其中对所提取的细胞进行鉴定。
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