CN104826130A - Msx3基因特异诱导小胶质细胞选择性极化的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程和医学领域，具体涉及MSX3基因特异诱导小胶质细胞选择性极化的方法及其在制备治疗多发性硬化疾病药物中的应用。本发明的主要技术方案如下：(一)根据MSX3的基因结构，制备MSX3 cDNA序列，构建MSX3过表达的真核表达载体，构建MSX3过表达型(MSX3-GFP)慢病毒。(二)将过表达型慢病毒转染小鼠和人小胶质细胞。研究表明，过表达MSX3的小胶质细胞同样呈现M2表型，有效缓解了EAE病情进展。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和医学领域，具体涉及一种高表达同源盒基因MSX3(msh-like homeobox-3)的小胶质细胞及其在多发性硬化等脱髓鞘疾病中促进再髓鞘化的应用。
背景技术
多发性硬化(MS)是一种自身免疫性中枢神经系统脱髓鞘疾病。大部分患者以复发缓解型起病，之后发展成不可逆的继发进展型(Trapp,B.D.,and Nave,K.A.2008.Multiple sclerosis:an immune or neurodegenerative disorder？Annu Rev Neurosci 31:247-269.)。机体修复性的再髓鞘只出现在MS的早期阶段，目前认为晚期再髓鞘功能的丧失很可能是导致MS由复发缓解型发展成不可逆的继发进展型的重要原因(Scolding,N.,Franklin,R.,Stevens,S.,Heldin,C.H.,Compston,A.,and Newcombe,J.1998.Oligodendrocyte progenitors are present in the normal adult human CNS and in the lesions of multiple sclerosis.Brain 121(Pt 12):2221-2228.)。而再髓鞘的失败很可能是由MS慢性病灶处的神经轴突退行性变(Zamvil,S.S.,and Steinman,L.2003.Diverse targets for intervention during inflammatory and neurodegenerative phases of multiple sclerosis.Neuron 38:685-688.)和少突胶质细胞前体细胞分化障碍(Kuhlmann,T.,Miron,V.,Cui,Q.,Wegner,C.,Antel,J.,and Bruck,W.2008.Differentiation block of oligodendroglial progenitor cells as a cause for remyelination failure in chronic multiple sclerosis.Brain 131:1749-1758.；Shen,S.,Sandoval,J.,Swiss,V.A.,Li,J.,Dupree,J.,Franklin,R.J.,and Casaccia-Bonnefil,P.2008.Age-dependent epigenetic control of differentiation inhibitors is critical for remyelination efficiency.Nat Neurosci 11:1024-1034.)导致的。
目前发现小胶质细胞的极化在调节神经元和少突胶质细胞前体细胞功能中发挥重要作用(Peferoen,L.,Kipp,M.,van der Valk,P.,van Noort,J.M.,and Amor,S.2013.Review series on immune responses in neurodegenerative diseases:Oligodendrocyte-microglia cross-talk in the CNS.Immunology.；Minghetti,L. 2005.Role of inflammation in neurodegenerative diseases.Curr Opin Neurol18:315-321.；Rasmussen,S.,Wang,Y.,Kivisakk,P.,Bronson,R.T.,Meyer,M.,Imitola,J.,and Khoury,S.J.2007.Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing--remitting experimental autoimmune encephalomyelitis.Brain 130:2816-2829.)。不同极化状态的小胶质细胞分泌不同细胞因子促进少突胶质细胞前体细胞分化，并保护神经元免予损伤(Liao,B.,Zhao,W.,Beers,D.R.,Henkel,J.S.,and Appel,S.H.2012.Transformation from a neuroprotective to a neurotoxic microglial phenotype in a mouse model of ALS.Exp Neurol 237:147-152.；Miron,V.E.,Boyd,A.,Zhao,J.W.,Yuen,T.J.,Ruckh,J.M.,Shadrach,J.L.,van Wijngaarden,P.,Wagers,A.J.,Williams,A.,Franklin,R.J.,et al.2013.M2microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination.Nat Neurosci 16:1211-1218.；
Butovsky,O.,Landa,G.,Kunis,G.,Ziv,Y.,Avidan,H.,Greenberg,N.,Schwartz,A.,Smirnov,I.,Pollack,A.,Jung,S.,et al.2006.Induction and blockage of oligodendrogenesis by differently activated microglia in an animal model of multiple sclerosis.J Clin Invest 116:905-915.；Kigerl,K.A.,Gensel,J.C.,Ankeny,D.P.,Alexander,J.K.,Donnelly,D.J.,and Popovich,P.G.2009.Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord.J Neurosci 29:13435-13444.)。M1型小胶质细胞数量同轴突损伤程度正相关，而M2型只在再髓鞘病灶及病灶周围存在(Rasmussen,S.,Wang,Y.,Kivisakk,P.,Bronson,R.T.,Meyer,M.,Imitola,J.,and Khoury,S.J.2007.Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing--remitting experimental autoimmune encephalomyelitis.Brain130:2816-2829.；Miron,V.E.,Boyd,A.,Zhao,J.W.,Yuen,T.J.,Ruckh,J.M.,Shadrach,J.L.,van Wijngaarden,P.,Wagers,A.J.,Williams,A.,Franklin,R.J.,et al.2013.M2microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination.Nat Neurosci 16:1211-1218.；Bitsch,A.,Schuchardt,J.,Bunkowski,S.,Kuhlmann,T.,and Bruck,W.2000.Acute axonal injury in multiple sclerosis.Correlation with demyelination and inflammation.Brain 123(Pt6):1174-1183.)。由此，阻断M1向M2的极化很可能是导致慢性非活动的MS病灶处再髓鞘失败的重要因素(Miron,V.E.,Boyd,A.,Zhao,J.W.,Yuen,T.J., Ruckh,J.M.,Shadrach,J.L.,van Wijngaarden,P.,Wagers,A.J.,Williams,A.,Franklin,R.J.,et al.2013.M2microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination.Nat Neurosci 16:1211-1218.)。
鉴于此，调控小胶质细胞的极化状态可能是治疗MS的一种潜在策略。但是目前对于小胶质细胞这一中枢神经系统原位定居的吞噬细胞极化机制知之甚少，对于M2极化的转录机制的调控机制依然不清，对于将小胶质细胞向特定状态极化尚无有效手段，更没有一种方法能将小胶质细胞极化状态由M1型转变并锚定在M2型表型。
MSX3(msh-like homeobox-3,GeneID:17703,NM_010836)序列如SEQ ID NO:7所示，前人研究只在发育阶段的神经系统中发现MSX3的表达,并认为该分子同神经管的腹背侧发育相关(Shimeld,S.M.,McKay,I.J.,and Sharpe,P.T.1996.The murine homeobox gene Msx-3shows highly restricted expression in the developing neural tube.Mech Dev 55:201-210.；Wang,W.,Chen,X.,Xu,H.,and Lufkin,T.1996.Msx3:a novel murine homologue of the Drosophila msh homeobox gene restricted to the dorsal embryonic central nervous system.Mech Dev 58:203-215.)。目前尚无MSX3在小胶质细胞或疾病中的相关研究。
发明内容
本发明的目的在于提供MSX3基因新的医药用途，具体是MSX3基因在制备治疗脱髓鞘疾病、多发性硬化疾病(MS)药物中的应用；以及在促进小胶质细胞转为M2极化状态中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种促进小胶质细胞转为M2极化状态的方法。
本发明的又一目的在于提供上述的促进小胶质细胞转为M2极化状态的方法在制备在治疗多发性硬化疾病(MS)药物中的应用。
本发明的第一方面，提供了MSX3基因在制备治疗脱髓鞘疾病药物中的应用。
所述MSX3的序列如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:3所示，SEQ ID NO:3是第SEQ ID NO:7的第90-704位核苷酸片断，即MSX3开放阅读区、编码序列。
进一步地，所述的脱髓鞘疾病是指多发性硬化。
申请人研究发现MSX3基因(msh-like homebox-3,GeneID:17703, NM_010836)在不同发病阶段的EAE模型小鼠的小胶质细胞中差异表达，在M2型小胶质细胞中选择性高表达。过表达MSX3促进小胶质细胞M2极化，抑制其M1极化。下调小胶质细胞中MSX3水平，加速小鼠脱髓鞘和神经退行性变。而过表达MSX3的小胶质细胞通过结合转录因子PPARγ、STAT6和激酶JAK3，分泌activin-A、IGF-1等细胞因子，促进少突胶质细胞存活、分化和神经突起生长，缓解EAE病情进展，并促进EAE和LPA模型小鼠的再髓鞘化进程。更有意思的是，过表达MSX3的人源性小胶质细胞同样呈现M2表型，并缓解EAE病情进展。本研究揭示了一个驱动小胶质细胞M2极化的同源盒基因依赖性机制，MSX3有望成为促进再髓鞘治疗的一个新靶点。
本发明的第二方面，提供了MSX3基因在促进小胶质细胞转为M2极化状态中的应用。
所述的应用，也即提供了一种促进小胶质细胞转为M2极化状态的方法。
本发明的主要技术方案如下：(一)根据MSX3的基因结构，制备MSX3cDNA序列，构建MSX3过表达的真核表达载体，构建MSX3过表达型(MSX3-GFP)慢病毒。(二)将过表达型慢病毒转染小鼠和人小胶质细胞。(三)用上述慢病毒转染小胶质细胞所得的条件上清与神经元或少突胶质细胞前体细胞共培。(四)MSX3过表达型(MSX3-GFP)慢病毒转染小鼠和人小胶质细胞，并移植入小鼠自身免疫性脑脊髓膜炎(EAE)和溶血卵磷脂(LPA)诱导的脱髓鞘模型小鼠的侧脑室和脊髓中。(五)检测MSX3-GFP慢病毒转染小胶质细胞下游信号通路和分泌因子。
条件上清：慢病毒转染小胶质细胞12小时后为小胶质细胞换新鲜培液,72小时后收集的该培液即为条件上清。
进一步地，所述促进小胶质细胞转为M2极化状态的方法的具体步骤为：经MSX3过表达型(MSX3-GFP)慢病毒转染72小时后呈M2极化状态的小鼠和人小胶质细胞。
A、构建MSX3过表达型(MSX3-GFP)慢病毒
设计并合成引物如下：
P1：GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGCCCGGGCGACATTCGA(SEQ ID NO:1)
P2：TCCTTGTAGTCCATACCAGACAAGTAGTACATGCCATAGGC(SEQ ID NO:2)；
以小鼠小胶质细胞总RNA为模板，通过RT-PCR扩增，制备MSX3cDNA (SEQ ID NO:3)。
MSX3cDNA(SEQ ID NO:3)序列如下：
Atggcccgggcgacattcgacatgaacgcggcggggctcgaagctcgcggcgggggccacacagagcacggaccactccccttcagcgtcgagtctctgctggaggctgagcgcgtaccgggctccgagtctggggagctgggggtggagaggccgctcggcgcctcgaagcctggagcctggccccctccagtcgcgcactcttgtcccccacgtgccccgagccctccaccctgcaccctccgcaaacacaaaaccaatcgcaaaccacggacgccattcaccaccgcgcagctgctggcgcttgagcgcaagtttcaccagaagcaatacttatccattgcggagcgcgccgagttctccagcagcttgagcctcactgagactcaggtcaagatctggtttcagaaccgccgagccaaagccaagcggctgcaggaagctgagctggagaagctgaagctggcagcgaagccactactgccggcggcgtttgccctgcccttcccgctgggcacccagctgcacagctccgcggccactttcggcggcaacgcggttcctgggatcctcgccgggcctgtcgcggcctatggcatgtactacttgtcttag
对获得的MSX3cDNA和慢病毒载体进行酶切；构建含MSX3基因的慢病毒；
B、将步骤A获得的慢病毒转染小胶质细胞，获得MSX3高表达的功能性小胶质细胞。
其中的慢病毒载体的构建方法可参见工具书(萨姆布鲁克拉塞尔主编，分子克隆实验指南III，科学出版社)。也可以用以下的具体步骤：
(1)设计并合成引物如下：
MSX3-Age I-F如SEQ ID NO:1所示，
MSX3-Age I-R如SEQ ID NO:2所示；
(2)采用PCR方法从小鼠小胶质细胞总RNA中钓取目的基因获得线性化模板；
(3)使用Age I对获得的MSX3线性化模板进行酶切；
(4)PCR产物交换进入线性化慢病毒载体，制备过表达质粒Ubi-MSX3-3FLAG-SV40-EGFP(MSX3-GFP)的慢病毒；
(5)MSX3-GFP慢病毒转染小鼠和人小胶质细胞；
(6)将MSX3-GFP慢病毒转染小鼠和人小胶质细胞移植入小鼠自身免疫性脑脊髓膜炎(EAE)和溶血卵磷脂(LPA)诱导的脱髓鞘模型小鼠(构建方法参见Miron,V.E.,Boyd,A.,Zhao,J.W.,Yuen,T.J.,Ruckh,J.M.,Shadrach,J.L.,van Wijngaarden,P.,Wagers,A.J.,Williams,A.,Franklin,R.J.,et al.2013.M2microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination.Nat Neurosci 16:1211-1218.)的侧脑室和脊髓中；
(7)检测MSX3-GFP慢病毒转染小胶质细胞下游信号通路和分泌因子。
其中步骤B参见(Balcaitis,S.,Weinstein,J.R.,Li,S.,Chamberlain,J.S.,and Moller,T.2005.Lentiviral transduction of microglial cells.Glia 50:48-55.)，也可以用以下的具体步骤：
实验前保证细胞的良好生长状态，实验前一天接种1×105个小胶质细胞于24孔培养板中，所加培养基体积为500μL。(细胞的融合率约为30～50％左右)。
(1)先将三个不同梯度的病毒加到各组的相应孔中。加入的病毒量分别为1×105TU，1×106TU，5×106TU，三个孔的感染系数(MOI)分别为1、10、50。
(2)每孔中加入10μL的Polybrene稀释液。
(3)在水平方向轻轻晃动培养板，使培养基和病毒等试剂充分混匀，然后把细胞板放回培养箱孵育。
(4)培养8～12h以后观察细胞状态，弃去细胞上清，更换为新鲜培养基。
(5)感染3～4天后，观察荧光表达情况。对于生长缓慢代谢慢的细胞，可以适当延长观察时间，中途可以换液，保持细胞的活性。
(6)通过细胞感染效果，确认MOI值>10可获得好的感染效果。得到M2极化状态的细胞就可移入小鼠体内进行下一步实验。
(以上第5步所得细胞为M2极化状态的细胞，得到M2极化状态的细胞就可移入小鼠体内进行下一步实验。)
本发明的第三方面，提供了一种促进小胶质细胞转为M2极化状态的方法，该方法包括但不限于：
A、构建MSX3过表达的慢病毒；
设计并合成引物如下：
P1：GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGCCCGGGCGACATTCGA(SEQ ID NO:1)
P2：TCCTTGTAGTCCATACCAGACAAGTAGTACATGCCATAGGC(SEQ ID NO:2)；
以小鼠小胶质细胞总RNA为模板，通过RT-PCR扩增，制备MSX3cDNA(SEQ ID NO:3)；
对获得的MSX3cDNA和慢病毒载体进行酶切；构建含MSX3基因的慢病毒；
B、将步骤A获得的慢病毒转染小胶质细胞，获得MSX3高表达的功能性小胶质细胞。
进一步地，本发明还提供上述的促进小胶质细胞转为M2极化状态的方法在制备在治疗多发性硬化疾病(MS)药物中的应用。
用原位杂交和细胞组化方法验证并观察转染小鼠小胶质细胞的MSX3核酸水平和形态变化。实验结果：镜下可见下调MSX3核酸水平的小胶质细胞呈阿米巴样形态，符合M1极化特征，上调MSX3核酸水平的小胶质细胞呈分支样，符合M2极化特征。
用上述慢病毒转染小胶质细胞所得的条件上清与神经元或少突胶质细胞前体细胞共培，检测神经元或少突胶质细胞前体细胞生存力、分化和退行性变。MSX3干扰病毒转染的小胶质细胞的条件上清对神经元存在毒性作用，并抑制少突胶质细胞前体细胞的分化成熟，而MSX3过表达型慢病毒转染小鼠小胶质细胞促进少突胶质细胞前体细胞的分化成熟。
构建小鼠自身免疫性脑脊髓膜炎(EAE)和溶血卵磷脂(LPA)诱导的脱髓鞘模型小鼠。将MSX3过表达型(MSX3-GFP)慢病毒转染小鼠和人小胶质细胞，并采用脑立体定位手术将细胞移植入小鼠自身免疫性脑脊髓膜炎(EAE)和溶血卵磷脂(LPA)诱导的脱髓鞘模型小鼠的侧脑室和脊髓中。MSX3过表达型(MSX3-GFP)慢病毒转染小鼠和人小胶质细胞均明显抑制了EAE病情进展，减少局部炎细胞浸润，并促进脊髓神经轴突的再髓鞘化。
采用RNA-IP、Q-PCR、ELISA在小胶质细胞中检测MSX3下游信号通路和特异细胞分泌因子。结果发现过表达MSX3的小胶质细胞通过结合转录因子PPARγ、STAT6和激酶JAK3，分泌IGF-1等细胞因子，促进少突胶质细胞存活、分化和神经突起生长，缓解EAE病情进展，并促进EAE和LPA模型小鼠的再髓鞘化进程。
本发明的第四方面，提供了上述促进小胶质细胞转为M2极化状态的方法得到的功能性小胶质细胞。
本发明的第五方面，提供了上述功能性小胶质细胞在制备治疗脱髓鞘疾病中的应用。
如前所述，M2型小胶质细胞的缺失很可能是导致慢性非活动性MS病灶处再髓鞘失败的重要因素。目前对于小胶质细胞这一中枢神经系统原位定居的吞噬细胞极化机制知之甚少，对于将小胶质细胞向特定状态极化尚无有 效手段，我们的研究发现上调MSX3可以将小胶质细胞锚定在M2型极化状态(图2)，并从体外和体内实验证明其能促进脱髓鞘病灶再髓鞘化和神经突起生长(图4，6，7)。更有意思的是，过表达MSX3的人源性小胶质细胞同样呈现M2表型，显著缓解EAE病情进展。综上，MSX3有望成为促进再髓鞘治疗的一个新靶点。
此外，发明人对抑制其M1极化也作了相关研究。
本发明的主要技术方案如下：(一)根据MSX3的基因结构，制备MSX3干扰RNA序列，构建MSX3干扰的真核表达载体，构建MSX3干扰型(MSX3i-GFP)慢病毒。(二)将过干扰型慢病毒转染小鼠和人小胶质细胞。(三)用上述慢病毒转染小胶质细胞所得的条件上清与神经元或少突胶质细胞前体细胞共培。(四)MSX3干扰型(MSX3i-GFP)慢病毒转染小鼠和人小胶质细胞，并移植入小鼠自身免疫性脑脊髓膜炎(EAE)和溶血卵磷脂(LPA)诱导的脱髓鞘模型小鼠的侧脑室和脊髓中。(五)检测MSX3-GFP慢病毒转染小胶质细胞下游信号通路和分泌因子。
MSX3干扰型(MSX3i-GFP)慢病毒构建。该方法包括：
A、构建MSX3干扰型(MSX3i-GFP)慢病毒载体；
B、将MSX3干扰型(MSX3i-GFP)慢病毒转染小鼠和人小胶质细胞。
该方法具体包括
A、筛选并确定MSX3基因特定的干扰序列为：
5’-GAGCATCTCAGATCTCCCATT-3’(SEQ ID NO:4),
5’-CAGGGTTAGGATGCTCTGGTT-3’(SEQ ID NO:5),
5’-AATCCGGACTTGTACCTTTAT-3’(SEQ ID NO:6)；
B、连接到pGCL-GFP慢病毒载体中，构建MSX3干扰型(MSX3i-GFP)慢病毒为：pGCL-MSX3i-GFP；
C、MSX3i-GFP慢病毒转染小鼠小胶质细胞；
D、将MSX3i-GFP慢病毒转染小鼠小胶质细胞移植入小鼠自身免疫性脑脊髓膜炎(EAE)的脱髓鞘模型小鼠的侧脑室中。
实验发现，上调MSX3表达的小鼠和人小胶质细胞转为M2极化状态，分泌促神经生长因子和促少突胶质细胞分化和成髓鞘化的细胞因子。下调MSX3表达的小鼠和人小胶质细胞转为M1极化状态，分泌免疫炎症因子，加速神经元退行性变，抑制少突胶质细胞分化和再髓鞘化。
通过整体动物实验发现，小胶质细胞中的MSX3在EAE病程中整体上升，但在不同发病阶段差异表达，峰值期达峰，后期逐步下调；进一步在体外实验中发现其在M2极化小胶质细胞中上调，24小时达到高峰(图1)。过表达MSX3抑制小胶质细胞M1极化和阿米巴样形态(图2，3)，促进其M2极化(图2)。共培实验中下调小胶质细胞中MSX3水平，加速小鼠神经突起退行性变，而上调MSX3水平，促进少突胶质细胞存活、分化和神经突起生长(图4)。将过表达MSX3的小胶质细胞移植到EAE小鼠的实验显示，过表达MSX3的小胶质细胞缓解EAE病情进展，减少继发性炎细胞浸润和脱髓鞘程度，并促进EAE和LPA模型小鼠的再髓鞘化进程(图5，6，7)。而过表达MSX3的小胶质细胞通过结合转录因子PPARγ、STAT6和激酶JAK3，分泌activin-A、IGF-1等细胞因子，促进少突胶质细胞存活、分化和神经突起生长。本研究揭示了一个驱动小胶质细胞M2极化的同源盒基因依赖性机制。
附图说明
图1，调控MSX3调节小鼠小胶质细胞极化状态；(A-D)病毒转染调控小鼠小胶质细胞MSX3水平，Q-PCR观察小胶质细胞极化。(A，B)下调MSX3水平，促进小胶质细胞M1极化，抑制M2极化；(C，D)上调MSX3水平，促进小胶质细胞M2极化，抑制M1极化。
图2，上调MSX3促小鼠少突胶质细胞前体细胞分化和神经突起生长；(A)下调小胶质细胞中MSX3水平抑制少突胶质细胞前体细胞分化成熟。(B)调节小胶质细胞的MSX3水平对皮层神经元的突起有损伤和保护作用。
图3，过表达MSX3的小鼠小胶质细胞缓解EAE进展；(A)移植MSX3过表达(MSX3OE MG)和干扰(MSX3i MG)小胶质细胞的EAE小鼠病情评分，(B,C)病变脊髓LFB染色检测白质脱髓鞘程度，(D,E)病变脊髓H-E染色观察炎细胞浸润程度。星号，脱髓鞘部位，箭头，炎细胞浸润部位。(B，D)右图为方框放大图。
图4，过表达MSX3的小鼠小胶质细胞促进再髓鞘化；(A)EAE评分，(B)脊髓电镜代表图，(C)小鼠成髓鞘轴突百分比，(D)病灶处脊髓平均有髓神经纤维G值。
图5，过表达MSX3的小鼠小胶质细胞促LPC模型小鼠再髓鞘化进程；(A， B)病灶处脊髓背侧脱髓鞘面积LFB染色及定量分析，(C-E)电镜检测脊髓成髓鞘轴突百分比(D)，平均有髓神经纤维G值(E)。
图6，过表达MSX3的人小胶质细胞呈M2极化，并缓解EAE进展；(A，B)过表达MSX3的小胶质细胞上调IGF-1和CD206水平，下调TNF-α水平，向M2极化；(C)过表达MSX3的人源小胶质细胞移植入EAE小鼠可缓解EAE病情进展。
图7，MSX3激活转录因子PPARγ、STAT6和激酶JAK3相关M2极化信号通路。(A-C)染色质免疫共沉淀检测发现MSX3可结合PPARγ、STAT6和激酶JAK3的3’非编码区段，(D-F)免疫印迹检测可见过表达MSX3诱导PPARγ、STAT6和JAK3表达上调，同时STAT6磷酸化增加。MSX3结合PPARγ、STAT6、JAK3并上调PPARγ、STAT6、JAK3蛋白水平和磷酸化STAT6的蛋白水平。(A-C)MSX3可结合在PPARγ、STAT6、JAK3的3’UTR。(D-F)MSX3可以上调PPARγ、STAT6、JAK3蛋白水平和(7E)磷酸化STAT6的蛋白水平。
具体实施方式
现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。
本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如萨姆布鲁克、拉塞尔主编《分子克隆实验指南III》(科学出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1：构建慢病毒过表达MSX3-GFP和干扰MSX3i-GFP，感染小鼠和人小胶质细胞。
1、小胶质细胞纯化制备
原代培养制备小鼠小胶质细胞。人小胶质细胞来自SCIENCELL公司。
2、制备小胶质细胞总RNA
用上海生工生物工程有限公司总RNA抽提试剂盒，按常规的异硫氰酸胍法提取获得人表皮细胞总RNA。方法如下：
取一皿直径3.5cm的培养皿的单层生长的小胶质细胞，直接弃去培养基，加入1ml的TRIzol溶解细胞，细胞充分溶解后，用移液管将细胞裂解物移出。 将细胞裂解样品在15～30℃条件下孵育5分钟，使核蛋白体完全分解。每1ml TRIzol加0.2ml氯仿，盖紧样品管盖后用手摇晃试管15秒并在30℃下孵育2～3分钟。在2～8℃条件下以不超过12,000×g的离心力冷冻离心15分钟。离心后的混合物可分成三层：下层为红色的苯酚-氯仿层，中间层和上层无色的水样层。RNA存在于上层水样层当中，其容量大约为所加TRIzol容量的60％。将水样层转移到一用DEPC处理过的，无RNase的试管中，通过跟异丙醇混合来沉淀RNA。每1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇。将混合的样品在15～30℃条件下孵育10分钟然后在2～8℃条件下以不超过12,000×g的离心力高速冷冻离心10分钟。RNA沉淀在离心后可以形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。用75％的乙醇(用DEPC处理过的超纯水进行配制)洗涤RNA沉淀一次，每1ml的TRIzol至少加入1ml的75％乙醇。旋涡振荡混合样品并在2～8℃条件下以不超过7,500×g的离心力高速冷冻离心5分钟。空气干燥5～10分钟RNA沉淀。不能让RNA沉淀完全干燥，会降低它的可溶性。用DEPC处理过的超纯水溶解RNA样品。
3、构建MSX3过表达型(MSX3-GFP)慢病毒和干扰型(MSX3i-GFP)慢病毒
A、设计并合成引物如下：
MSX3-Age I-F：
GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGCCCGGGCGACATTCGA(SEQ ID NO:1)
MSX3-Age I-R：
TCCTTGTAGTCCATACCAGACAAGTAGTACATGCCATAGGC(SEQ ID NO:2)
采用PCR方法从小鼠小胶质细胞总RNA中钓取目的基因获得线性化模板，方法如下：反应体系：P1 0.4μL，P2 0.4μL，10×缓冲液2.0μL，MgCl20.5μL，dNTPs(2.5mmol/L)0.8μL，Taq多聚酶0.2μL，模板1μL(阴性对照组不加)，由ddH2O配置为20μL。PCR反应条件：94℃热启动30s→94℃变性30s→60℃复性30s→72℃延伸30s，30个循环，最后72℃聚合6min。得到MSX3cDNA(SEQ ID NO:3)。
挑选阳性克隆，送生工公司进行测序鉴定，测序正确。
使用Age I对获得的MSX3线性化模板进行酶切；
酶切反应体系：
37℃反应2小时。
PCR产物交换进入线性化慢病毒载体，制备过表达质粒Ubi-MSX3-3FLAG-SV40-EGFP(MSX3-GFP)的慢病毒；
于25℃反应30分钟,再于42℃反应15分钟制备交换液，准备转化。
转化步骤如下：
用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，每管加10μl连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟。将管放到预加温到42℃的循环水浴中放好的EP管架上，放置90秒，不要摇动EP管架。快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却l—2分钟。每管加800μl LB培养基。用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45分钟使细菌复苏。将150μl已转化的感受态细胞转移到AMP抗性(100ug/ml)的LB琼脂培养基上。
将平板置于室温直至液体被吸收。倒置平皿，于37℃培养，16小时。长出的克隆进行后续PCR鉴定。鉴定正确的作慢病毒包装及滴度鉴定。
B、筛选并确定MSX3基因特定的干扰序列为：
5’-GAGCATCTCAGATCTCCCATT-3’(SEQ ID NO:4),
5’-CAGGGTTAGGATGCTCTGGTT-3’(SEQ ID NO:5),
5’-AATCCGGACTTGTACCTTTAT-3’(SEQ ID NO:6)；
连接到pGCL-GFP慢病毒载体中，构建MSX3干扰型(MSX3i-GFP)慢病毒质粒：pGCL-MSX3i-GFP；
鉴定及测序；
用上述重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5α，扩增细菌并测序；
慢病毒包装及滴度鉴定。
4、MSX3过表达和干扰病毒转染小鼠和人小胶质细胞；
实验前保证细胞的良好生长状态，实验前一天接种1×105个细胞于24孔培养板中，所加培养基体积为500μL。(细胞的融合率约为30～50％左右)。
(1)先将三个不同梯度的病毒加到各组的相应孔中。加入的病毒量分别为1×105TU，1×106TU，5×106TU，三个孔的感染系数(MOI)分别为1、10、50。
(2)每孔中加入10μL的Polybrene稀释液。
(3)在水平方向轻轻晃动培养板，使培养基和病毒等试剂充分混匀，然后把细胞板放回培养箱孵育。
(4)培养8～12h以后观察细胞状态，弃去细胞上清，更换为新鲜培养基。
(5)感染3～4天后，观察荧光表达情况。对于生长缓慢代谢慢的细胞，可以适当延长观察时间，中途可以换液，保持细胞的活性。
(6)通过细胞感染效果，确认MOI值>10可获得好的感染效果。
(7)将MSX3过表达和干扰的对照用病毒载体感染后的小胶质细胞分别称之为MGCtrlOE和MGCtrli，MSX3过表达和干扰的病毒载体感染后并经IL-4刺激的小胶质细胞分别称之为MGMSX3OE和MGMSX3i+IL-4。
5.病毒载体感染前后的小胶质细胞中M1型与M2型的水平测定
结果如图1所示，调控MSX3调节小鼠小胶质细胞极化状态。(A，B)下调MSX3水平，上调小胶质细胞IL-1β、i NOS、TNF-α，促进小胶质细胞M1极化，同时下调IGF-1、CD206、FIZZ-1，抑制M2极化；(C，D)上调MSX3水平，上调小胶质细胞IGF-1、CD206、FIZZ-1，促进小胶质细胞M2极化，下调小胶质细胞IL-1β、i NOS、TNF-α，抑制M1极化。
实施例2：细胞实验(体外实验)
利用免疫细胞化学等生物学实验方法，从细胞形态、髓鞘相关蛋白表达(MBP)等多方面分析细胞形态变化，目的基因表达、细胞生存力，轴突生长和成髓鞘情况。
具体方法如下：
1)免疫细胞化学法检测OPC分化和神经元突起生长
(1)将实施例1中步骤4(7)得到的MSX3干扰型和过表达型病毒转染小胶质细胞，24小时后换液，培养3天，收集条件上清与OPC(Oligodendrocyte precursor cell，少突胶质细胞前体细胞)(10 000个细胞/孔接种于24孔板)或皮层和海马神经元(10 000个细胞/孔接种于24孔板)共培120小时。每个时间点每组细胞做3复孔，实验重复3次。
(2)分为6组：MSX3i组，Ctrli组，MSX3i+IL-4组，Ctrli+IL-4组，MSX3OE组，CtrlOE组。
(3)4％BSA封闭非特异性结合位点
(4)1：200的浓度加入一抗
(5)37度孵育半小时
(6)PBS洗3遍
(7)1：500的浓度加入二抗
(8)PBS洗3遍
(9)封片，镜检。
实验结果表明，MSX3过表达慢病毒转染小胶质细胞的条件上清促进OPC分化和神经突起延伸，MSX3抑制慢病毒转染小胶质细胞的条件上清抑制OPC分化，并导致神经元退行性变。如图2所示上调MSX3促小鼠少突胶质细胞前体细胞分化和神经突起生长。(A)下调小胶质细胞中MSX3水平抑制少突胶质细胞前体细胞分化成熟；(B)调节小胶质细胞的MSX3水平对皮层神经元的突起有损伤和保护作用。
实施例3：体内细胞移植试验
实验所用小鼠为雌性C57BL/6品系，SPF级。体重约20～25g，8周龄，购自上海实验动物中心。共40只，分5组病毒转染组：Ctrli组(对照干扰病毒转染72小时)，MSX3i+IL-4组(MSX3干扰病毒转染72小时同时IL-4刺 激24小时)，Ctrli+IL-4组(对照干扰病毒转染72小时同时IL-4刺激24小时)，MSX3OE组(MSX3过表达病毒转染72小时)，CtrlOE组(对照过表达病毒转染72小时)。用10μl注射器抽取实施例1步骤4所得的MGCtrli、MGCtrli+IL-4、MGMSX3i+IL-4、MGCtrlOE和MGMSX3OE细胞离心各制备2μl细胞悬液于EAE造模后第8天移植入小鼠侧脑室，细胞量为106个。SPF级条件下喂养、每日观察评分，移植4周后取材。
对各组小鼠分离固定脊髓组织，冰冻切片，做H-E染色和LFB染色，显微镜下观察发现：过表达MSX3的小胶质细胞缓解EAE病情进展，减少继发性炎细胞浸润和脱髓鞘程度，并促进EAE模型小鼠的再髓鞘化进程(图3)。
具体方法如下：
1)苏木精-伊红(HE)染色和LFB(Luxol fast blue)染色；
方法同常规石蜡切片苏木精-伊红(HE)染色和LFB染色。镜下可见炎细胞浸润和脱髓鞘程度，如图3所示。
2)电镜检测脱髓鞘脊髓重新再髓鞘水平；
脊髓标本行2.5％glutaraldehyde和1％osmium tetroxide固定，脱水包埋。半薄切片行toluidine blue染色。超薄切片行uranyl acetate和lead citrate染色。透射电镜(Hitachi H-7650,Japan)镜检(100KV)。
如图4所示，用10μl注射器抽取实施例1步骤4所得的MGCtrlOE和MGMSX3OE细胞离心各制备2μl细胞悬液于EAE造模后第22天移植入小鼠侧脑室，细胞量各为106个。于造模后第40天取脊髓电镜检测，如图4所示，MSX3OE小胶质细胞移植组小鼠成髓鞘轴突百分比明显增加，G值更接近正常对照组(组)。
实施例4：体内细胞移植试验
实验所用小鼠为雌性C57BL/6品系，SPF级。体重约20～25g，8周龄，购自上海实验动物中心。共20只，分2组病毒转染组：MSX3OE组(MSX3过表达病毒转染72小时)，CtrlOE组(对照过表达病毒转染72小时)。用10μl注射器抽取MGCtrlOE和MGMSX3OE转染的小鼠小胶质细胞离心各制备2μl细胞悬液于LPA造模后第3天移植入小鼠损伤局部，细胞量为106个。SPF级条件下喂养、每日观察评分，移植10天后取材。
对各组小鼠分离固定脊髓组织，冰冻切片，做LFB染色，显微镜下观察 发现：过表达MSX3的小胶质细胞促进LPA模型小鼠的再髓鞘化进程(图5)。
具体方法如下：
1)LFB(Luxol fast blue)染色；
方法同常规石蜡切片LFB染色。镜下可见脊髓背侧脱髓鞘面积，如图5A-B所示。
2)电镜检测脱髓鞘脊髓重新再髓鞘水平；
脊髓标本行2.5％glutaraldehyde和1％osmium tetroxide固定，脱水包埋。半薄切片行toluidine blue染色。超薄切片行uranyl acetate和lead citrate染色。透射电镜(Hitachi H-7650,Japan)镜检(100KV)。
如图5C-E所示，MSX3OE小胶质细胞移植组小鼠成髓鞘轴突百分比明显增加，G值低于对照组。
实施例5：体内人源细胞移植试验
实验所用小鼠为雌性C57BL/6品系，SPF级。体重约20～25g，8周龄，购自上海实验动物中心。共20只，分2组病毒转染人源性小胶质细胞组：MSX3OE组(MSX3过表达病毒转染72小时)，CtrlOE组(对照过表达病毒转染72小时)。用10μl注射器抽取MSX3OE组和CtrlOE组细胞离心各制备2μl细胞悬液于EAE造模后第8天移植入小鼠侧脑室，细胞量为106个。SPF级条件下喂养、每日观察评分。
观察发现：(图6A-B)过表达MSX3的小胶质细胞上调IGF-1和CD206水平，下调TNF-α水平，向M2极化；(图6C)缓解EAE病情进展。
实施例6：信号通路研究
2组病毒转染组：MSX3OE组(MSX3过表达病毒转染72小时)，CtrlOE组(对照过表达病毒转染72小时)小胶质细胞行染色质共沉淀检测MSX3结合基因3’UTR位置，如图7A-C所示，MSX3可结合在PPARγ、STAT6、JAK3的3’UTR上。进一步发现MSX3可以上调PPARγ、STAT6、JAK3蛋白水平(图7D-F)和磷酸化STAT6的蛋白水平(图7E)。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行 业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Claims (10)
1.MSX3基因在制备治疗脱髓鞘疾病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的所述的MSX3基因在制备治疗脱髓鞘疾病药物中的应用，其特征在于，其中所述脱髓鞘疾病是指多发性硬化。
3.MSX3基因在促进小胶质细胞转为M2极化状态中的应用。
4.根据权利要求3所述的MSX3基因在促进小胶质细胞转为M2极化状态中的应用，其特征在于，所述的应用为一种促进小胶质细胞转为M2极化状态的方法，具体步骤为：
A、构建MSX3过表达型慢病毒
设计并合成引物如下：
P1如SEQ ID NO:1所示；
P2如SEQ ID NO:2所示；
以小鼠小胶质细胞总RNA为模板，通过RT-PCR扩增，制备MSX3cDNA，MSX3cDNA的序列如SEQ ID NO:3所示；
对获得的MSX3cDNA和慢病毒载体进行酶切；构建含MSX3基因的慢病毒；
B、将步骤A获得的慢病毒转染小胶质细胞，获得MSX3高表达的功能性小胶质细胞。
5.根据权利要求4所述的MSX3基因在促进小胶质细胞转为M2极化状态中的应用，其特征在于，其中的步骤A中采用PCR方法从小鼠小胶质细胞总RNA中钓取目的基因获得线性化模板；
使用Age I对获得的MSX3线性化模板进行酶切；
PCR产物交换进入线性化慢病毒载体，制备过表达MSX3的慢病毒MSX3-GFP；
MSX3-GFP慢病毒转染小鼠或人小胶质细胞。
6.根据权利要求4所述的MSX3基因在促进小胶质细胞转为M2极化状态中的应用，其特征在于，其中步骤B的具体步骤为：
实验前一天接种1×105个小胶质细胞于24孔培养板中，所加培养基体积为500μL，细胞的融合率约为30～50％；
先将三个不同梯度的病毒加到各组的相应孔中，加入的病毒量分别为1×105TU，1×106TU，5×106TU，三个孔的感染系数分别为1、10、50；
每孔中加入10μL的Polybrene稀释液；
在水平方向轻轻晃动培养板，使培养基和病毒等试剂充分混匀，然后把细胞板放回培养箱孵育；
培养8～12h以后观察细胞状态，弃去细胞上清，更换为新鲜培养基；
感染3～4天后，观察荧光表达情况；对于生长缓慢代谢慢的细胞，延长观察时间，中途换液，保持细胞的活性；
选择MOI值>10的M2极化状态的细胞。
7.一种促进小胶质细胞转为M2极化状态的方法，该方法包括但不限于：
A、构建MSX3过表达的慢病毒；
设计并合成引物如下：
P1：SEQ ID NO:1
P2：SEQ ID NO:2；
以小鼠小胶质细胞总RNA为模板，通过RT-PCR扩增，制备MSX3cDNA，MSX3cDNA的序列如SEQ ID NO:3所示；
对获得的MSX3cDNA和慢病毒载体进行酶切；构建含MSX3基因的慢病毒；
B、将步骤A获得的慢病毒转染小胶质细胞，获得MSX3高表达的功能性小胶质细胞。
8.权利要求7所述的促进小胶质细胞转为M2极化状态的方法在制备在治疗多发性硬化疾病药物中的应用。
9.权利要求7所述的促进小胶质细胞转为M2极化状态的方法得到的功能性小胶质细胞。
10.权利要求9所述的功能性小胶质细胞在制备治疗脱髓鞘疾病中的应用。
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