CN104825473A

CN104825473A - 阿司匹林在制备治疗脑铁代谢沉积药物的应用

Info

Publication number: CN104825473A
Application number: CN201510220451.0A
Authority: CN
Inventors: 钱忠明; 徐艳新; 柯亚
Original assignee: First Affiliated Hospital of TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU; First Affiliated Hospital of TMMU
Priority date: 2015-05-04
Filing date: 2015-05-04
Publication date: 2015-08-12

Abstract

本发明提供了阿司匹林在制药领域的新用途，其具有新的药效，即阿司匹林在制备治疗脑铁代谢沉积药物中的应用以及阿司匹林在制备治疗脑神经系统损伤药物中的应用。本发明提供了使我们更深入的了解ASA的药理作用，并为脑铁沉积导致的有关神经性疾病寻求治疗方法提供新的方法。

Description

阿司匹林在制备治疗脑铁代谢沉积药物的应用

技术领域

本发明涉及阿司匹林的医药新用途。

背景技术

阿司匹林(acetylsalicylic acid，ASA)，化学学名邻-乙酰水杨酸，醋柳酸等，IUPAC命名法为2-乙酰氧基苯甲酸。由德国化学家菲力克斯·霍夫曼在20世纪初正式推出。阿司匹林治疗范围极广，包括感冒、发热、头痛、牙痛、关节炎痛症、风湿痛症等，还能预防手术后血栓形成、心肌梗塞和中风，故俗称它为“万灵药”。

之前有研究表明ASA增加血管内皮细胞feritin蛋白的表达，作为一种新的抗氧化机制来发挥细胞保护作用的。其研究对象是用内皮细胞作为研究对象，研究ASA对抗H₂O₂损伤的作用H2O2诱导的血管内皮损伤经常被用作动脉粥样硬化、心血管疾病的模型研究，通过脂质过氧化，氧化应激来造成损伤作用的。研究范围主要对ferritin蛋白进行研究，并认为ASA通过增加ferritin蛋白的表达来发挥抗过氧化损伤的。

发明内容

本发明的目的在于提供阿司匹林在制药领域的新用途，其具有新的药效。

本发明的技术方案为：

阿司匹林在制备预防或治疗脑铁代谢沉积药物中的应用。

阿司匹林在调节中枢神经细胞的脑铁代谢蛋白中的应用。

阿司匹林在调节神经元和/或小胶质细胞的脑铁代谢蛋白中的应用。

阿司匹林在制备预防或治疗脑神经系统损伤药物中的应用。

阿司匹林在制备预防或治疗脑神经炎性损伤药物中的应用。

阿司匹林在改善小胶质细胞炎症损伤中的应用。

阿司匹林在制备治疗或者预防脑铁过载的神经炎性疾病药物中的应用。

本发明提供了阿司匹林可以影响脑铁代谢，减少脑铁积聚，从而减少铁导致的脑神经元损伤，使我们更深入的了解ASA的药理作用，并为脑铁沉积导致的有关神经性疾病寻求治疗方法提供理论依据。

本研究采用BV-2小胶质细胞和神经元为研究对象，研究了ASA对脑铁代谢的影响。异常的铁沉积以及一些脑铁过载的神经性疾病伴随着胶质细胞尤其是小胶质细胞激活为主要特征的神经炎症反应的发生发展，过度产生的小胶质细胞激活的炎症反应将导致神经元的损伤、变性甚至死亡。本研究以LPS诱导的小胶质细胞为模型，研究ASA在炎症情况下对中枢系统铁代谢的影响；这与内皮细胞是完全不同的研究对象，所模拟的疾病类型以及ASA所起的作用和类型完全不同。

由于铁代谢是由很多相关蛋白参与的一个过程。本研究将ASA对脑铁代谢蛋白的影响进行了系统的研究，在BV-2和原代神经元上检测了转铁蛋白受体(Transferrin receptor，TfR)，二甲金属离子转运体(DMT1)，储铁蛋白(Ferritin-L，FTL)，膜铁转运蛋白(FpN，Ferroportin)等相关蛋白的变化情况。本研究是直接的对ASA和脑铁代谢关系进行展开的，并且在不造成细胞损伤的低剂量的ASA(0.1mM)对几种蛋白的作用效果都很显著，对于治疗和预防脑铁过载以及神经炎性疾病具有重要的意义。

脑内铁的转运有两种形式：Tf-Fe，即Fe³⁺要先绑定到Tf上被转运，另一种形式非Tf结合铁(NTBI)，主要通过DMT1或者三价阳离子转运体(TCT)，转运进入细胞的脑铁，一部分被细胞代谢所利用，游离的铁将被储存在ferritin中，其中1/3-3/4脑铁被储存在铁蛋白中，FpN，作为目前发现的唯一一个铁输出蛋白，在脑内广泛表达，若脑内铁浓度过高，过量的铁可以通过FpN被输出，从而其对于保护神经细胞免受铁诱导的氧化损伤有重要的意义。

LPS刺激的BV-2细胞常被用来作为体外炎症模型进行研究。根据现有的条件，我们首先对ASA在BV-2细胞上对铁代谢相关蛋白的影响进行研究.

1.生理条件下，ASA下调了TfR、DMT1+IRE蛋白的表达，上调了FTL、FpN蛋白的表达

Western blotting结果(图4)显示，ASA能够降低铁摄取蛋白TfR1和DMT+IRE的表达，增加铁储存蛋白FTL和铁输出蛋白FpN表达。这一数据说明ASA可以直接改变铁代谢蛋白的表达，从而减少细胞内铁的水平。

2.炎症情况下，ASA对铁代谢蛋白的影响

①ASA阻止LPS导致的细胞活力的下降以及LPS导致的NO生成的增加

从MTT实验结果(图2)可以看出ASA对LPS导致的细胞损伤具有保护作用。LPS刺激BV-2细胞，显著导致了NO的生成，NO在免疫和炎症反应上是很重要的调控器，ASA可以抑制LPS导致的NO的生成，并且在较高浓度抑制作用明显。说明LPS刺激明显增加了炎症反应，而ASA抑制了炎症反应的发生。

②ASA对LPS导致的铁代谢蛋白变化的影响

本发明结果显示ASA抑制了LPS引起的TfR、FpN的下调以及FTL的上调。ASA可以逆转LPS刺激引起的改变。

结论：

一.ASA在BV-2细胞上的铁代谢蛋白的影响研究：

1.生理情况下，0.01mM，0.1mM ASA可以降低摄铁蛋白TfR1和DMT1+IRE的表达以及增加储存铁蛋白FTL和输出铁的蛋白FpN的表达。

2.在炎症情况下，ASA在0.01和0.1mM浓度时可以改善LPS导致的BV-2细胞细胞活力的下降；

3.在较高浓度(4mM)，ASA可以明显减少LPS诱导的NO的生成；

4.ASA可以抑制LPS诱导的TfR蛋白的降低，并且这与对TfR mRNA作用趋势一致，ASA也可以抑制LPS导致的FTL表达的增加以及Fpn1表达的降低，并且作用的最适宜浓度为0.1mM，而对于LPS诱导的FTL、Fpn1 mRNA的变化没有影响，说明是转录后调控；

5.在高铁情况下，TfR和DMT1+IRE水平显著下降，FTL水平显著升高；在低铁环境下，TfR和DMT1+IRE稍升高，FTL表达量很低，ASA可以促进TfR蛋白表达降低，以及FTL蛋白表达的升高，对DMT1+IRE没有影响；在低铁环境下，ASA对几种蛋白的表达基本上都没有影响，

二.ASA在神经元上铁代谢蛋白的影响研究：0.1mM ASA显著降低了DMT1的表达，以及升高FpN和FTL的表达，这与ASA在BV-2细胞上对两种蛋白影响是一致的；但是对TfR蛋白表达影响不显著。

综上所述，本发明表明：非甾体抗炎药ASA可以影响神经细胞内铁代谢，ASA可以用于预防或者治疗脑铁过载导致的神经性疾病，如AD，PD等，从而使我们更深入的了解脑铁过载导致的神经性疾病的病因以及ASA的药理作用，并为脑铁过载导致的神经性疾病寻求治疗方法提供新的方法。

本发明可以将阿司匹林与药学上可接受的辅料一起配制。

附图说明

图1阿司匹林对BV-2细胞活力的影响

BV-2细胞用不同浓度的ASA(0.01-4mM)，对照用0.1％乙醇溶剂孵育24h。用MTT比色法检测细胞活力。以对照的百分比来表示结果。

图2阿司匹林在LPS刺激的BV-2细胞活力的影响

Bv-2细胞用溶剂(0.1％乙醇)和不同浓度的ASA(0.01，0.1，1和4mM)提前孵育30min，然后再用1μg/ml LPS共处理24h。用MTT比色法检测细胞活力。用三组独立实验的平均值±标准差来表示结果。与对照组比，.*p＜0.05；与LPS处理组比，#p＜0.05。

图3阿司匹林对脂多糖诱导的BV-2细胞产生的NO含量的影响

BV-2细胞用溶剂(0.1％乙醇)和不同浓度的ASA(0.01，0.1，1和4mM)预处理30min，然后再用1μg/ml LPS共处理24h。用Griess反应检测NO的生成量。用三组独立实验的平均值±标准差来表示结果。与对照组比，**.*p＜0.001；与LPS处理组比，###p＜0.001。

图4不同浓度阿司匹林对TfR，FpN，FTL and DMT1+IRE蛋白表达的影响

BV-2细胞用溶剂(0.1％乙醇)和不同浓度的ASA(0.01，0.1，1，2和4mM)孵育24h。用Western blot检测技术分析TfR，FpN，FTL和β-actin蛋白的表达。(A)图代表TfR，FpN，FTL and β-actin的western blot条带；(B)图代表DMT+IRE和β-actin的western blot条带；(C)，(D)，(E)和(F)图分别代表定量的TfR，FpN，FTL和DMT+IRE；结果用至少三组独立的实验的平均值±标准差表示；与对照组相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.01。

图5ASA对LPS诱导的TfR，FTL，FTH，FpN蛋白变化的影响

BV-2细胞用溶剂(0.1％乙醇)和不同浓度的ASA(0.01，0.1，1和4mM)预处理30min，然后再用1μg/ml LPS共处理24h。用Western blot检测技术分析TfR(A)，FTL(B)，FTH(C)，FpN(D)和β-actin蛋白的表达；结果用至少三组独立的实验的平均值±标准差表示；与对照组相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.01，与LPS处理组相比，#p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.001。

图6在高铁或者低铁情况下，ASA对TfR、FTL和DMT+IRE蛋白表达的影响。

BV-2细胞用FeCl₃(100μM)或DFO(100μM)预处理6h，然后再用0.1mMASA共处理24h。用western blot检测技术分析TfR，FTL和DMT+IRE蛋白的表达。

图7在原代培养的神经元细胞上，不同浓度阿司匹林对TfR，DMT1，FpN andFTL蛋白表达的影响

原代培养的神经元细胞用溶剂(0.1％乙醇)和不同浓度的ASA(0.01，0.1，1，2和4mM)孵育24h。用Western blot检测技术分析TfR，DMT1，FpN，FTL和β-actin蛋白的表达，(A)，(B)，(C)，(D)分别代表TfR，DMT1，FpN和FTL蛋白的western blot条带。

具体实施方式

下面将具体描述本发明，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1

选用BV-2鼠小胶质瘤细胞为研究对象，采用MTT法检测细胞的活性，Griess法检测NO的生成量，Real-time PCR法、Western blotting方法来探讨在生理、炎症情况下，ASA对铁代谢蛋白相关基因和蛋白水平表达的影响。

一.实验方法

1.培养的BV-2细胞，分别以6×10⁴cells/ml，4×10⁵cells/ml接种于96孔和6孔细胞培养板；

2.(1)接种12-24h后，弃去旧培养基，加入用DMEM稀释的不同浓度的ASA作用24h，进行MTT细胞活力检测和western blot蛋白水平检测；

(2)实验组加不同浓度的ASA，对照组加入含有0.01％ethanol无血清培养基，先提前孵育30min，再加入1μg/ml LPS作用24h，进行MTT活力检测和NO检测和western blot蛋白检测。

二.实验结果

1.阿司匹林对BV-2小胶质细胞的活力的影响

如图1所示，当ASA作用浓度为0.01，0.1，1mM时，与对照相比，细胞活力基本一样，而作用浓度为2，4mM时，细胞活力略显降低，但是没有显著性差异(P＞0.05)，0.01，0.1和1mM为该实验的有效浓度，同时其可以作为其它指标的影响研究。

2.阿司匹林抑制LPS诱导的BV-2小胶质细胞活力的降低

如图2所示，当细胞单独用1μg/ml的LPS处理时，对细胞显示出一定的毒性，与对照组相比，降为其85.44±2.697％(图2p＜0.05)，当用0.01，0.1，1，4mM ASA预处理后，细胞活力增加，与对照组相比，分别变为对照组的102.57±1.463％，100.86±1.935％，95.65±5.299％，97.67±2.001％。0.01，0.1mM的ASA处理组与LPS处理组比升高作用较明显(p＜0.05)，说明0.01，0.1mM的ASA是保护BV-2细胞免受LPS诱导的活力下降的有效浓度

3.高浓度ASA可以抑制LPS诱导的BV-2小胶质细胞产生的NO含量

脂多糖作为一种炎症因子，作为一种炎症模型诱导剂，能刺激细胞生成NO量增加，所以一方面验证脂多糖刺激BV-2小胶质细胞造成炎症情形成功，另一方面研究阿司匹林对脂多糖诱导的BV-2小胶质细胞产生NO的影响。如图3所示，对照组为1.557±0.468％，当细胞中加入1μg/ml脂多糖处理24h后，NO的生成量明显增加，增加至28.54±0.468％(p＜0.001)。0.1，4mM ASA降低了NO的生成，并且4mM阿司匹林降低NO的作用最显著，降至14.53±0.692％(图3，p＜0.001)。

4.生理情况下，不同浓度的ASA对TfR，FpN，FTL，DMT1+IRE蛋白表达的影响

如下图所示：ASA显著降低了TfR蛋白的表达，而通过统计5次独立的实验结果显示，0.1，1mM的ASA效果更显著(图4C，p＜0.01)；同样，DMT1(二甲金属离子转运体)作为铁摄取的另一种蛋白，ASA也减低了DMT1+IRE的表达，0.01，0.1mM ASA降低作用最显著((图4F，在0.01mM，p＜0.001；在0.1mM，p＜0.01)；ASA上调了铁输出蛋白FpN和储存蛋白的表达，并且不同的浓度均发挥出效果，但是对于FpN的升高作用，ASA在1或者2mM时，作用最明显(图4D，p＜0.01)。而0.1mM的ASA对FTL的上调作用最明显(图4E，p＜0.01)。综合以上结果，ASA对这几种重要的相关铁代谢蛋白的影响在0.01和0.1mM为其发挥作用的最有效浓度。

5.炎症情况下，ASA抑制了LPS诱导的TfR，FpN的降低以及FTL的升高ASA(0.1，1，4mM)上调了LPS引起的TfR蛋白水平的降低，并且具有浓度依赖性(图5A，分别在0.1mM，p＜0.05；在1mM，p＜0.01；在4mM，p＜0.001)，ASA能够逆转LPS导致的TfR蛋白水平的下降。ASA显著的下调了LPS引起的FTL蛋白水平的升高(图5B，p＜0.01)；ASA对LPS诱导的FTH蛋白水平的升高并没有显著的改变；0.1mM ASA上调了LPS诱导的FpN蛋白水平的下降(图5D，p＜0.05)，综上所述，我们可以得知，0.1mM ASA可以逆转LPS诱导的TfR、FTL和FpN三种蛋白的改变，与前边部分的研究结果一致，0.1mM ASA是在LPS炎症条件下影响铁代谢蛋白的有效浓度。

6.ASA促进高铁诱导的TfR的降低及FTL的升高

进一步验证ASA在细胞内处于高铁或者低铁情况下，对铁代谢相关蛋白的表达。当外加FeCl3(100μM)造成细胞内高铁环境，以及去铁胺DFO(100μM)螯合掉细胞内铁离子造成细胞内低铁环境，在这两种情形下，实验采用Westernblotting检测TfR、FTL和DMT+IRE蛋白的表达情况。结果如图6所示：在外加FeCl3高铁情形下，TfR和DMT+IRE水平显著下降，FTL水平显著升高，ASA可以继续显著降低TfR的表达，升高FTL表达。

说明0.1mM ASA可以通过降低TfR，升高FTL蛋白表达，来改善高铁环境造成的细胞铁过载。

实施例2 ASA在神经元上铁代谢蛋白的影响研究

实验方法：

1.培养的原代神经元以1×10⁶ells/ml接种于6孔细胞培养板；

2.每3天半量换液，培养到7天后，吸弃旧的培养基，加入用含有Neurobasal+B27(2％)+Gln(0.5mM)的培养基稀释ASA到不同的浓度(0.01，0.1，1，2，4mM)，对照组用含有0.1％乙醇的培养基，再继续培养24h，进行western blot蛋白水平检测。

实验结果：几种浓度梯度的ASA都显著降低了DMT1的表达，而0.1mMASA显著升高FpN和FTL的表达，这与ASA在BV-2细胞上对两种蛋白影响是一致的。在神经元上ASA也能降低摄铁蛋白DMT1表达，升高储铁蛋白FTL和运铁蛋白FpN的表达，影响神经细胞铁代谢(图7)，并且ASA在神经元上最有效的作用浓度也是0.1mM。

本研究为临床用小剂量阿司匹林(0.1mM)治疗或者预防脑铁过载的神经炎性疾病提供了依据。

Claims

1.阿司匹林在制备预防或治疗脑铁代谢沉积药物中的应用。

2.阿司匹林在调节中枢神经系统的脑铁代谢蛋白中的应用。

3.阿司匹林在调节神经元和/或小胶质细胞的脑铁代谢蛋白中的应用。

4.阿司匹林在制备预防或治疗脑神经系统损伤药物中的应用。

5.阿司匹林在制备预防或治疗治疗脑神经炎性损伤药物中的应用。

6.阿司匹林在改善小胶质细胞炎症损伤中的应用。

7.阿司匹林在制备治疗或者预防脑铁过载的神经炎性疾病药物中的应用。