CN104800849B - 一种磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种磷脂酰肌醇3‑激酶抑制剂的应用，用于制备治疗Joubert综合征的药物，所述的磷脂酰肌醇3‑激酶抑制剂抑制磷脂酰肌醇3‑激酶的活性，缓解由于inpp5e缺失造成的Joubert综合征表型。与现有技术相比，本发明利用磷脂酰肌醇3‑激酶抑制剂，可有效地改善Joubert综合征模式动物的多囊肾等表型，对改善Joubert综合征病人的预后具有潜在的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明属于基因技术领域，尤其是涉及一种磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂在Joubert综合征中的应用。
背景技术
Joubert综合征是一种多基因常染色体隐性遗传疾病，是一类由于纤毛缺陷导致的“纤毛缺陷疾病”(ciliopathies)，其发病率约为1/1,000,000。临床表现主要有小脑蚓部发育不良、视网膜萎缩、肾囊肿、多指(趾)畸形等。inpp5e(Inositol polyphosphate 5-phosphatase E)是2009年被确定的Joubert综合征的致病基因之一，其蛋白产物INPP5E是一种磷酸肌醇的水解酶。体外酶活性主要表现为分别将PI(3,4,5)P3(phosphoinositol-3,4,5-triphosphate)和PI(4,5)P2(phosphoinositol-4,5-triphosphate)水解为PI(3,4)P2(phosphoinositol-3,4-biphosphate)和PI(4)P(phosphoinositol-4-phosphate)，体内可能只水解PI(3,4,5)P3。Joubert综合征病人相关染色体研究发现，如果突变导致INPP5E在细胞内的定位改变或者酶活性缺失，其病人均可出现Joubert综合征表型。由于发病机制尚不清楚，临床上Joubert综合征目前无特效治疗方法，主要靠康复治疗。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂的应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
利用Morpholino-寡核苷酸反义技术在斑马鱼胚胎中抑制inpp5e的表达，3天(daypost fertilization,dpf)的胚胎中观察到肾管膨大和肾囊肿的表型，其结果与Joubert综合征的临床表现一致。免疫荧光标记显示在肾囊肿表型的胚胎中肾管表皮细胞中的基体(basal bodies)存在定位缺陷。PI(4,5)P2和PI(3,4,5)P3可通过影响 细胞极性从而影响纤维型肌动蛋白(F-Actin,Fibrous Actin)以及基体的定位。进一步研究表明，通过应用磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol-3-Kinase，PI3K)抑制剂或显性失活PI3K(dominantnegative PI3K)抑制PI3K的活性可以缓解由于inpp5e缺失造成的纤毛缺陷和多囊肾等表型。
Joubert综合征的药物靶点为细胞内PI3K酶。因此本发明提供一种磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂在Joubert综合征中的应用。
一种磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂的应用，用于制备治疗Joubert综合征的药物。
所述的磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂抑制磷脂酰肌醇3-激酶的活性，缓解由于inpp5e缺失造成的Joubert综合征表型。
所述的磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂为小分子化合物及其衍生化合物，中药、植物药提取物、有效部位或有效成分，核酸类、多肽类或蛋白质类药物。可以单独使用或联合其他药物使用。
作为优选，所述的磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂为LY294002。
作为另一种实施方式，还可以通过过表达dnPI3K来显性抑制磷脂酰肌醇3-激酶活性，所述的dnPI3K为磷脂酰肌醇3-激酶的显性抑制突变形式。
与现有技术相比，本发明的有益效果是，利用磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂，可有效地改善Joubert综合征模式动物的多囊肾等表型，对改善Joubert综合征病人的预后具有潜在的临床应用价值。本发明既进一步阐明了Joubert综合征的发病机制，又为Joubert综合征的治疗提供了新的治疗靶点。
附图说明
图1为抑制inpp5e导致多囊肾生成及纤毛发生缺陷结果；
图2为LY294002缓解因inpp5e缺失而形成的多囊肾和纤毛缺陷统计结果；
图3为过表达dnPI3K抑制inpp5e morphant的囊肿发生统计结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例
LY294002和dnPI3K用于挽救下调inpp5e导致的多囊肾表型的研究
第一步：注射inpp5e吗啉寡聚核苷酸导致斑马鱼胚胎产生多囊肾表型
在发育时期处于1－2个细胞期的斑马鱼胚胎中分别注射由GeneTools公司合成的inpp5e morpholino(5′-GCTCACTCATCCTATTGGCGGGCTT-3′,序列如SEQ ID NO.1所示)6pg和对照组ctrl吗啉寡聚核苷酸(5′CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3′,序列如SEQ ID NO.2所示)6pg。在72小时(hour post fertilization,hpf)时，相比于正常的ctrl组，在注射了inpp5e morpholino的胚胎中(inpp5emorphant)有70％左右产生肾囊肿。在inpp5emorphant中共注inpp5e的mRNA可以挽救肾囊肿的表型。Dent’s固定胚胎后进行免疫荧光染色发现inpp5e morphant胚胎的中段肾管出现肿大并且多纤毛和单纤毛都缺失，见图1。
图1表示抑制inpp5e导致多囊肾生成及纤毛发生缺陷结果。在72hpf时，相比于正常的对照组(见图a)，在注射了inpp5e吗啉寡聚核苷酸的胚胎中(inpp5e吗啡啉突变体)有70％左右产生肾囊肿(见图b右上放大图，c的实验组)。在inpp5e吗啡啉突变体中共注inpp5e的mRNA可以挽救肾囊肿的表型(见图c的挽救组)。Dent’s固定胚胎后进行免疫荧光染色发现inpp5e吗啡啉突变体胚胎的中段肾管出现肿大(图e)并且多纤毛和单纤毛都存在缺失(见图e，g’)。aPKC染肾管内径，acetub染纤毛。比例尺为10纳米，***，p<0.001。
第二步：LY294002能够缓解inpp5e缺失造成的多囊肾
LY294002，CAS#154447-36-6，Selleck Chemicals公司，溶于DMSO配成1.5mM溶液。
待inpp5e morphant和ctrl morphant发育至胚盾期，每种morphant分为两组，将培养液分别替换为含15M的LY294002的培养液和含1％DMSO的培养液，在第3天观察胚胎发现，ctrl morphant组中分别加1％DMSO和LY294002的胚胎都能正常发育且无异常表型。在inpp5emorphant中加1％DMSO培养液的胚胎中发现有76％胚胎存在肾囊肿，但在加有LY294002的inpp5emorphant组胚胎中只存在35％的胚胎仍存在肾囊肿，3次重复操作后统计见图2。
inpp5e吗啡啉突变体用LY294002处理后与DMSO组相比肾囊肿发生比例由75％下降至35％(图2左列)。纤毛畸形比例也由85％下调至40％(图2右列)。***，p<0.001。
第三步：dnPI3K挽救实验
dnPI3K是PI3K的dominant negative形式，在胚胎中过表达dnPI3K能起到显性抑dnPI3K是PI3K的显性抑制突变形式，在胚胎中过表达dnPI3K能起到显性抑 制PI3K活性的作用。
取400枚1细胞期的胚胎注射inpp5e吗啉寡聚核苷酸后，从中随机取200枚胚胎加注250pg的dnPI3K。第三天观察表型时发现，单注inpp5e吗啉寡聚核苷酸的胚胎中有80％都存在肾囊肿，但在加注dnPI3K的胚胎中只含有38％的胚胎存在肾囊肿，3次重复操作后统计见图3。单注inpp5e吗啉寡聚核苷酸的胚胎中有80％都存在肾囊肿(柱3)，加注dnPI3K的胚胎肾囊肿发生率小降至38％(柱4)。***，p<0.001。
过表达dnPI3K或者LY294002药物处理后的inpp5e吗啡啉突变体胚胎都存在40％左右的肾囊肿表型降低，证明通过PI3K酶活性的抑制可有效地改善Joubert综合征模式动物的多囊肾表型。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂的应用，用于制备治疗Joubert综合征的药物，其中所述磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂为LY294002或磷脂酰肌醇3-激酶的显性抑制突变形式dnPI3K。
2.根据权利要求1所述的一种磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂的应用，其特征在于，所述的磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂抑制磷脂酰肌醇3-激酶的活性，缓解由于inpp5e缺失造成的Joubert综合征表型。
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| INPP5E mutations cause primary cilium signaling defects,ciliary instability and ciliopathies in human and mouse;Monique Jacoby等;《nature genetics》;20090809;第1027 - 1031页 |
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