CN104789544A - 重组pai-1抑制剂、包含其的组合物及其用于治疗和检测用途 - Google Patents

重组pai-1抑制剂、包含其的组合物及其用于治疗和检测用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种重组PAI-1抑制剂，所述PAI-1抑制剂包含突变S195A的uPA水解酶结构域或tPA水解酶结构域，具有与PAI-1的结合力。本发明还提供包含所述抑制剂的组合物及其在制备治疗药物中的应用以及制备检测PAI-1的试剂中的应途。本发明的重组PAI-1抑制剂是基于uPA或tPA的水解酶结构域进行改造以优化与PAI-1的结合力而构建的，其中起码包含了S195A点突变体。

Description

重组PAI-1抑制剂、包含其的组合物及其用于治疗和检测用途
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及重组PAI-1抑制剂、包含其的组合物及其医药用途。
背景技术
尿激酶系统（UrokinasePlasminogen Activator System，uPA system）由uPA、uPAR（uPA受体）以及两个特异性抑制因子PAI-1(Plasminogen ActivatorInhibitor-1)和PAI-2组成，它参与调控着许多重要的生理过程如纤维蛋白溶解(Fibrinolysis)、细胞的粘附、侵染和转移等(1)。在该系统中，uPA属于丝氨酸蛋白酶（Serine Protease）家族，与细胞膜上的uPAR结合后，uPA能特异地催化无活性的纤维蛋白酶原（Plasminogen）转变成活性的纤维蛋白酶（Plasmin），后者能降解胞外基质中包括纤维蛋白在内的多种蛋白从而调控许多重要的生理病理过程。
PAI-1是丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serpin）家族的重要成员，是uPA在体内的天然抑制剂，PAI-1是一种相对分子质量为50kD的单链糖蛋白，成熟的蛋白由379个氨基酸残基构成，等电点约4.5-5.5，含有23个氨基酸残基的信号肽。人类PAI-1基因定位于7号染色体q21.3-q22上，片断大小约12.3kb，包含9个外显子和8个内含子。其mRNA有2.4kb和3.2kb两种，二者都有活性功能。其三维结构由3个β-片层、9个α-螺旋和1个活性中心环（RCL）组成。其中，RCL是PAI-1发挥抑制活性的重要部位，它能插入到其靶酶纤溶酶原激活物（PA）的催化中心，其Arg346-Met347肽键被水解，并与uPA共价结合，RCL其他部分插入PAI-1内部的β-片层A中，导致靶酶催化中心构象变形而失活。PAI-1在体内有三种存在形态，即活性态、潜在活性态和底物态。体内PAI-1大多以潜在活性态形式存在，正常人血浆中活性态PAI-1仅占3%-5%。只有活性态的PAI-1对组织型纤溶酶原激活物（t-PA）和尿激酶型纤溶酶原激活物（u-PA）起抑制作用，从而使活性纤溶酶生成减少，导致纤维蛋白降解减少，给血栓形成创造有利条件。有活性的PAI-1是不稳定的，半衰期为30分钟。
在人体内，PAI-1的mRNA主要存在于血管内皮、单核细胞、血小板、脂肪、胎盘、胎儿肝、成纤维细胞、肺等器官、组织和细胞中。在血管内皮、脂肪、肝脏和脾脏中含量最为丰富，而脑及心脏含量较低。
作为uPA系统的重要组成，PAI-1不仅与血栓性疾病相关，而且与肿瘤的发生发展亦紧密联系(7、14)。
纤溶系统的调节失衡是血栓形成和动脉粥样硬化发生、发展的主要原因之一。血液的正常流动有赖于血浆凝血和纤溶系统的动态平衡，PA与其抑制因子PAI-1则是维持该平衡的主要调控因子，二者相互作用调节维持了正常的血浆纤溶活性(2)。在生理条件下，机体通过PA调控的纤维蛋白酶活性清除体内形成的纤维蛋白，防止其在血管壁及其他组织沉积；同时又通过PAI-1等调控的抗纤溶系统控制血液中的纤维蛋白酶活性在一定范围内，避免纤溶过度而出现出血倾向。换言之，一旦血液循环中PAI-1水平升高或PA活性受抑制，则会造成局部纤溶活性受抑制，血液呈现高凝状态，容易诱发血栓形成(3)。血栓的形成使PAI-1活性进一步增加，加速纤维蛋白的形成，使其在体内尤其是在血管壁上沉积，刺激血管平滑肌细胞(SMC)增生和迁移，诱导低密度脂蛋白与SMC结合，大量沉积于细胞外基质，使血管基底膜增厚，血管壁僵硬，加速动脉粥样硬化的进程(4)。目前PAI-1被认为是检测心肌梗死(5)和动脉粥样硬化(15)等血栓性疾病的标记物之一(6)。PAI-1活性在冬季最高，夏季最低；清晨最高，在下午及晚上处于最低值，这可能是清晨纤溶活力下降易发生心肌梗塞的原因，与心脑血管事件发生率在清晨及冬季最高相符。PAI-1抑制剂可被应用于预防和治疗许多血栓性疾病的发生，如动脉粥样硬化、心肌梗死及脑血栓等(14)。研究发现，在多种肿瘤组织如肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌等局部组织中均检测到PAI-1、uPA以及uPAR的水平异常升高(8、9)。目前PAI-1已经被美国临床肿瘤学会（ASCO）确定为乳腺癌检测的首选标志物(10)。此外，PAI-1基因敲除的小鼠具有与正常小鼠一样的生殖能力，在组织学检查上也没发现明显异常(11)，却能阻止癌细胞的侵染以及血管形成(12)。关于PAI-1在肿瘤的发生和转移过程中的作用机制有多种假说，其中比较有说服力的是“玻连蛋白（VN）介导”的假说：细胞外基质ECM包括基底膜和间隙间质具有维持细胞组织形态的作用，是细胞间相互作用的重要场所，肿瘤细胞必须首先要通过ECM的降解，才能发生肿瘤细胞的浸润和迁移，并转移到他处(13)。有证据表明，高水平的PAI-1会降低肿瘤细胞对胞外基质的粘附能力(15)。在血浆中PAI-1与VN具有很高的亲和力，几乎所有激活态的PAI-1都被VN所结合，而除了PAI-1外，VN还能与尿激酶受体以及整合素（Integrin）等多种细胞粘附蛋白结合，对细胞的粘附和转移至关重要的作用。由于这些蛋白包括PAI-1与VN的结合位点几乎都在VN的同一个区域，因此PAI-1很可能竞争地抑制了尿激酶受体和整合素介导下的细胞与VN的粘附作用从而诱发肿瘤细胞发生侵染和转移，如PAI-1能抑制MCF7细胞对VN的粘附(16)。由于转移和复发是肿瘤治疗失败的最主要原因，因此目前PAI-1被认为是抗恶性肿瘤的一个重要靶标(7)。
糖尿病人的血液中的PAI-1水平较高，经过治疗后病情减轻的糖尿病人血清中的PAI-1水平下降，表明PAI-1与糖尿病有直接的关系。近来，一项包括了近两万人的全基因组关联分析研究表明，血清的PAI-1浓度直接与心血管疾病和二型糖尿病相关(17)。因此，PAI-1的抑制被认为是糖尿病治疗的一种方案(18)。
因此，PAI-1抑制剂对于血栓性疾病、糖尿病、恶性肿瘤的检测和治疗具有十分重要的意义。
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这些文献全部引入本文作为参考。
发明内容
发明人经过不懈努力，发现了一类抑制PAI-1的抑制剂，命名为PAI-Trap。PAI-Trap是uPA或tPA的水解酶结构域并经过一个以上氨基酸残基的取代、缺失或添加而构建的，其中包含了S195A突变体（氨基酸命名方式为胰凝乳蛋白酶原编号（Chymotrypsinogen numbering）），PAI-Trap对PAI-1有很强的抑制效率。
本发明通过如下技术方案实现：
在第一方面，本发明提供了一种氨基酸序列，其特征在于，所述序列选自SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.15。
本发明提供了一类PAI-1的抑制剂（命名为PAI-Trap），所述抑制剂为包含突变S195A的突变形式的uPA或tPA水解酶结构域。
根据本发明，所述PAI-1抑制剂具有结合并抑制PAI-1的能力。
根据本发明，所述PAI-1抑制剂还包含选自如下的突变G37bR、Y60bK、A96E和R217L，具有与PAI-1的结合力。
根据本发明，所述PAI-1抑制剂包含突变G37bR和Y60bK。
根据本发明，所述uPA水解酶结构域的氨基酸序列是SEQ ID NO.1，所述tPA水解酶结构域的氨基酸序列是SEQ ID NO.2。
在一个实施方案中，编码SEQ ID NO.1的氨基酸序列的核苷酸序列是SEQID NO.10，编码SEQ ID NO.2的氨基酸序列的核苷酸序列是SEQ ID NO.11。
在一个优选的实施方案中，所述PAI-1抑制剂的氨基酸序列是SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.15。
在一个优选的实施方案中，编码本发明的PAI-1抑制剂的核苷酸序列选自SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.16。
本发明还提供一种编码本发明的PAI-1的抑制剂的核苷酸序列。
在一个优选的实施方案中，编码本发明的PAI-1抑制剂的核苷酸序列选自SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.16。
在本发明中，uPA或tPA的水解酶结构域可以是人uPA或tPA的水解酶结构域，或者其在任何动物中的对于物。人uPA的水解酶结构域的氨基酸序列(I16-E244，采用胰凝乳蛋白酶编号法）SEQ ID NO.1是：
IIGGEFTTIENQPWFAAIYRRHRGGSVTYVCGGSLISPCWVISATHCFIDYPKKEDYIVYLGRSRLNSNTQGEMKFEVENLILHKDYSADTLAHHNDIALLKIRSKEGRCAQPSRTIQTIALPSMYNDPQFGTSCEITGFGKEQSTDYLYPEQLKMTVVKLISHRECQQPHYYGSEVTTKMLCAADPQWKTDSCQGDSGGPLVCSLQGRMTLTGIVSWGRGCALKDKPGVYTRVSHFLPWIRSHTKE
编码SEQ ID NO.1的氨基酸序列的核苷酸序列之一是SEQ ID NO.10：
ATTATTGGGGGAGAATTCACCACCATCGAGAACCAGCCCTGGTTTGCGGCCATCTACAGGAGGCACCGGGGGGGCTCTGTCACCTACGTGTGTGGAGGCAGCCTCATCAGCCCTTGCTGGGTGATCAGCGCCACACACTGCTTCATTGATTACCCAAAGAAGGAGGACTACATCGTCTACCTGGGTCGCTCAAGGCTTAACTCCAACACGCAAGGGGAGATGAAGTTTGAGGTGGAAAACCTCATCCTACACAAGGACTACAGCGCGGACACGCTTGCTCACCACAACGACATTGCCTTGCTGAAGATCCGTTCCAAGGAGGGCAGGTGTGCGCAGCCATCCCGGACTATACAGACCATCGCCCTGCCCTCGATGTATAACGATCCCCAGTTTGGCACAAGCTGTGAGATCACTGGCTTTGGAAAAGAGCAATCTACCGACTATCTCTATCCGGAGCAGCTGAAAATGACTGTTGTGAAGCTGATTTCCCACCGGGAGTGTCAGCAGCCCCACTACTACGGCTCTGAAGTCACCACCAAAATGCTGTGTGCTGCTGACCCACAGTGGAAAACAGATTCCTGCCAGGGAGACTCAGGGGGACCCCTCGTCTGTTCCCTCCAAGGCCGCATGACTTTGACTGGAATTGTGAGCTGGGGCCGTGGATGTGCCCTGAAGGACAAGCCAGGCGTCTACACGAGAGTCTCACACTTCTTACCCTGGATCCGCAGTCACACCAAGGAA
人tPA的水解酶结构域的氨基酸序列(16-244，采用糜蛋白酶编号法）SEQID NO.2是：
IKGGLFADIASHPWQAAIFAKHRRSPGERFLCGGILISSCWILSAAHCFQERFPPHHLTVILGRTYRVVPGEEEQKFEVEKYIVHKEFDDDTYDNDIALLQLKSDSSRCAQESSVVRTVALPPADLQLPDWTECELSGYGKHEALSPFYSERLKEAHVRLYPSSRCTSQHLLQRTVTDNMLCAGDTRSGGPQANLHDACQGDSGGPLVCLNDGRMTLVGIISWGLGCGQKDVPGVYTKVTNYLDWIRDNMRP
编码SEQ ID NO.2的氨基酸序列的核苷酸序列之一是SEQ ID NO.11：
ATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACGGTGATCTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCGAAAAATACATTGTCCATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCAGCTGAAATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGGCTCTTCCCCCGGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGCATGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACCCATCCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTCAAAGAACAGTCACCGACAACATGCTGTGTGCTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCCAGGGCGATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGGCATCATCAGCTGGGGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACCAAGGTTACCAACTACCTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGACCG
在一个具体的实施方案中，这类PAI-Trap抑制剂的其中一个例子的氨基酸序列SEQ ID NO.3为：
IIGGEFTTIENQPWFAAIYRRHRGGSVTYVCGGSLISPCWVISATHCFIDYPKKEDYIVYLGRSRLNSNTQGEMKFEVENLILHKDYSADTLAHHNDIALLKIRSKEGRCAQPSRTIQTIALPSMYNDPQFGTSCEITGFGKEQSTDYLYPEQLKMTVVKLISHRECQQPHYYGSEVTTKMLCAADPQWKTDSCQGDAGGPLVCSLQGRMTLTGIVSWGRGCALKDKPGVYTRVSHFLPWIRSHTKE
编码SEQ ID NO.3的氨基酸序列的核苷酸序列之一是SEQ ID NO.12：
ATTATTGGGGGAGAATTCACCACCATCGAGAACCAGCCCTGGTTTGCGGCCATCTACAGGAGGCACCGGGGGGGCTCTGTCACCTACGTGTGTGGAGGCAGCCTCATCAGCCCTTGCTGGGTGATCAGCGCCACACACTGCTTCATTGATTACCCAAAGAAGGAGGACTACATCGTCTACCTGGGTCGCTCAAGGCTTAACTCCAACACGCAAGGGGAGATGAAGTTTGAGGTGGAAAACCTCATCCTACACAAGGACTACAGCGCGGACACGCTTGCTCACCACAACGACATTGCCTTGCTGAAGATCCGTTCCAAGGAGGGCAGGTGTGCGCAGCCATCCCGGACTATACAGACCATCGCCCTGCCCTCGATGTATAACGATCCCCAGTTTGGCACAAGCTGTGAGATCACTGGCTTTGGAAAAGAGCAATCTACCGACTATCTCTATCCGGAGCAGCTGAAAATGACTGTTGTGAAGCTGATTTCCCACCGGGAGTGTCAGCAGCCCCACTACTACGGCTCTGAAGTCACCACCAAAATGCTGTGTGCTGCTGACCCACAGTGGAAAACAGATTCCTGCCAGGGAGACGCAGGGGGACCCCTCGTCTGTTCCCTCCAAGGCCGCATGACTTTGACTGGAATTGTGAGCTGGGGCCGTGGATGTGCCCTGAAGGACAAGCCAGGCGTCTACACGAGAGTCTCACACTTCTTACCCTGGATCCGCAGTCACACCAAGGAA
在一个优选的实施方案中，还可以对PAI-1抑制剂PAI-Trap进行进一步修饰，进而获得具有相同或更强PAI-1抑制功能的PAI-Trap。例如所述修饰是选自如下的一种或多种突变：G37bR、Y60bK、A96E和R217L。
其中一个优选PAI-Trap的氨基酸序列SEQ ID NO.4为：
IIGGEFTTIENQPWFAAIYRRHRGGSVTYVCGGSLISPCWVISATHCFIDKPKKEDYIVYLGRSRLNSNTQGEMKFEVENLILHKDYSADTLAHHNDIALLKIRSKEGRCAQPSRTIQTIALPSMYNDPQFGTSCEITGFGKEQSTDYLYPEQLKMTVVKLISHRECQQPHYYGSEVTTKMLCAADPQWKTDSCQGDAGGPLVCSLQGRMTLTGIVSWGRGCALKDKPGVYTRVSHFLPWIRSHTKE
编码SEQ ID NO.4的氨基酸序列的核苷酸序列之一是SEQ ID NO.13：
ATTATTGGGGGAGAATTCACCACCATCGAGAACCAGCCCTGGTTTGCGGCCATCTACAGGAGGCACCGGGGGGGCTCTGTCACCTACGTGTGTGGAGGCAGCCTCATCAGCCCTTGCTGGGTGATCAGCGCCACACACTGCTTCATTGATAAGCCAAAGAAGGAGGACTACATCGTCTACCTGGGTCGCTCAAGGCTTAACTCCAACACGCAAGGGGAGATGAAGTTTGAGGTGGAAAACCTCATCCTACACAAGGACTACAGCGCTGACACGCTTGCTCACCACAACGACATTGCCTTGCTGAAGATCCGTTCCAAGGAGGGCAGGTGTGCGCAGCCATCCCGGACTATACAGACCATCGCCCTGCCCTCGATGTATAACGATCCCCAGTTTGGCACAAGCTGTGAGATCACTGGCTTTGGAAAAGAGCAATCTACCGACTATCTCTATCCGGAGCAGCTGAAAATGACTGTTGTGAAGCTGATTTCCCACCGGGAGTGTCAGCAGCCCCACTACTACGGCTCTGAAGTCACCACCAAAATGCTGTGTGCTGCTGACCCACAGTGGAAAACAGATTCCTGCCAGGGAGACGCAGGGGGACCCCTCGTCTGTTCCCTCCAAGGCCGCATGACTTTGACTGGAATTGTGAGCTGGGGCCGTGGATGTGCCCTGAAGGACAAGCCAGGCGTCTACACGAGAGTCTCACACTTCTTACCCTGGATCCGCAGTCACACCAAGGAA
另一个优选PAI-Trap的氨基酸序列SEQ ID NO.5为：
IIGGEFTTIENQPWFAAIYRRHRRGSVTYVCGGSLISPCWVISATHCFIDYPKKEDYIVYLGRSRLNSNTQGEMKFEVENLILHKDYSADTLAHHNDIALLKIRSKEGRCAQPSRTIQTIALPSMYNDPQFGTSCEITGFGKEQSTDYLYPEQLKMTVVKLISHRECQQPHYYGSEVTTKMLCAADPQWKTDSCQGDAGGPLVCSLQGRMTLTGIVSWGLGCALKDKPGVYTRVSHFLPWIRSHTKE
编码SEQ ID NO.5的氨基酸序列的核苷酸序列之一是SEQ ID NO.14：
ATTATTGGGGGAGAATTCACCACCATCGAGAACCAGCCCTGGTTTGCGGCCATCTACAGGAGGCACCGGAGGGGCTCTGTCACCTACGTGTGTGGAGGCAGCCTCATCAGCCCTTGCTGGGTGATCAGCGCCACACACTGCTTCATTGATTACCCAAAGAAGGAGGACTACATCGTCTACCTGGGTCGCTCAAGGCTTAACTCCAACACGCAAGGGGAGATGAAGTTTGAGGTGGAAAACCTCATCCTACACAAGGACTACAGCGCGGACACGCTTGCTCACCACAACGACATTGCCTTGCTGAAGATCCGTTCCAAGGAGGGCAGGTGTGCGCAGCCATCCCGGACTATACAGACCATCGCCCTGCCCTCGATGTATAACGATCCCCAGTTTGGCACAAGCTGTGAGATCACTGGCTTTGGAAAAGAGCAATCTACCGACTATCTCTATCCGGAGCAGCTGAAAATGACTGTTGTGAAGCTGATTTCCCACCGGGAGTGTCAGCAGCCCCACTACTACGGCTCTGAAGTCACCACCAAAATGCTGTGTGCTGCTGACCCACAGTGGAAAACAGATTCCTGCCAGGGAGACGCAGGGGGACCCCTCGTCTGTTCCCTCCAAGGCCGCATGACTTTGACTGGAATTGTGAGCTGGGGCCTTGGATGTGCCCTGAAGGACAAGCCAGGCGTCTACACGAGAGTCTCACACTTCTTACCCTGGATCCGCAGTCACACCAAGGAA
另一个优选PAI-Trap的氨基酸序列SEQ ID NO.15为：
IIGGEFTTIENQPWFAAIYRRHRRGSVTYVCGGSLISPCWVISATHCFIDYPKKEDYIVYLGRSRLNSNTQGEMKFEVENLILHKDYSEDTLAHHNDIALLKIRSKEGRCAQPSRTIQTIALPSMYNDPQFGTSCEITGFGKEQSTDYLYPEQLKMTVVKLISHRECQQPHYYGSEVTTKMLCAADPQWKTDSCQGDAGGPLVCSLQGRMTLTGIVSWGLGCALKDKPGVYTRVSHFLPWIRSHTKE
编码SEQ ID NO.15的氨基酸序列的核苷酸序列之一是SEQ ID NO.16：
ATTATTGGGGGAGAATTCACCACCATCGAGAACCAGCCCTGGTTTGCGGCCATCTACAGGAGGCACCGGAGGGGCTCTGTCACCTACGTGTGTGGAGGCAGCCTCATCAGCCCTTGCTGGGTGATCAGCGCCACACACTGCTTCATTGATTACCCAAAGAAGGAGGACTACATCGTCTACCTGGGTCGCTCAAGGCTTAACTCCAACACGCAAGGGGAGATGAAGTTTGAGGTGGAAAACCTCATCCTACACAAGGACTACAGCGAGGACACGCTTGCTCACCACAACGACATTGCCTTGCTGAAGATCCGTTCCAAGGAGGGCAGGTGTGCGCAGCCATCCCGGACTATACAGACCATCGCCCTGCCCTCGATGTATAACGATCCCCAGTTTGGCACAAGCTGTGAGATCACTGGCTTTGGAAAAGAGCAATCTACCGACTATCTCTATCCGGAGCAGCTGAAAATGACTGTTGTGAAGCTGATTTCCCACCGGGAGTGTCAGCAGCCCCACTACTACGGCTCTGAAGTCACCACCAAAATGCTGTGTGCTGCTGACCCACAGTGGAAAACAGATTCCTGCCAGGGAGACGCAGGGGGACCCCTCGTCTGTTCCCTCCAAGGCCGCATGACTTTGACTGGAATTGTGAGCTGGGGCCTTGGATGTGCCCTGAAGGACAAGCCAGGCGTCTACACGAGAGTCTCACACTTCTTACCCTGGATCCGCAGTCACACCAAGGAA
在第二方面中，本发明提供了一种包含本发明上述的PAI-1抑制剂的组合物。
根据本发明，所述PAI-1抑制剂包含突变S195A的uPA水解酶结构域或tPA水解酶结构域，具有与PAI-1的结合力。
根据本发明，所述PAI-1抑制剂还包含选自如下的突变G37bR、Y60bK、A96E和R217L，具有与PAI-1的结合力。
根据本发明，所述PAI-1抑制剂包含突变G37bR和Y60bK。
根据本发明，所述uPA水解酶结构域的氨基酸序列是SEQ ID NO.1，所述tPA水解酶结构域的氨基酸序列是SEQ ID NO.2。在一个实施方案中，编码SEQID NO.1的氨基酸序列的核苷酸序列是SEQ ID NO.10，编码SEQ ID NO.2的氨基酸序列的核苷酸序列是SEQ ID NO.11。
在一个优选的实施方案中，所述PAI-1抑制剂的氨基酸序列是SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.15。
在一个优选的实施方案中，编码本发明的PAI-1抑制剂的核苷酸序列选自SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、14或SEQ ID NO.16。
在第三方面中，本发明还提供一种编码本发明的PAI-1的抑制剂的核苷酸序列。
在一个优选的实施方案中，编码本发明的PAI-1抑制剂的核苷酸序列选自SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、14或SEQ ID NO.16。
在一个优选的实施方案中，SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.15的氨基酸序列的编码序列分别是SEQ ID NO.12、SEQ IDNO.13、14或SEQ ID NO.16。
在第四方面中，本发明还提供一种包含上述核苷酸序列的载体。
在一个实施方案中，本发明还提供一种包含编码本发明的PAI-1的抑制剂的核苷酸序列的载体。
在一个优选的实施方案中，所述核苷酸序列编码SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.15的氨基酸序列。
在一个优选的实施方案中，编码本发明的PAI-1抑制剂的核苷酸序列选自SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.16。
在第五方面中，本发明还提供一种细胞，所述细胞包含编码本发明的PAI-1的抑制剂的核苷酸序列或包含其的载体。
在一个实施方案中，所述细胞包含第三方面的核苷酸序列或第四方面的载体。
在一个优选的实施方案中，所述核苷酸序列编码SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.15的氨基酸序列。
在一个优选的实施方案中，编码本发明的PAI-1抑制剂的核苷酸序列选自SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.16。
在第六方面中，本发明还提供一种第五方面细胞的应用，其特征在于，所述细胞用于表达所述PAI-1的抑制剂。
在第七方面中，本发明提供了本发明上述的PAI-1抑制剂PAI-Trap或本发明的组合物抑制PAI-1的用途。
优选地，本发明提供了本发明的PAI-1抑制剂PAI-Trap或本发明的组合物在制备用于抑制PAI-1的药物中的用途。
在第八方面中，本发明提供了本发明的PAI-1抑制剂PAI-Trap或本发明的组合物在治疗血栓性疾病、糖尿病或肿瘤中的用途，以及在检测PAI-1中的用途。
在第九面中，本发明提供了本发明的PAI-1抑制剂PAI-Trap或本发明的组合物在制备用于治疗血栓性疾病、糖尿病或肿瘤的药物中的用途。以及在制备检测PAI-1的试剂中的用途。
本发明的有益效果：本发明采用生物发酵方式生产了一类PAI-Trap，其对PAI-1具有抑制作用。在分子水平上，该蛋白能与PAI-1蛋白相结合，抑制PAI-1与尿激酶纤溶酶原激活物（uPA）或组织型纤溶酶原激活物（tPA）的相互作用。体外实验证实，该蛋白能够通过抑制PAI-1而诱导血液凝块的降解。因此，PAI-Trap可用于制备检测PAI-1的试剂，以及治疗血栓性疾病。
附图说明：
图1为SDS-PAGE检测PAI-1(A)、uPA(B)、tPA(C)以及PAI-Trap(D)蛋白的纯化效果。
其中A:利用Ni-NTA亲和层析柱纯化PAI-1蛋白（约42KDa）：M道为MW标志：97、66、43、31、20KDa；1道为自由通过（Free-through）；2-5道分别为20、40、60、100mM咪唑洗脱组分；6-8道为300mM咪唑洗脱组分。B：利用阳离子交换柱（SPFF,GEHEALTH,GE HEALTH）纯化尿激酶（约27KDa）：M道为MW标记：97、66、43、31、20KDa；1-5道为从SPFF,GEHEALTH阳离子交换柱上洗脱下来的uPA组分。C：利用阳离子交换柱（SPFF,GEHEALTH，GE HEALTH）纯化tPA(约29KDa）：M道为MW标记：97、66、43、31、20、14KDa；1-3道为从SPFF,GEHEALTH阳离子交换柱上洗脱下来的tPA组分。D：利用阳离子交换柱（SPFF,GEHEALTH,GEHEALTH）纯化PAI-Trap(约27KDa)：M道为MW标记：97、66、43、31、20、14KDa；9-11道为从SPFF,GEHEALTH阳离子交换柱上洗脱下来的PAI-Trap组分。
图2为PAI-1活性检测原理示意图。
在100μL的反应体系中加入PAI-1和相对过量的uPA，反应15分钟后，PAI-1会共价结合到uPA的催化中心上导致其活性丧失。然后加入发光底物S2444，uPA能特异识别其中的酶切位点并将其发色基团——p-硝基苯胺（pNA）切下来，最后通过酶标仪检测405nm的吸光度值就可以测定uPA的酶活并进而计算出PAI-1的活性。
图3为显色法测定一种PAI-TrapSEQ ID NO.4对PAI-1的竞争性抑制的拟合结果。
图4为表面等离子共振（SPR）技术测定一种PAI-TrapSEQ ID NO.5与PAI-1的直接结合活性。
图5为SDS-PAGE法检测一种PAI-TrapSEQ IDNO.5对PAI-1和uPA(A)/tPA(B)相互作用的影响。
将4nM PAI-1与PAI-TrapSEQ IDNO.5(4、8、12、16nM)或对照（150mMNaCl、20mM Tris pH7.4）预先孵育10分钟，然后加入2nM uPA(A)或tPA(B)，于37℃反应15分钟。将样品用于SDS-PAGE蛋白电泳检测分析。
图6为几种PAI-Trap对纤维蛋白凝块形成的抑制作用。通过酶标仪405nm吸收值的增加，可以看到纤维蛋白凝块在12分钟内形成。当PAI-1与tPA-SPD同时存在时，tPA-SPD被抑制，纤维蛋白凝块降解速度明显受阻。而如果加入不同的PAI-Trap时，PAI-1的这种抗纤维蛋白凝块降解效应被不同程度抑制，纤维蛋白凝块得以溶解。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。本发明的实验操作具有通用性，不限于发明中提到的蛋白质。
以下实施例中涉及的uPA的水解酶结构域为氨基酸序列SEQ ID NO.1的人uPA的水解酶结构域，编码其的核苷酸序列是SEQ ID NO.10；tPA的水解酶结构域为氨基酸序列SEQ ID NO.2的人tPA的水解酶结构域，编码其的核苷酸序列是SEQ ID NO.11。对于如下实施例中形成的突变uPA的水解酶结构域和tPA的水解酶结构域，在进行表达之前，经过测序确认均为包含所需突变的序列。
实施例一PAI-Trap基因的克隆，以及PAI-Trap蛋白的表达和纯化
（1）这里的PAI-Trap是以uPA的水解酶结构域（uPA-SPD，其核苷酸序列是SEQ ID NO.10）进行S195A突变而构建，又简称为uPA-S195A(I16-E244)或uPA-S195A（氨基酸命名方式为胰凝乳蛋白酶原编号）:
采用uPA-SPD-pPicZαA质粒（Invitrogen）为模板。
引物设计:
正义引物：5＇－GCCAGGGAGACTCAGGGGGACC-3＇（SEQ ID NO.6）
反义：5＇－GGTCCCCCTGAGTCTCCCTG-3＇（SEQ ID NO.7）
PCR体系：
ddH2O  32ul
5HF缓冲液(Thermal scienstific)10ul
2mM dNTP（上海生工）  5ul
20mM正义引物  1ul
20mM反义引物  1ul
模板  (20ng)0.5ul
Phuison(Thermal scienstific)0.5ul
PCR条件：
98℃  3分钟；
25个循环：
98℃  20秒、
62℃  20秒、
72℃  140秒；
72℃  10分钟；
4℃  0。
加入1μL DpnI（Takara）至上述PCR产物中，37℃温育过夜。采用ZDNA胶回收试剂盒（OMEGA）对PCR产物进行胶回收。42℃热激发转化至大肠杆菌DH5α(Invitrogen)，涂平板，挑单克隆测序，将含有正确突变的菌种在15%甘油中保存于-80℃冰箱待用。
挑取上述在甘油中保存的菌在LLB培养基(0.5%NaCl,1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，含0.03%Zeocin)中进行活化、扩大，采用ZDNA质粒小抽试剂盒（OMEGA）抽提uPA-S195A-pPicZαA质粒。对抽提的质粒进行线性化。
线性化体系：
质粒(400ug/ml)43.5ul
SacI（TaKaRa）  1.5ul
10×缓冲液L（TaKaRa）  5ul
在37℃下过夜，然后进行乙醇沉淀回收。
将回收得到的DNA片段电转毕赤酵母X-33菌株：1.5KV，0.6秒。涂于YPD（1%酵母提取物，2%胰蛋白胨，1%葡萄糖，2%琼脂粉，含100μg/ml Zeocin）平板，挑单菌落，小量表达进行验证。
将验证正确的毕赤酵母X-33接种于YPD（1%酵母提取物，2%胰蛋白胨，1%葡萄糖,含100μg/ml Zeocin）28℃培养1天，以1：10接种于BMGY培养基（1%酵母提取粉，2%胰蛋白胨，3g/LK2HPO4,12g KH2PO4,1%甘油），28℃扩大培养1天，以1：4接种于BMMY培养基（1%酵母提取粉，2%胰蛋白胨，3g/LK2HPO4,12g KH2PO4,1%甲醇）进行诱导表达，继续培养3天，每天补加1%的甲醇。收获蛋白（离心10000rpm，30分钟，取上清），用20mM PB(磷酸盐缓冲液）pH6.0稀释5倍，通过阳离子亲和层析柱（SPFF,GEHEALTH,GEHEALTH）进行纯化，将所得蛋白进行浓缩，分装、保存于-80℃备用。
（2）其余的基于uPA-SPD的PAI-Trap都是根据如上实例，在uPA-S195A的基础上，设计合适引物，在PCR过程中改变变性温度和退火时间，转化及表达、纯化过程如（1）进行。
（3）另一类PAI-Trap是以tPA的水解酶结构域（tPA-SPD，其核苷酸序列是SEQ ID NO.11）进行S195A突变而构建，又简称为tPA-S195A(I16-P244),或tPA-S195A（氨基酸命名方式为胰凝乳蛋白酶原编号）。
采用tPA-SPD-pPicZαA质粒（以色列Abd Al-Roof Higazi教授提供）为模板。
引物设计：
正义：5＇－GGCGATGCTGGAGGCCCCCTG-3＇（SEQ ID NO.8）
反义：5＇－GCCTCCAGCATCGCCCTGGCAG-3＇（SEQ ID NO.9）
PCR体系：
ddH2O  32ul
5HF缓冲液（Thermal scientific）  10ul
2mM dNTP（上海生工）  5ul
20mM正义引物  1ul
20mM反义引物  1ul
模板  (20ng)0.5ul
Phuison（Thermal scientific）  0.5ul
PCR条件
98℃  3分钟；
25个循环：
98℃  20秒、
60℃  25秒、
72℃  150秒；
72℃  10分钟
4℃  0。
加入1μL DpnI（Takara）至上述PCR产物中，37℃温育过夜。采用ZDNA胶回收试剂盒（OMEGA）对PCR产物进行胶回收。42℃热激发转化至大肠杆菌DH5α，涂平板，挑单克隆测序，将含有正确突变的菌种在15%甘油中保存于-80℃冰箱待用。
挑取上述甘油保存的菌在LLB（1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取粉，0.5%NaCl，含有0.03%Zeocin）培养基中进行活化、扩大，采用ZDNA质粒小抽试剂盒（OMEGA）抽提tPA-S195A-pPicZαA质粒。对抽提的质粒进行线性化。
线性化体系
质粒（400ug/ml）  43.5ul
PmeI（TaKaRa）  1.5ul
10×缓冲液B（TaKaRa）  5ul
在37℃下过夜，乙醇沉淀回收DNA。
将回收得到的DNA片段电转毕赤酵母X-33菌株（Invitrogen）:1.5KV，0.6秒。涂于YPD（1%酵母提取物，2%胰蛋白胨，1%葡萄糖，2%琼脂粉，含100μg/ml Zeocin）平板，挑单菌落，小量表达进行验证。
将验证正确的毕赤酵母X-33接种于YPD（1%酵母提取物，2%胰蛋白胨，1%葡萄糖，含100μg/ml Zeocin）28℃培养1天，以1：10接种于BMGY培养基，28℃扩大培养1天，以1：4接种于BMMY培养基进行诱导表达，继续培养3天，每天补加1%的甲醇。收蛋白（离心10000rpm，30min，取上清），用20mM AB（醋酸盐缓冲液）pH4.5稀释5倍，通过阳离子亲和层析柱（SPFF,GEHEALTH）进行纯化，将所得蛋白进行浓缩，分装、保存于-80℃备用。
（4）其余的基于tPA-SPD的PAI-Trap都是根据如上实例，在tPA-S195A的基础上，设计合适引物，在PCR过程中改变变性温度和退火时间，转化及表达、纯化过程如（3）进行。
一种PAI-TrapSEQ ID NO.5蛋白纯化结果如图1D所示，所纯化的PAI-Trap具有较高的纯度，可用于后续研究。
实施例二PAI-1、uPA和tPA的表达与纯化
（1）PAI-1的表达与纯化：将重组PAI-1表达质粒pT7-PL(上海交通大学周爱武教授馈赠）转化BL21大肠杆菌菌株（Invitrogen）。重组表达菌株接种于LB（1胰蛋白胨，0.5%酵母提取粉，1%NaCl，含100mg/LAmp）37℃培养过夜，以1:100接种于新鲜的LB（1胰蛋白胨，0.5%酵母提取粉，1%NaCl，含100mg/L Amp）37℃扩大培养至OD600为0.6左右，用0.5mM IPTG20℃诱导6小时，在10000rpm下离心10分钟，收集菌体，用缓冲液A(25mM MESpH6.1、1M NaCl)重悬，超声破碎，在10000rpm下离心30分钟，取上清与Ni-NTA（Qiagen）柱结合2小时，用含咪唑的缓冲液A进行梯度洗脱，将300mM咪唑洗脱所得的目的蛋白进行透析、浓缩，用分子筛（Superdex75）进一步纯化，浓缩至1mg/ml,分装并于-80℃保存备用。
结果如图1A所示，所纯化的PAI-1具有较高的纯度，可用于后续研究。
(2)uPA的表达与纯化:uPA的表达纯化参照已报道方法进行(Zhao,G.,etal.,2007)。将含有uPA基因的重组毕赤酵母X-33(Invitrogen)接种于YPD（1%酵母提取物，2%胰蛋白胨，1%葡萄糖，含100μg/ml Zeocin）28℃培养1天，以1：10接种于BMGY培养基，28℃扩大培养1天，以1：4接种于BMMY培养基进行诱导表达，继续培养3天，每天补加1%的甲醇。收蛋白（离心10000rpm，30min，取上清），用20mM PB（磷酸盐缓冲液）pH6.0稀释5倍，通过阳离子亲和层析柱（SPFF,GEHEALTH）进行纯化，将所得蛋白进行浓缩，分装、保存于-80℃备用。
结果如图1B所示，所纯化的uPA具有较高的纯度，可用于后续研究。
(3)tPA的表达与纯化:将含有tPA基因的重组毕赤酵母X-33接种于YPD（1%酵母提取物，2%胰蛋白胨，1%葡萄糖，含100μg/ml Zeocin）28℃培养1天，以1：10接种于BMGY培养基，28℃扩大培养1天，以1：4接种于BMMY培养基进行诱导表达，继续培养3天，每天补加1%的甲醇。收蛋白（离心10000rpm，30min，取上清），用20mM AB（醋酸盐缓冲液）pH4.5稀释5倍，通过阳离子亲和层析柱（SPFF,GEHEALTH）进行纯化，将所得蛋白进行浓缩，分装、保存于-80℃备用。
结果如图1C所示，所纯化的tPA具有较高的纯度，可用于后续研究。
实施例三PAI-Trap的活性测定
PAI-1的酶活测试主要参照已报道的显色法（Chromogenic Assay）进行(Liang,A.,et al.,2005)。简而言之，在100μL体系（50mM Tris pH7.4，150mMNaCl）中，将不同浓度PAI-Trap与5nM PAI-1（终浓度）预先孵育10分钟，接着加入5nM uPA混匀在室温下反应10分钟，最后加入发光底物S2444（Chromogenix）并立即放入BioTek Synergy4酶标仪中在405nm处，15秒/读数进行检测10分钟。每个测试至少重复3次。PAI-trap对PAI-1的IC50使用Origin7.5软件中的非线性回归（Sigmoidal）进行拟合。
一种典型的PAI-trapSEQ ID NO.4对PAI-1的竞争性抑制如图3所示。PAI-trap对PAI-1的抑制IC50结果如表1所示，这些PAI-Trap均对PAI-1具有较强的抑制能力，更为重要的是，这些PAI-Trap对另两种丝氨酸蛋白酶抑制剂PAI-2和PN-1几乎无抑制能力，说明这些PAI-Trap对PAI-1具有较好的选择性抑制能力。
表1IC50 a测定表明PAI-Trap特异性抑制PAI-1但不抑制PAI-2和PN-1。
a，IC50值(μM)±S.E.为Grafit IC50拟合值，数值均为3次独立实验结果；
b，在10μM无明显抑制。
实施例四表面等离子共振技术检测PAI-Trap与PAI-1蛋白的直接结合能力
表面等离子共振技术（Surface Plasmon Resonance,SPR）已被广泛地应用于研究生物大分子间或大分子与小分子间的相互作用。本发明利用SPR技术测试了PAI-Trap与PAI-1蛋白的结合能力。
在该研究中，我们通过标准氨基偶联的方法将PAI-1蛋白偶联到CM5芯片（Biacore AB,Uppsala,Sweden）表面上。将不同浓度的几种PAI-Trap配置在HBS-EP缓冲液中（HBS-EP缓冲液：10mM HEPES、150mM NaCl、3mMEDTA和0.005%(v/v)表面活性剂P20，pH7.4），BIAcore3000自动进样，PAI-Trap通过偶联PAI-1蛋白的通道表面（以空白通道为参照），系统自动将检到的结合信号转换成反映PAI-Trap与PAI-1结合和解离过程的实时传感图，纵坐标RU值（Response unit）的大小表示二者结合的强弱。然后利用BIAevaluation分析软件version3.1(Biacore)来测定化合物的解离常数(Kd)。
一种典型的PAI-trapSEQ ID NO.5与PAI-1结合如图4所示，PAI-Trap能浓度依赖性地与偶联在芯片上的PAI-1蛋白相结合。利用BIAevaluation分析软件version3.1(Biacore)进行拟合测得各种PAI-Trap与PAI-1的结合常数Kd值如表2。
表2几种PAI-Trap（uPA-SPD变体）与PAI-1结合的动力学参数
PAI-Trap Kon(105/Ms) Koff(10-4/s) Kd(nM)
S195A 7.76±0.60 12.07±0.50 1.57±0.20
Y60bK/S195A 16.97±2.37 6.20±0.25 0.37±0.06
G37bR/S195A 22.96±5.41 6.98±0.32 0.32±0.06
R217L/S195A 13.26±0.40 8.40±0.56 0.63±0.03
G37bR/Y60bK/S195A 23.48±16.11 11.43±4.17 0.83±0.53
kon，结合速率常数；koff，解离速率常数；Kd，平衡解离常数；Kd=koff/kon。实施例五SDS-PAGE法检测PAI-Trap对PAI-1和uPA（或tPA）相互作用的影响
在体内，PAI-1是uPA和tPA的天然抑制因子。作为丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serpin）家族的成员之一，PAI-1是以自杀性底物的方式抑制uPA和tPA。RCL是PAI-1发挥抑制活性的重要部位，它能插入到其靶酶纤溶酶原激活物（PA）的催化中心并与其共价结合，导致靶酶催化中心构象变形而失活。为此，本发明测试了PAI-Trap作为PAI-1的抑制剂对PAI-1和uPA及tPA相互作用的影响。
该测试是通过还原型SDS-PAGE方法来进行的。将4nM PAI-1与一种PAI-TrapSEQ IDNO.5(4、8、12、16nM)或对照缓冲液（150mM NaCl、20mMTris7.4）预先孵育10分钟，然后加入2nM uPA或tPA，于37℃反应15分钟。加入上样缓冲液（100mM Tris-HCl，pH6.8，10%十二烷基磺酸钠，0.5%溴酚蓝，50%甘油，5%β-巯基乙醇），沸水浴煮10分钟，离心，去上清进行SDS-PAGE电泳。结果如图3所示，随着PAI-Trap浓度的增加，uPA或tPA与PAI-1形成的复合物量逐渐减少，即PAI-Trap能浓度依赖性的抑制PAI-1-uPA和PAI-1-tPA共价复合物的形成，结果如图5所示。该结果说明，PAI-Trap直接抑制了PAI-1和uPA或tPA的相互作用。
实施例六PAI-Trap对纤维蛋白凝块形成的抑制作用
在生理条件下，机体通过纤溶酶原激活因子（uPA和tPA）激活的纤维蛋白酶原(Plasminogen)为活性的纤维蛋白酶，后者能清除体内形成的纤维蛋白，防止其在血管壁及其他组织沉积；同时机体又通过PAI-1对uPA和tPA的调控将血液中的纤维蛋白酶活性在一定范围内，避免纤溶过度而出现出血倾向。因此，一旦血液循环中PAI-1水平过高导致PA活性受抑制，则会造成局部纤溶活性受抑制，血液呈现高凝状态，容易诱发血栓形成。为此，本发明测试了几种PAI-Trap对PAI-1引起的纤维蛋白凝块形成的抑制作用。
在该实验中，我们先将200nM PAI-1(终浓度)和350nM(终浓度）待测的几种PAI-Trap或空白对照（等体积缓冲液）在96孔板孵育于50ul缓冲液(20mMTris，pH7.4、130mM NaCl、0.05%Tween-20)10分钟，然后加入200nM（终浓度）tPA-SPD反应10分钟。接着加入100ul小牛无血小板血浆和15mM CaCl2（终浓度），然后在BioTek SynergyTM4读板机于405nm处实时跟踪反应，30秒/读数，连续读取1小时。结果如图6所示，在凝血酶的作用下，纤维蛋白凝块在12分钟内即迅速地形成，当tPA存在时凝块被迅速降解，PAI-1能抑制tPA对凝块的降解。而PAI-Trap能快速显著地抑制PAI-1进而促使血块被tPA所降解。

Claims (12)

1.一种氨基酸序列，其特征在于，所述序列选自SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.15。
2.一种PAI-1抑制剂，所述PAI-1抑制剂包含突变S195A的uPA水解酶结构域或tPA水解酶结构域。
优选地，所述PAI-1抑制剂具有结合并抑制PAI-1的能力。
3.权利要求2的PAI-1抑制剂，所述PAI-1抑制剂还包含选自如下的突变G37bR、Y60bK、A96E和R217L，具有与PAI-1的结合力；
优选地，所述PAI-1抑制剂包含突变G37bR和Y60bK。
4.权利要求2或3的PAI-1抑制剂，所述uPA水解酶结构域的氨基酸序列是SEQ ID NO.1，所述tPA水解酶结构域的氨基酸序列是SEQ ID NO.2。
优选地，编码SEQ ID NO.1的氨基酸序列的核苷酸序列是SEQ ID NO.10，编码SEQ ID NO.2的氨基酸序列的核苷酸序列是SEQ ID NO.11。
5.权利要求2的PAI-1抑制剂，所述PAI-1抑制剂的氨基酸序列是SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.15。
优选地，编码本发明的PAI-1抑制剂的核苷酸序列选自SEQ ID NO.12、SEQID NO.13、SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.16。
6.编码权利要求1的氨基酸序列或者权利要求2-5任一项的PAI-1抑制剂的核苷酸序列。优选地，所述序列选自SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、14或SEQ ID NO.16。
7.包含权利要求6的核苷酸序列的载体。
优选地，所述核苷酸序列编码SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.15的氨基酸序列。
优选地，编码本发明的PAI-1抑制剂的核苷酸序列选自SEQ ID NO.10、SEQID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.16。
8.一种细胞，其包含权利要求6的核苷酸序列或权利要求7的载体。
9.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求1的氨基酸序列或者权利要求2-5任一项所述的PAI-1抑制剂。
10.权利要求1的氨基酸序列或者权利要求2-5任一项所述的PAI-1抑制剂或权利要求9的组合物在制备用于抑制PAI-1的药物中的用途；
优选地，权利要求1的氨基酸序列或者权利要求2-5任一项所述的PAI-1抑制剂或权利要求8的组合物在制备用于治疗血栓性疾病、糖尿病或恶性肿瘤的药物中的应途。
11.权利要求1的氨基酸序列或者权利要求2-5任一项所述的PAI-1抑制剂或权利要求8的组合物在制备检测PAI-1的试剂中的应途。
12.权利要求8的细胞的应用，其特征在于，所述细胞用于表达所述PAI-1的抑制剂。
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