CN104788339B - 一种棉酚衍生物及其在抑制脲酶活性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及肥料技术领域，具体涉及一种棉酚衍生物及其在抑制脲酶活性中的应用。本发明棉酚衍生物的化学结构通式为，式中R表示氨基酸中除氨基外的部分；所述氨基酸为含伯氨基的氨基酸。本发明棉酚衍生物以棉酚为醛基提供试剂，利用氨基酸的氨基对棉酚的醛基进行修饰制备得到。将本发明所述棉酚衍生物应用于制备脲酶抑制剂时，抑制脲酶的效果好，抑制土壤氨挥发效果的IC₅₀值低至1.56×10^‑5 mol·L^‑1。与棉酚原料相比，本发明棉酚衍生物溶解性更好，更稳定，方便使用，部分棉酚衍生物脲酶抑制活性显著增强。

Description

一种棉酚衍生物及其在抑制脲酶活性中的应用

技术领域

本发明涉及肥料技术领域，具体涉及一种棉酚衍生物及其在抑制脲酶活性中的应用。

背景技术

为了满足日益增长的粮食需求，提高单位面积的粮食产量成为必然选择，其中肥料的贡献率逐步提高。尿素是目前我国农业生产中应用最广泛、数量最多的氮肥，约占50%的世界氮肥生产及消费市场，同时还是牛、羊、兔等反刍动物用来合成自身蛋白的最廉价且广泛使用的非蛋白氮饲料。尿素本身无毒，能够稳定地存在于水溶液中，但环境和生物体中广泛存在的脲酶（Urease）能将尿素迅速催化水解成NH₃，其速度是未经催化水解的1014倍，极大地降低了动植物对氮素的利用率。尿素的快速分解，不仅造成农业资源的严重浪费，同时对人类、动物和植物等也有严重的危害：导致植物“烧苗”和亚硝酸盐污染农产品，引起严重的环境氮污染和农村面源污染，并导致水体富营养化。因此，如何提高尿素利用率，解决脲酶所引起的经济、环境和健康等问题，已成为当前农、牧业生产上一个迫切需要解决的难题，也是当今世界经济和农业可持续发展上的一个挑战性课题。

脲酶的活性是影响尿素分解的最主要因素。在土壤脲酶作用下，尿素在土壤中水解为简单无机离子，速度非常快，通常在15天内就接近完全。若要使尿素的分解速度与植物吸收氮的速度大致同步，关键是要控制能引起尿素分解的脲酶的活性，目前较为常用的做法是在尿素中添加适量脲酶抑制剂。脲酶抑制剂是对土壤脲酶活性有抑制作用的一类物质，它在短期内能延缓尿素的水解，减少氮的损失。通过添加适量脲酶抑制剂抑制土壤中脲酶的活性，可以达到延缓尿素的水解，提高氮肥利用率的目的。

至今已使用过的脲酶抑制剂有100多种，主要分为银、汞等金属盐、有机物小分子和植物提取物等三大类。由于金属盐毒性较大，限制了其应用；有机类小分子则高残留、毒副作用大、易溶易流失、有效抑制时间短；而植物源脲酶抑制剂一般具有制剂成分复杂、不易标准化、发挥药效慢等缺点。

公开号为CN101687045A的发明专利公开了脲酶抑制剂的组合物，脲酶抑制剂主要为正丁基膦酰三胺(NBTP)、二氨基苯基磷酸酯(PPDA)或它们的混合物，稳定剂主要为聚乙二醇、丙三醇、一缩二丙二醇，或它们的混合物。公开号为CN101891546A的中国专利公开了一种具有脲酶抑制作用的包膜尿素，具有脲酶抑制作用的活性成份主要为黄腐酸、黑腐酸、腐植酸盐等。公开号为CN1781879A的专利公开了一种脲酶和硝化抑制剂组合型缓释尿素及其制备方法，所用脲酶抑制剂主要为N-甲基-2-吡咯烷酮。公开号为CN102249817A的专利公开了一种抑制土壤氮流失的制剂、制备其应用，脲酶抑制剂主要为氢醌。

棉酚大量存在于棉籽和棉根皮中，棉籽仁中的棉酚质量分数通常接近1%。长期以来，由于棉酚毒性和色泽的原因，棉籽蛋白和棉籽油的应用受到很大限制。从棉籽中提取棉酚除可提供优质蛋白原料和食用油外，还可得到大量棉酚副产物。棉酚低毒、无残留，但目前除少量用作避孕药外，用作其它药物的原料药尚在研究阶段和起步阶段。现有技术中，也有利用棉酚的性质制备出一些新型的棉酚衍生物，但多是用于抗病毒、抗肿瘤或治疗白血病等，还没有发现棉酚衍生物在脲酶抑制剂中的应用。

发明内容

针对现有技术中脲酶抑制剂的不足，以及棉酚在脲酶抑制应用方面技术的不足，本发明提供一种新结构的棉酚衍生物。

本发明的另一个目的是提供一种新结构的棉酚衍生物在抑制脲酶活性中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种新结构的棉酚衍生物的制备方法。

本发明的上述目的通过以下技术方案予以实现。

一种棉酚衍生物，具有如下化学通式所述结构：

其中，式中R表示氨基酸中除氨基外的部分；所述氨基酸为含伯氨基的氨基酸，包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、组氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸。

本发明棉酚衍生物通过去除醛基消除了棉酚不稳定的因素之一，而引入的氨基酸具有较强的亲水性，增加了应用于土壤溶液过程的溶解性。这些棉酚衍生物中，部分脲酶抑制活性强于棉酚，部分弱于棉酚，但可以从中筛选出脲酶抑制活性适宜且经济实用的新型脲酶抑制剂。

优选地，所述氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、色氨酸、苯丙氨酸或谷氨酸。筛选其中脲酶抑制活性高的，更优选地，所述氨基酸为甘氨酸或丙氨酸。上述氨基酸制成棉酚衍生物的脲酶抑制活性较高，可有效替代棉酚用于土壤中脲酶的抑制。

本发明还提供上述棉酚衍生物在抑制脲酶活性中的应用。

上述棉酚衍生物的制备方法，包括如下步骤：

S1. 将棉酚原料和氨基酸分别溶于适量溶剂中，分别溶解混匀；

S2. 将S1得到的两种溶液混合，通N₂，在30~80℃条件下加热回流搅拌，2~10h后冷却，过滤得到粗产品；

S3. 用洗涤液对S2所得粗产品洗涤2~3次至洗涤液无色，即得到棉酚衍生物产物；

其中，S1所述棉酚原料和氨基酸的摩尔比为1:2~3；

S1所述溶剂为乙醇、丙酮、正丁醇、异丙醇、甲醇或石油醚；

S3所述洗涤液为乙醇。

上述制备棉酚衍生物的方法，以棉酚为醛基提供试剂，利用氨基酸的氨基对棉酚的醛基进行修饰，反应总方程式如下：

本发明的棉酚衍生物通过氨基酸的伯氨基与棉酚的醛基反应生成棉酚衍生物席夫碱得到，是基于修饰较活泼的醛基，保留活性羟基的原理下制备得到上述新结构的棉酚衍生物。

优选地，S1所述溶剂为乙醇或丙酮，棉酚原料：溶剂= 1:10~100，氨基酸：溶剂=1:20~200；上述比例均为质量比。为利于溶解，调节pH至7.0-7.5促进溶解，更优选地，棉酚原料：溶剂= 1:20~80，氨基酸：溶剂=1:50~150；上述比例均为质量比。

优选地，S1所述棉酚原料为纯棉酚、醋酸棉酚或棉酚溶液。

优选地，S1所述棉酚原料为醋酸棉酚，结构式为：，且醋酸棉酚含量＞98%。更优选地，醋酸棉酚:氨基酸=1:2，上述比例为摩尔比。

优选地，S1所述棉酚原料为溶剂法浸提棉籽或榨油棉籽饼后的棉酚溶液，质量分数浓度为0.5~10%。更优选地，所述棉酚溶液的质量分数浓度为1-2%，棉酚溶液:氨基酸=1:2，上述比例为摩尔比。

微热或加氢氧化钠溶液能促进氨基酸的溶解，优选地，S1所述溶解混匀的方法为加热至30~50℃或加氢氧化钠调节溶液pH 7.0~7.5。

优选地，所述氨基酸为甘氨酸，包括如下步骤：

S1. 将醋酸棉酚溶于无水乙醇中，混匀溶解得到醋酸棉酚的乙醇溶液；醋酸棉酚与无水乙醇的质量比为1:50；

S2. 将甘氨酸加入无水乙醇中，滴加氢氧化钠溶液调节pH 7.2，混匀得到氨基酸的乙醇溶液；其中，醋酸棉酚:氨基酸的摩尔比为1:2，甘氨酸:乙醇的质量比为1:120；

S3. 将S1和S2得到的溶液混匀，通N₂，75~80℃加热搅拌回流，2~3h后过滤，沉淀即为粗产品；

S4. 用无水乙醇对S3所述粗产品洗涤2-3次至洗涤液乙醇无色，即得到棉酚衍生物产物。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

（1）本发明棉酚衍生物制成脲酶抑制剂的效果好，抑制土壤氨挥发效果的IC₅₀值低至1.56×10^-5 mol·L^-1。与棉酚相比，本发明棉酚衍生物溶解性更好，更稳定，方便使用，衍生物脲酶抑制活性显著增强。

（2）与当前源于石油化学品合成的脲酶抑制剂相比，由天然产物改性的棉酚衍生物脲酶抑制剂残留低、毒副作用小。

（3）本发明制备得到新的衍生物，为制备组合物或各种应用制剂提供原料。

附图说明

图1为醋酸棉酚抑制土壤氨挥发效果。

图2为实施例1丙氨酸棉酚衍生物抑制土壤氨挥发效果。

图3为实施例2甘氨酸棉酚衍生物抑制土壤氨挥发效果。

图4为实施例3色氨酸棉酚衍生物抑制土壤氨挥发效果。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例中所用试剂均为市售分析纯。

实施例1 制备丙氨酸棉酚

S1. 将2.50g醋酸棉酚溶于200mL无水乙醇中，混匀溶解得到醋酸棉酚的乙醇溶液；

S2. 将0.8g L-丙基酸与80mL无水乙醇混合,搅拌均匀得到氨基酸的乙醇溶液；

S3. 将S1和S2得到的溶液混匀，通N₂，60℃加热搅拌,接回流装置，4h后取下冷却，过滤得到粗产品；

S4. 用20mL乙醇洗涤、过滤，重复2~3次至滤液无色，即得到黄绿色丙氨酸棉酚产物。

实施例2 制备甘氨酸棉酚

S1. 将2.90g醋酸棉酚溶于250mL丙酮中，混匀溶解得到醋酸棉酚的丙酮溶液；

S2. 将0.75g L-甘基酸与150mL乙醇混合,微热,用氢氧化钠调至微碱性，搅拌均匀得到氨基酸的乙醇溶液；

S3. 向S1溶液中通N₂，75℃加热搅拌，加回流装置，缓慢将S2溶液滴加至S1中，3h后冷却,过滤得到粗产品；

S4. 用25mL乙醇对S3所述粗产品洗涤、过滤, 2-3次至滤液无色，即得到黄色甘氨酸棉酚产物。

实施例3 制备色氨酸棉酚

S1. 将2.00g棉酚溶液溶于200mL丙酮中，混匀溶解得到棉酚的丙酮溶液；

S2. 将1.00g L-色氨酸溶于100mL热的无水乙醇中，混匀得到氨基酸的乙醇溶液；

S3. 将S1所得溶液放入三口烧瓶，通N₂，45℃加热搅拌回流，加入S2所得热的乙醇溶液, 8h后冷却至室温，过滤得到粗产品；

S4. 用20mL乙醇对S3所述粗产品洗涤、过滤, 重复2-3次至滤液无色，即得到黄色色氨酸棉酚产物。

应用实施例

供试土壤采自广州华南农业大学校区草坪，为红壤，基本理化性质：有机质含量为19.1 ~ 37.5 g/ kg，全氮含量为0.87 ~ 1.58 g/ kg，全磷含量为0.61 ~ 0.64 g/ kg，pH为5.0 ~ 5.5。土壤采集后铺平风干，过100 目筛，装袋备用。

试验方法：将40 g土分别与实施例1~3制得的产物，以及醋酸棉酚（作为对照）混匀，放入500 mL广口瓶中（按总液体体积计算浓度），加入50mL蒸馏水，摇匀，再加入1.72 g的尿素，摇匀，将20 mL含2 %硼酸以及加入了指示剂的50 mL吸收皿一并放入广口瓶中，置于25℃的培养箱中培养。培养1 d取出，用浓度为0.1 mol/L硫酸溶液进行滴定，直到吸收皿内溶液呈暗红色且30 s内颜色不改变为止，记录硫酸的用量，计算出氨气的释放量。测到的氨气量可反映出土壤脲酶的活性，将原料棉酚处理的样本作为对照。

以醋酸棉酚及其衍生物的不同浓度对应其对尿素酶的抑制率分别作图，以氨气的检出量为纵坐标，抑制剂浓度为横坐标，棉酚衍生物抑制土壤氨挥发的效果分别作图1~4。通过对曲线进行拟合后计算得到各物质抑制土壤氨挥发效果的IC₅₀值为醋酸棉酚5.74×10^-5 mol·L^-1，丙氨酸棉酚：5.91×10^-5 mol·L^-1，甘氨酸棉酚：1.56×10^-5 mol·L^-1和色氨酸棉酚：1.64×10^-4 mol·L^-1。

由于用氨基酸修饰了棉酚的醛基，对棉酚上的活性羟基产生了影响。在改性棉酚与脲酶作用时，这些影响可能表现为促进作用，也可能表现为抑制作用。实施例2的产物表现为促进作用，实施例3的产物表现为抑制作用，实施例1的产物效果与醋酸棉酚相当。

表1 棉酚衍生物与棉酚组合物抑制土壤氨挥发效果的比较

Claims (8)

1.一种棉酚衍生物，其特征在于，具有如下化学通式所述结构：

其中，式中R表示氨基酸中除氨基外的部分；所述氨基酸为甘氨酸或丙氨酸。

2.权利要求1所述棉酚衍生物在抑制脲酶活性中的应用。

3.权利要求1所述棉酚衍生物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1. 将棉酚原料和氨基酸分别溶于适量溶剂中，分别溶解混匀；

S2. 将S1得到的两种溶液混合，通N₂，在30~80℃条件下加热回流搅拌，2~10h后冷却，过滤得到粗产品；

S3. 用洗涤液对S2所得粗产品洗涤2~3次至洗涤液无色，即得到棉酚衍生物产物；

其中，S1所述棉酚原料和氨基酸的摩尔比为1:2~3；

S1所述溶剂为乙醇、丙酮、正丁醇、异丙醇、甲醇或石油醚；

S3所述洗涤液为乙醇。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，S1所述溶剂为乙醇或丙酮，棉酚原料：溶剂= 1:10~100，氨基酸：溶剂=1:20~200；上述比例均为质量比。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，S1所述棉酚原料为纯棉酚、醋酸棉酚或棉酚溶液。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，S1所述棉酚原料为醋酸棉酚，醋酸棉酚含量＞98%。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，S1所述棉酚原料为溶剂法浸提棉籽或榨油棉籽饼后的棉酚溶液，浓度为0.5~10%。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，S1所述溶解混匀的方法为加热至30~50℃或加氢氧化钠调节溶液pH 7.0~7.5。