CN104762200B - 一种核酸检测反应管及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及核酸分析检测领域，特涉及一种用于基于核酸扩增反应的核酸检测反应管及其使用方法。本发明提供了一种核酸检测反应管及其使用方法，包括管盖、管体、反应孔、包埋有核酸扩增反应试剂的凝胶、防止溶液挥发的有机相以及配套使用的光学检测仪。打开管盖，将裂解过的病原体样本或核酸样本加入到多个封装有反应试剂的反应孔中，在防止溶液挥发的有机相保护下，进行核酸扩增反应，反应结果通过光学检测仪进行定性与定量分析。本发明通过核酸扩增，实现对单一样本中的多种病原体或者目标基因进行同时检测，检测耗时短，准确度和灵敏度高，适用于实验研究、临床检测、食品安全检测等领域。本发明具有携带方便、操作简单且样品消耗量少的特点。

Description

一种核酸检测反应管及其使用方法
技术领域
本发明涉及核酸分析检测领域，特涉及一种用于基于核酸扩增反应的核酸检测反应管及其使用方法。
背景技术
2003年SARS在中国大部分地区爆发，2005年禽流感的流行性传播以及2014年在非洲肆虐高致死率的埃博拉疫情，这一系列由病毒引起的传染病告诉我们在人类的发展史上一直受到病毒带来的致命性威胁。病毒的传播与变异大大超出了人类的预计，及时准确地诊断病毒对于提高患者存活率，控制疫情传播以及有效疾病治疗有着非常重大的意义。
常规的病原微生物检测方法是采用体外培养技术，但是，仅有约1％的细菌或病毒可以培养，以及培养过程的复杂性和漫长的培养时间，大大限制了这样技术的普及。随着分子生物学的发展，核酸检测被应用于病毒检测之中，不仅缩短了检测时间还提高了检测的灵敏度和特异性。核酸分子是所有病原体包括病毒在内的遗传载体，通过对特异性的核酸进行检测，可以判断样本中是否存在相应的病毒。聚合酶链式反应(PCR)是最常见的核酸检测方法，该技术的出现使核酸水平的医学检测进入了一个全新的阶段。PCR技术通过在不同温度之间的循环实现DNA分子的复制，该技术需要对温度精确控制，因此依赖于精密的温控装置和专业的人员进行操作。在资源与人力相对匮乏的地区，PCR方法是难以用于病毒检测的。为了克服对温控装置的依赖，一系列等温扩增方法应运而生，比如环介导等温扩增(LAMP)等。环介导等温扩增可以在60-65℃下对目标核酸进行扩增。等温扩增方法不仅可以是一种快速、灵敏、准确的核酸检测方式，同时对温控和检测设备要求简单，大幅降低了设备成本的投入。采用DNA荧光指示剂配合光学检测或者基于焦磷酸镁副产物的浊度检测，可对样品进行定量分析。
在临床病例中，同一种病症可能由多种不同的病原体产生，造成医生诊断与对症开药的困难。采用核酸扩增方法，无论是PCR还是等温扩增，如何同时检测多种病原体或者目标基因一直是临床检测中的一个重大挑战。因此，发明一种操作简单、准确度高、灵敏度高的核酸检测产品，实现多种病原体或者目标基因的同时检测具有重要意义。
发明内容
针对背景技术的不足，本发明提供了一种核酸检测反应管及其使用方法，包括管盖、管体、反应孔、包埋有核酸扩增反应试剂的凝胶、防止溶液挥发的有机相以及配套使用的光学检测仪。打开管盖，将裂解过的病原体样本或核酸样本加入到多个封装有反应试剂的反应孔中，在防止溶液挥发的有机相保护下，进行核酸扩增反应，反应的结果可通过配套使用的光学检测仪进行定性与定量分析。本发明采用一个单反应管，通过核酸扩增，实现对单一样本中的多种病原体或者目标基因进行同时检测，检测耗时短，准确度和灵敏度高，适用于实验研究、临床检测、食品安全检测等领域。本发明具有携带方便、操作简单且样品消耗量少的特点。
本发明的技术方案是：一种核酸检测反应管，包括：管体，管盖，反应孔，包埋有核酸扩增反应试剂的凝胶，其特征在于：所述的反应孔位于管体底部、管体侧壁或者位于管盖内部，所述的凝胶封存于对应的反应孔内。
进一步的，它还包括防止溶液挥发的固体有机相，所述的固体有机相位于管盖内部或管体底部。
进一步的，所述的凝胶为固化的凝胶或经过冷冻干燥后的凝胶压片。
进一步的，所述的管盖、管体和反应孔为一体成型的或者由独立组件组装成型的，其材质为玻璃或塑料。
进一步的，所述的反应孔为一个或者多个。
进一步的，所述凝胶所包埋的核酸扩增反应试剂包括引物、核酸扩增反应所需的酶、缓冲液、三磷酸脱氧核苷酸以及荧光指示剂。
进一步的，所述的凝胶为多糖类或者明胶类物质。
本发明还公开了一种核酸检测反应管的使用方法，反应管为如上所述的反应管，其特征在于：包括样品处理的步骤；
采用移液枪或一次性吸管将样品裂解液加入反应孔后，再将将液体有机相再加入反应管内；
在合适的温度条件下进行扩增反应；
采用配套使用的光学检测仪检测反应结果。
本发明还公开了一种核酸检测反应管的使用方法，反应管为如上所述的反应管，其特征在于：包括样品处理的步骤，
采用移液枪或一次性吸管将样品裂解液加入反应孔后；
在合适的温度条件下进行扩增反应，固体有机相熔解覆盖所有反应孔；
采用配套使用的光学检测仪检测反应结果。
本发明的技术效果体现在：本发明将多个核酸扩增反应体系预存与反应管内，通过一次进样，实现对单一样本中的多种病原体或者目标基因进行同时检测；核酸扩增的结果可通过光学检测或者浊度检测进行定性与定量分析。
附图说明
图1A为反应孔位于管体底部的示意图：
图1B为反应孔位于管体侧壁的示意图：
图1C为反应孔位于管盖内部；
图2A为加入核酸样品后进行扩增反应时的反应管示意图(反应孔位于管体底部)；
图2B为加入核酸样品后进行扩增反应时的反应管示意图(反应孔位于管体侧壁)；
图2C为加入核酸样品后进行扩增反应时的反应管示意图(反应孔位于管盖内部)；
图3为采用本反应管进行特异性核酸检测结果图。
具体实施方式
附图标记说明：1—管体，2—管盖，3—反应孔，4—凝胶，5—固体有机相；6—核酸样品、7—液体有机相，8—阳性孔、9—阴性孔、10—H1N1孔、11—H2N3孔、12—H5N1孔。
下面结合附图对本发明做进一步地详细说明。
如附图1A、图1B、图1C所示，一种核酸检测反应管，包括：管体1，管盖2，反应孔3，包埋有核酸扩增反应试剂的凝胶4，防止溶液挥发的固体有机相5。反应孔3的位置可以位于管体1底部(图1A)、管体1侧壁(图1B)或者位于管盖2内部(图1C)，反应孔3可以是一个或者多个。防止溶液挥发的有机相的密度小于1克每毫升，防止溶液挥发的有机相可以固体的形式固定预先封存于反应管的管盖内部(图1A和图1B)或管体底部(图1C)，也可以以液体的形式在加入检测样品后再加入反应管内。凝胶4封存于对应的反应孔3内，其状态可以是固化的凝胶，也可以是经过冷冻干燥后的凝胶压片。
如附图2A、2B、2C所示，在每个反应孔中加入裂解过的核酸样品6后进行扩增反应，此时，固体有机相5受热融化变成液体有机相7，保护反应孔内的扩增体系，防止溶液挥发。
本发明的管盖2、管体1和反应孔3可以是一体成型的，也可以是由独立组件组装成型的，其材质可以是玻璃或塑料。
本发明的凝胶4所包埋的核酸扩增反应试剂包括引物、核酸扩增反应所需的酶、缓冲液、三磷酸脱氧核苷酸以及荧光指示剂，凝胶4可以是多糖类或者明胶类物质，其熔点低于核酸扩增酶的活性温度。
为了便于使用本发明的核酸检测反应管，配套使用的光学检测仪与本发明装置配套使用，其样品存储单元与本发明装置大小一致，可以根据检测对象和反应体系的不同，采用不同的波段进行检测。
本发明的核酸检测反应管，其可操作的核酸扩增反应可以是以DNA为扩增模板的聚合酶链反应(PCR)、环介导等温扩增反应(LAMP)、滚环扩增反应(RCA)、依赖解旋酶的等温扩增反应(HDA)、重组酶介导的等温扩增反应(RPA)或者其它核酸扩增反应，也可以是以RNA为扩增模板的逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、逆转录环介导等温扩增反应(RT-LAMP)或者其他逆转录核酸扩增反应。
下面通过一个具体的实施方式对本发明做进一步的说明，但具体实施例并不对本发明做任何限定。
实例1：多种病毒的同时检测。
首先制备可用于多种病毒同时检测的反应管：
1)制作基于聚碳酸酯材料的反应管，五个反应孔3位于管体1底部，熔点50℃的固体石蜡封存于管盖2内部；固体石蜡即为固体有机相5。
2)五个反应孔3内分别加入包埋有PRV病毒扩增引物及模板(阳性对照)、无引物(阴性对照)、H1N1病毒扩增引物、H2N3病毒扩增引物、H5N1病毒扩增引物的核酸扩增反应试剂的凝胶4；
3)通过冷冻干燥形成凝胶压片，并于4℃保存。
制备好的反应管可对H1N1、H2N3、H5N1三种病毒进行同时检测：
1)样品处理：将病毒样品于95-100℃热裂解5分钟，样品包含H2N3、H5N1两种病毒；
2)进样：采用移液枪或一次性吸管将病毒裂解液加入五个反应孔3中；
3)反应：在合适的温度条件下进行扩增反应，固体石蜡受热熔解覆盖所有反应孔3，防止溶液挥发；
4)检测：采用配套使用的光学检测仪检测反应结果，如图3所示，阳性孔8荧光较强，阴性孔9荧光较弱，H1N1孔10荧光较弱，H2N3孔11荧光较强，H5N1孔12荧光较强。
根据荧光检测结果可以直接判断出初始样品中包含H2N3和H5N1两种病毒。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种核酸检测反应管，包括：管体(1)，管盖(2)，反应孔(3)，包埋有核酸扩增反应试剂的凝胶(4)，其特征在于：所述的反应孔(3)位于管体(1)底部、管体(1)侧壁或者位于管盖(2)内部，所述的凝胶(4)封存于对应的反应孔(3)内，所述的反应孔(3)为多个。
2.如权利要求1所述的核酸检测反应管，其特征在于：它还包括防止溶液挥发的固体有机相(5)，所述的固体有机相(5)位于管盖(2)内部或管体(1)底部。
3.如权利要求1或2所述的核酸检测反应管，其特征在于：所述的凝胶(4)为固化的凝胶或经过冷冻干燥后的凝胶压片。
4.如权利要求1或2所述的核酸检测反应管，其特征在于：所述的管盖(2)、管体(1)和反应孔(3)为一体成型的或者由独立组件组装成型的，其材质为玻璃或塑料。
5.如权利要求1或2所述的核酸检测反应管，其特征在于：所述凝胶(4)所包埋的核酸扩增反应试剂包括引物、核酸扩增反应所需的酶、缓冲液、三磷酸脱氧核苷酸以及荧光指示剂。
6.如权利要求1或2所述的核酸检测反应管，其特征在于：所述的凝胶为多糖类或者明胶类物质。
7.一种核酸检测反应管的使用方法，反应管为权利要求1所述的反应管，其特征在于：包括样品处理的步骤；
采用移液枪或一次性吸管将样品裂解液加入反应孔(3)后，再将液体有机相(7)加入反应管；
在合适的温度条件下进行扩增反应；
采用配套使用的光学检测仪检测反应结果。
8.一种核酸检测反应管的使用方法，反应管为权利要求2所述的反应管，其特征在于：包括样品处理的步骤，
采用移液枪或一次性吸管将样品裂解液加入反应孔(3)后；
在合适的温度条件下进行扩增反应，固体有机相(5)熔解覆盖所有反应孔(3)；
采用配套使用的光学检测仪检测反应结果。
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