CN104758274A - 异甘草素通过抑制cxcl10表达在制备防治肝炎疾病中抗炎药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药领域，涉及异甘草素通过抑制IFN-γ诱导的CXCL10合成发挥抗炎作用的突破性进展，具体是指异甘草素通过抑制CXCL10表达在制备防治肝炎疾病中抗炎药物中的应用。式(1)所示异甘草素在制备防治肝脏炎症的药物中的应用。所述的药物为具有抗炎作用的药物。本发明提供了异甘草素在肝脏炎症中发挥抗炎作用的应用，在构建肝炎模型的基础上，通过MTT、ELISA、qRT-PCR等实验方法验证异甘草素体外抗炎效果，结果表明异甘草素能够抑制CXCL10的表达，可用于肝炎抗炎制剂的制备，表明了异甘草素的抗炎作用可用于临床中部分肝炎患者。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，涉及异甘草素通过抑制IFN-γ诱导的CXCL10合成发挥抗炎作用的突破性进展，具体是指异甘草素通过抑制CXCL10表达在制备防治肝炎疾病中抗炎药物中的应用。
背景技术
慢性病毒性肝炎的发病是一个多因素相互促进、相互制约的复杂过程。趋化因子,免疫细胞及其分泌的细胞因子积极参与了病毒性肝炎的发生、发展。急慢性肝炎发生发展中肝细胞的凋亡很大程度上是由活化的巨噬细胞、星状细胞和肝细胞本身释放的细胞因子介导的。
CXCL10作为一种趋化因子CXC亚族的成员，又称γ干扰素诱导蛋白10(interferon-gamma inducible protein 10，IP10)。在肝炎的发病中起重要作用,在外源(脂多糖等)和内源(白介素1、干扰素α、干扰素γ等)因子刺激下，可由肝细胞、成纤维细胞、单核/巨噬细胞、T/B淋巴细胞、角质形成细胞和内皮细胞等分泌，IFN-γ是其强的诱导剂。目前已经有临床研究表明慢性活动性肝炎患者中CXCL10水平明显高于正常人。在慢性丙肝(CHC)和慢性乙肝(CHB)病人的血清及肝脏中CXCL10的表达均增高，且CXCL10的高表达与HBV、HCV患者肝脏纤维化的发生密切相关。活动性CHB患者的恢复期，其外周CXCL10表达水平显著下降，表明CXCL10可作为衡量治疗效果及预后的标志。肝组织在干扰素及肿瘤坏死因子α诱导下可分泌高水平的CXCL10，可能成为疾病治疗的靶点。诸多研究表明，CXCL10是肝病过程中将淋巴细胞募集到肝脏的重要因素，可能促进了肝细胞损伤,未来可用作肝脏损伤诊断及治疗成功的有价值的标记。在治疗上应针对CXCL10合成及发挥活性的各个环节予以阻断。例如研制其相应的单克隆抗体、受体抗体及信号转导通路阻断剂等，以期控制该趋化因子对相关免疫细胞的趋化作用，降低有害免疫反应和炎症反应。
异甘草素(isoliquiritigenin)是一种异黄酮类化合物，为黄色针状结晶，难溶于水，溶于极性小的溶剂，如乙醚、氯仿等；已有研究表明虽然异甘草素在甘草中含量仅占万分之七左右，但具有较强的抗病毒、抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗血管生成、催眠等众多生物活等作用，并能扩张动脉，对心脏和脑有保护作用。其中，抗炎作用是近年来研究的热点。异甘草素是一种醛糖还原酶抑制剂，它通过抑制环氧合酶、脂氧合酶、过氧化物酶的活性，来抗血小板凝集，起到抗炎作用。基于以上实验及临床事实，我们认为应进一步开发利用异甘草素。
本发明使用的异甘草素化合物购自成都瑞芬思生物科技有限公司(Chengdu Herbpurify CO.,LTD)，用DMSO配制成10mg/ml,储存于-20℃备用。
异甘草素的结构式如下：
发明内容
本发明的目的在于提出异甘草素在肝炎抗炎治疗中的用途，具体地涉及通过抑制CXCL10表达作为肝炎抗炎治疗的有效辅助手段。
本发明通过以下技术方案来实现：
式(1)所示异甘草素在制备防治肝脏炎症的药物中的应用。所述的药物为具有抗炎作用的药物。
所述抗炎药物中的炎症包括各种病因引发的肝脏炎症反应。所述肝脏炎
症为伴随CXCL10高表达的肝炎疾病。
所述的药物为防治IFN-r诱导靶细胞高表达CXCL10的药物；所述的药物
为抑制CXCL10表达的药物。
所述药物中化合物异甘草素的浓度为5μg/ml，2.5μg/ml或1.25μg/ml。优选的，所述药物中异甘草素的最优浓度为5μg/ml。
首先我们用IFN-r处理HepG2和L02细胞构建炎症模型，MTT实验检测其细胞毒性，ELISA检测CXCL10的表达情况。根据细胞毒性及CXCL10表达水平确定IFN-r最佳刺激浓度和刺激时间；5μg/ml异甘草素预处理能显著抑制CXCL10表达。进一步用RT-PCR实验验证，发现CXCL10的mRNA表达水平亦受到了显著的抑制。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明提供了异甘草素在肝脏炎症中发挥抗炎作用的应用，在构建肝炎模型的基础上，通过MTT、ELISA、qRT-PCR等实验方法验证异甘草素体外抗炎效果，结果表明异甘草素能够抑制CXCL10的表达，可用于肝炎抗炎制剂的制备，表明了异甘草素的抗炎作用可用于临床中部分肝炎患者。
附图说明
图1是IFN-γ或异甘草素处理对HepG2和L02细胞增殖影响的柱状图；图1A显示了不同浓度的IFN-γ在不同的时间点对HepG2和L02细胞的毒性作用，结果显示，和对照组相比，40ng/ml，20ng/ml IFN-γ干预HepG2细胞48h有毒性，各浓度对L02细胞无毒性；从MTT吸光度值及细胞密度来看，宜选取IFN-γ作用48h为宜。图1B显示了不同浓度的异甘草素处理HepG2和L02细胞48h后对增殖影响的柱状图；结果显示宜选取异甘草素5ug/ml以下药物浓度作为干预浓度。
图2是不同浓度的IFN-γ刺激HepG2和L02细胞不同时间后CXCL10表达的柱状图；结果发现CXCL10表达呈剂量-时间依赖性增高。
图3是不同浓度的异甘草素预处理1小时后再用IFN-γ刺激HepG2和L02细胞48h后CXCL10的表达情况:5ug/ml，2.5ug/ml，1.25ug/ml的异甘草素呈剂量依赖性的抑制CXCL10的表达。
图4是不同浓度的异甘草素预处理1小时后再用IFN-γ刺激HepG2和L02细胞后CXCL10mRNA的表达水平。结果显示异甘草素呈剂量依赖性的抑制CXCL10mRNA的表达。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述的实施例和附图并不是本发明的全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性内容的前提下所获得的所有其他实施例，做出的修正和改变也属于本发明的保护范围内。
如无特殊说明，本发明实施例中所需要的材料、试剂均可市场购得。
本发明通过IFN-γ刺激HepG2和L02细胞诱导CXCL10高表达构建炎症模型的基础上，通过MTT，ELISA，qRT-PCR等探析异甘草素通过抑制CXCL10的体外抗炎功效。
所述包括以下操作：
以下实施例的数据均采用SPSS16.0统计分析软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)对两组及多组间的均数进行比较，数据以mean±SD表示(n＝5)。
实施例1.MTT法检测IFN-γ及异甘草素对细胞增殖的影响。
实验材料：IFN-γ,异甘草素，DMSO,DMEM，FBS,PBS
实验方法：
IFN-γ配制：IFN-γ购买自peprotech公司，根据说明书在超净台中将100μg粉末配制成终浓度为100μg/ml的储存液，-20℃保存。
异甘草素购自成都瑞芬思生物科技有限公司(Chengdu Herbpurify CO.,LTD)。于超净台中将10mg异甘草素溶于1mL DMSO溶液中配制成10mg/ml母液，过滤除菌，分装成50ul/管，-20℃保存备用。
细胞刺激因子IFN-γ以40ng/ml，20ng/ml，10ng/ml，5ng/ml，2.5ng/ml，1.25μg/ml刺激HepG2和L02细胞12，24，48小时，设阴性对照组及空白对照组，MTT法检测化合物对HepG2和L02细胞的毒性影响。具体步骤如下：1)收集并对细胞悬液进行计数，以104个细胞/孔的密度接种于96孔板中，5％CO2，37℃孵育；2)16h后换为上述浓度梯度的IFN-γ的新鲜培养基，设置5个复孔，继续孵育；3)分别于12，24和48小时三个时间点吸弃培养基，PBS洗两遍后加入20μl MTT溶液(终浓度为5mg/ml，Sigma)继续培养4h；4)小心吸弃孔内溶液，PBS洗两遍后每孔加入150μl二甲基亚砜，继续培养10min后拿出，振摇使结晶物充分溶解，用Bio-Rad酶联检测仪读取各孔在490nm处的吸光度值。
配制异甘草素浓度为1.25,2.5,5,10,20μg/ml细胞悬液以104个细胞/孔接种于96孔板，设阴性对照组及空白对照组，每组设5个复孔，培养48h后，按照上述步骤(3-4)操作，测定OD值。实验重复3次。计算平均值。
如图1A所示，和对照组相比，40ng/ml，20ng/ml IFN-γ对HepG2细胞有毒性，各浓度对L02细胞无毒性作用。因此采用10ng/ml作为刺激浓度。如图1B所示10μg/ml及以上的异甘草素浓度对HepG2和L02有很强的细胞毒性，5μg/ml及以下的异甘草素浓度对这两种细胞都没有细胞毒性，因此后续实验采用5μg/ml及以下浓度进行药物干预实验。
实施例2.IFN-γ诱导HepG2和L02细胞高表达CXCL10炎症模型构建
实验材料：IFN-γ,DMEM培养基，胎牛血清,磷酸盐缓冲液PBS，异甘草素，CXCL10ELISA试剂盒购于Raybiotech公司
以104个细胞/孔的密度将细胞接种于96孔板中，16小时后换为分别含10ng/ml，5ng/ml和2.5ng/ml浓度IFN-γ的新鲜培养基刺激HepG2和L02细胞培养，以不含IFN-γ的培养基作为空白对照，每组设置5个复孔。在12，24，48小时后分别收集各孔细胞上清，1000g离心5min去除细胞碎片后用于ELISA检测，根据ELISA试剂盒说明书，检测CXCL10表达情况。
如图2所示，10ng/ml IFN-γ作用48h后，HepG2和L02细胞中CXCL10的表达水平均最高，空白对照组表达水平低于检测限，结合图1结果，最终确定采用10ng/ml的IFN-γ浓度作用于HepG2和L02细胞48h来构建肝细胞高表达CXCL10的炎症模型。
实施例3.异甘草素对CXCL10分泌表达的影响
实验材料：IFN-γ,DMEM培养基，胎牛血清,磷酸盐缓冲液PBS，异甘草素，CXCL10ELISA试剂盒购于Raybiotech公司
将HepG2和L02细胞以104个细胞/孔接种到96孔板中，16h后以5μg/ml，2.5μg/ml和1.25μg/ml浓度的化合物预处理HepG2和L02细胞1小时后，加入终浓度为10ng/ml IFN-γ，实验设置空白对照组，IFN-γ对照组(只加IFN-γ)和单纯药物组(5μg/ml)，48h后收集各孔细胞上清，1000g离心5min去除细胞碎片后用于ELISA检测，根据ELISA试剂盒说明书，检测CXCL10表达情况来观察异甘草素对CXCL10分泌情况的影响。
如图3所示，在HepG2和L02细胞中，空白对照组CXCL10表达均低于检测限，IFN-γ组CXCL10均高表达，而5μg/ml，2.5μg/ml和1.25μg/ml的异甘草素呈剂量依赖性地抑制了CXCL10的表达，与IFN-γ组相比有显著性差异。在安全剂量范围内，5μg/ml是优选浓度，抑制CXCL10效果最明显。
实施例4.荧光实时定量PCR观察异甘草素对CXCL10mRNA表达水平的影响
实验材料：RNA提取试剂Trizol，无水乙醇，异丙醇，DEPC水，CXCL10引物，GAPDH引物，Takara逆转录试剂盒，ABI SYBR Green试剂盒，紫外分光光度计，ABI荧光定量7900PCR仪。
实验设置空白对照组，IFN-γ组，IFN-γ分别加5μg/ml，2.5μg/ml和1.25μg/ml异甘草素的实验组及5μg/ml异甘草素组。参照实施例3的实验步骤处理细胞48小时后，胰酶消化后收集细胞,Trizol法提取总RNA，用紫外分光光度计测定浓度，取1μg RNA量进行逆转录，反应体系20μl，合成的cDNA作为模板利用荧光定量PCR法检测各组细胞内CXCL10mRNA表达水平,以GAPDH作为内参。以上均可参照相关试剂说明书操作。Real-Time PCR反应体系：cDNA模板2μl 2×SYBR Green Taq反应液10μl、CXCL10(上游：5’-GCTGTACCTGCATCAGCATT-3’,下游：5’-ATGGCCTTCGATTCTGGATT-3’)或GAPDH(上游：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，下游：5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’)的正反义引物各0.4μl、Rox II 0.4μl，RNase-Freewater 6.8μl。PCR反应条件为95℃30s；95℃5s，60℃30s，共40个循环。融解曲线分析：95℃15s；60℃1min，95℃15s。所得数据通过方法计算所有目的基因相对表达水平。
结果如图4所示，以空白对照组为基数1，计算IFN-γ组和其他药物组的相对值，结果表明异甘草素可以随着浓度的增加显著下调CXCL10mRNA表达，与IFN-γ组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)
综上所述，实验证明异甘草素具有抑制IFN-γ诱导的CXCL10高表达的作用，且呈剂量依赖性地抑制CXCL10表达。异甘草素可能通过干扰CXCL10合成的某些步骤或者其他未知机理发挥抗炎作用，值得临床应用并进一步深入研究其确切机制。
Claims (9)
1.式(1)所示异甘草素在制备防治肝炎疾病中抗炎药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抗炎药物中的炎症包括各种病因引发的肝脏炎症反应。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述肝脏炎症为伴随CXCL10高表达的肝脏炎症。
4.异甘草素在制备治疗伴随CXCL10高表达的肝炎疾病的药物中的应用。
5.异甘草素在制备抑制CXCL10表达的药物中的应用。
6.异甘草素在制备抑制用IFN-γ刺激细胞分泌CXCL10的药物中的应用。
7.根据权利要求1-6任一所述的应用，其特征在于：所述药物中异甘草素的浓度为1.25-5μg/ml。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述药物中异甘草素的浓度为5μg/ml，2.5μg/ml或1.25μg/ml。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述药物中异甘草素的浓度为5μg/ml。
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