CN104741374B - 一种对石油污染土壤进行生物修复的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及属于分子生物学技术和污染土壤修复技术交叉领域，具体的说是一种利用广宿主自转移降解质粒对石油污染土壤进行生物修复的方法。将携带含有石油烃降解基因和遗传选择标记的广宿主自转移降解质粒的宿主菌接种到待处理的污染土壤中，并添加营养液，通过微生物间的接合转移作用，使广宿主自转移质粒所携带的降解基因发挥高效降解作用，进而达到持久修复石油烃污染土壤的目的。本发明有别于传统方法中接种降解菌的操作。接种后通过接合转移，广宿主降解质粒转至污染土壤土著菌群，使得降解基因发生水平转移，在具有生长竞争优势的土著细菌中表达并发挥降解功能，避开了接种菌株难以长期存活的“瓶颈”问题，达到持久修复石油烃污染的目的。
Description
技术领域
本发明涉及属于分子生物学技术和污染土壤修复技术交叉领域，具体的说是一种利用广宿主(Broad host range,BHR)自转移降解质粒对石油污染土壤进行生物修复的方法。
背景技术
石油是一种含有多种烃类(正烷烃、支链烷烃、芳香烃、脂环烃)及少量其他有机物(硫化物、氮化物、环烷酸类等)的复杂混合物，是人类最主要的能源之一。但是，随着石油开采和使用量的增加，大量的石油及其加工品进入环境，其中原油开采和冶炼过程中的工业污水排放和溢油泄漏事故是导致土壤石油烃污染的主要原因，不仅破坏了生态环境，还可通过食物链的生物富集作用而直接危害人类健康。特别是多环芳烃(Polycyclic AromaticHydrocarbon，PAHs)，由于其生物可利用度差、半衰期较长，并且大多具有致畸、致癌和致突变效应，因此成为人类健康的巨大威胁。我国石油工业发展迅速，但也随之带来严重的环境污染问题，有近千万亩的耕地受到不同程度的石油烃污染。
环境中的微生物由于其高度的遗传多样性和功能多样性，在污染物降解过程中发挥着重要作用，从实验室分离高效功能微生物并投加到环境中加速污染物的代谢是目前主要采用的微生物修复方式。但由于接种的高效降解菌与土著微生物在营养和空间上的竞争及环境中的各种不利条件，往往导致接种的功能微生物很难存活，不能持久发挥生物修复作用。这一问题成为制约生物修复技术高效、持久发挥作用的“瓶颈”。为解决上述“瓶颈”问题，有学者提出接种携带特定降解基因的可移动基因原件，其中包括广宿主可自转移质粒(Self-transmissible broad host range plasmids)，接种后，随着广宿主代谢质粒在环境中的水平基因转移，降解基因转移至土著细菌并在其中表达，可使具有竞争性的土著微生物获得降解能力，从而持久发挥降解石油烃的功能。这种由广宿主质粒水平基因转移介导的生物修复提出了与传统生物修复技术完全不同的思路和概念，有望成为一种新的污染物生物修复途径。
水平基因转移是指在差异生物个体之间所进行的水平遗传物质的交流。原核生物之间的水平基因转移主要有3种机制：转化、转导和接合转移，其中由广宿主可自我转移质粒介导的接合转移是最为常见和广泛的基因水平转移方式。所谓的“广宿主质粒”被定义为至少能够在Proteobacteria两个亚纲(例如β-,γ-)之间互相转移并稳定传代的质粒。广宿主质粒的结构一般由两个区域组成，一个是质粒骨架(与质粒的复制、稳定性和可转移性有关)，一个是装配基因(能够赋予宿主特定的表型，例如抗药性、金属抗性、降解污染物特性等)，这两个区域一般形成“嵌合”结构。在污染土壤这一独特生境中，由广宿主质粒介导的细菌之间的基因交流在加速污染物代谢和菌群适应污染环境的过程中发挥着非常重要的作用。对于采用广宿主自转移质粒对石油烃污染环境进行综合治理，目前尚未见比较成熟的报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种利用广宿主自转移降解质粒对石油污染土壤进行生物修复的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种利用广宿主自转移降解质粒对石油污染土壤进行生物修复的方法，将携带含有石油烃降解基因和遗传选择标记的广宿主自转移降解质粒的宿主菌接种到待处理的污染土壤中，并添加营养液，通过微生物间的接合转移作用，使广宿主自转移质粒所携带的降解基因发挥高效降解作用，进而达到持久修复石油烃污染土壤的目的。
所述营养液成分为：(NH4)2SO4 0.5g/L，NaNO3 0.5g/L，MgSO4 7H2O 0.2g/L，KH2PO41.0g/L和NaH2PO4H2O l.0g/L；营养液的添加量为100-150ml/kg干土。
所述遗传选择标记为：抗生素抗性基因、β-半乳糖苷酶基因(lacZ)或绿色荧光蛋白基因(gfp)。
所述石油烃降解基因为：编码芳香环羟化双加氧酶基因(phdA)、甲苯单加氧酶基因(touA)、编码苯双加氧酶基因(ben)、编码甲苯双加氧酶基因(tod)中一种或几种。
所选用广宿主自转移降解质粒，含有石油烃降解基因并带有用于鉴定接合子的遗传选择标记；能够在变形菌α-Proteobacteria,β-Proteobacteria,γ-Proteobacteria不同亚纲之间转移并稳定传代；同时是基因组大小在50kb以上的嵌合结构，包括质粒骨架(与质粒的复制、稳定性和可转移性有关)和装配基因，装配基因含有与石油烃降解相关的基因。
具体是，pS3-2G质粒，大小为106kb；其抗生素标记为抗卡那霉素(KmR)，降解基因为芳香环羟化双加氧酶基因(phdA)、苯双加氧酶基因(ben)、二甲苯单加氧酶基因(touA)、水杨酸羟化酶基因(nahG)、邻苯二酚2,3-双加氧酶基因(C23O)；pS7-2G质粒，大小为65kb；其遗传标记为β-半乳糖苷酶基因(lacZ)，降解基因为芳香环羟化双加氧酶基因(phdA)、苯双加氧酶基因(ben)、二甲苯单加氧酶基因(touA)、水杨酸羟化酶基因(nahG)、邻苯二酚2,3-双加氧酶基因(C23O)；pA23-1G质粒，大小为72kb；其抗生素标记为抗卡那霉素(KmR)，降解基因为芳香环羟化双加氧酶基因(phdA)、苯双加氧酶基因(ben)、二甲苯单加氧酶基因(touA)、水杨酸羟化酶基因(nahG)、邻苯二酚2,3-双加氧酶基因(C23O)；pW22-3G质粒，大小为77kb；其遗传标记为绿色荧光蛋白(gfp)，降解基因为芳香环羟化双加氧酶基因(phdA)、苯双加氧酶基因(ben)、二甲苯单加氧酶基因(touA)、水杨酸羟化酶基因(nahG)、邻苯二酚2,3-双加氧酶基因(C23O)；pA15-7G质粒，分离自石油污水灌渠底泥，大小为85kb；其抗生素标记为抗卡那霉素(KmR)，降解基因为苯双加氧酶基因(ben)、二甲苯单加氧酶基因(touA)、水杨酸羟化酶基因(nahG)、邻苯二酚2,3-双加氧酶基因(C23O)；pA10-1C质粒，大小为55kb；其抗生素标记为抗四环素(TcR)，降解基因为芳香环羟化双加氧酶基因(phdA)、苯双加氧酶基因(ben)、二甲苯单加氧酶基因(touA)。以上质粒DNA均可在中国科学院沈阳应用生态研究所菌种保藏中心购得(http://www.iae.ac.cn/2007/0024039.html)，相应编号为pS3-2G，pS7-2G，pA23-1G，pW22-3G，pA15-7G，pA10-1C。
所述宿主菌可选自变形菌α-,β-,γ-Proteobacteria任一亚纲菌株。宿主菌染色体带有利福霉素抗性(RifR)选择标记。
具体宿主菌为：根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)C58(利福平抗性)【Wood DW,Setubal JC,Kaul R,Monks DE,et al.The genome of the natural geneticengineer Agrobacterium tumefaciens C58.Science,2001,2317-2323】；恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)UWC1(利福平抗性)【Winnie Dejonghe,Johan Goris,elFantroussi,Monica Paul de Vos,Willy Verstraete,and Eva M.Top.Effect ofDissemination of 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid(2,4-D)Degradation Plasmids on2,4-D Degradation and on Bacterial Community Structure in Two Different SoilHorizons.Applied and Enironmental Microbiology,2000,3297-3304】；钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)JMP228(利福平抗性)【Eva M.Top,William E.Holben,and LarryJ.Forney.Characterization of Diverse 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid-Degradative Plasmids Isolated from Soil by Complementation.Applied andEnironmental Microbiology,1995,1691-1698】。
而后将上述各广宿主自转移降解质粒按照常规方法分别转移至上述变形菌α-,β-,γ-Proteobacteria不同亚纲菌株中，即得到携带有石油烃降解基因和遗传选择标记的广宿主自转移降解质粒的宿主菌，保藏于冷冻的甘油管中，待用。
所述修复技术具体方法为：
1)宿主菌活化和扩大培养：
将保存于甘油管的携带广宿主自转移质粒的宿主菌接种到含相应双选择标记(宿主菌的选择标记和质粒的选择标记)的LB固体培养基上进行菌株活化，平板上活化的菌株再接种于含相应双选择标记的LB液体培养基摇瓶中，振荡培养至菌液的菌体密度达5.0×106CFU/mL；将上述培养好的菌液按5％体积接种量接种到LB液体培养基进行扩大培养，培养至1.0×109CFU/mL；
2)菌剂制备和接种：将上述发酵液离心，采用无菌水洗涤菌体，并调整菌液浓度至1.0×108CFU/mL，而后将菌液按105-106CFU/g干土的接菌量接种到石油烃污染的土壤中，再添加营养液，调整含水量为15％-20％，培养时间为2-18周；进而达到持久修复石油烃污染土壤的目的；营养液的添加量为100-150ml/kg干土。
3)测定接合效率：为了解广宿主自转移质粒在土壤中是否发生接合转移及其接合转移效率，以接合子和宿主菌的比率作为指示指标，计算公式：E(接合效率)＝n(接合子数目)/N(宿主菌数目)。根据广宿主质粒所携带的遗传选择标记，采用抗性培养基、营养缺陷培养基或荧光共聚焦显微镜计数宿主菌和接合子总的数量；根据宿主菌所携带的遗传选择标记或营养缺陷型，将携带质粒的宿主菌区分出来。
4)土壤石油烃污染物降解率的测定：为了解广宿主降解质粒的生物修复效果，根据培养前和处理后污染物残留量，计算降解率。根据污染物成分不同，采用不同的提取和测定方法，土壤中总石油烃(TPH)用正己烷-二氯甲烷-氯仿进行萃取，萃取的样品用旋转蒸发仪和氮气将溶剂挥发掉，采用重量法测定降解率；土壤中多环芳烃采用二氯甲烷萃取，高效液相色谱(HPLC)法进行测定。土壤中的苯、甲苯、二甲苯污染物，采用丙酮-甲醇萃取，气象色谱(GC-FID)法测定。
本发明的有益效果如下：
1.本发明通过接种携带特定石油烃降解基因的广宿主自转移质粒对石油污染土壤进行修复，有别于传统生物修复技术中接种降解菌的操作。接种后通过接合转移，广宿主降解质粒转至污染土壤土著菌群，使得降解基因发生水平转移，在具有生长竞争优势的土著细菌中表达并发挥降解功能，从而避开了传统生物修复技术中接种菌株难以长期存活的“瓶颈”问题，达到持久修复石油烃污染土壤的目的。
2.本发明提供的几种广宿主石油烃降解质粒，实验室生物降解实验结果表明，对苯、甲苯、二甲苯、菲、荧蒽、柴油等石油烃污染的长期降解效果十分明显。
3.本发明中所采用的广宿主降解质粒的宿主菌，可选用α-,β-,γ-Proteobacteria任一亚纲菌株。例如α-Proteobacteria的根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)，β-Proteobacteria的钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)，γ-Proteobacteria的大肠杆菌(Escherichia coli)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)等。这些菌株的生理生化特性和遗传特性研究的比较透彻，属于土壤中常见菌群且为非致病菌，利用此类菌株作为携带石油烃降解质粒的宿主菌修复石油污染土壤不会对环境造成二次污染，也不会对人类健康造成潜在危害。此类菌株易于培养，易大规模推广使用。
具体实施方式
实施例1
1)宿主菌活化和扩大培养：
从-70℃冰箱中取出保存于甘油管的携带广宿主自转移质粒的宿主菌接种到含相应双选择标记(宿主菌的选择标记和质粒的选择标记)的LB固体培养基上划线，置于30℃过夜培养。用灭菌接种针将上述培养好的菌落接种于5ml不含抗生素的LB液体培养基中，30℃摇床过夜培养。将上述培养好的菌液按5％体积接种量接入100ml LB液体培养基进行扩大培养。培养至对数生长期，发酵结束后菌体数量达1.0×109。
其中，携带广宿主自转移质粒的宿主菌为所述的各广宿主自转移降解质粒按照常规方法分别转移至上述变形菌α-,β-,γ-Proteobacteria不同亚纲菌株中，
2)菌剂制备和接种：
将上述发酵液离心收集菌体，采用无菌水洗涤菌体3次，并调整菌液浓度至1.0×108CFU/mL。称取500g石油污染土壤样品置于1000ml玻璃缸中，按105-106CFU/g干土的接菌量接种上述调整浓度后的菌液，同时每千克干土中添加125ml的营养液，与石油烃污染土壤充分混匀，调整含水量为15％-20％。用保鲜膜封口，定期补充无菌水以保证培养过程中的含水量。置于30℃恒温培养箱中，根据石油烃污染物的种类不同，培养时间约为2-18周。对照添加相同量污染物和营养物质，但不接种广宿主自转移降解质粒。
营养液成分为：(NH4)2SO4 0.5g/L，NaNO3 0.5g/L，MgSO4 7H2O 0.2g/L，KH2PO41.0g/L，NaH2PO4H2O l.0g/L。
3)测定接合效率：
广宿主自转移质粒在土壤中是否发生接合转移及其接合转移效率，以接合子和宿主菌的比率作为指示指标，计算公式：E(接合效率)＝n(接合子数目)/N(宿主菌数目)。在培养48h，采集5g土壤置于无菌三角瓶中，添加50mL无菌水，充分振荡混匀，取1mL土壤悬液添加到9mL无菌水中进行稀释，以此类推，进行梯度稀释。取0.2mL合适的梯度稀释液涂布含相应选择标记的固体平板，置于30℃倒置培养，培养时间为48小时。培养完毕根据广宿主质粒所携带的遗传选择标记(例如抗生素抗性、营养缺陷培养基或荧光)计数宿主菌和接合子总的数量；根据宿主菌所携带的遗传选择标记或营养缺陷型，计数宿主菌。
4)土壤石油烃污染物降解率的测定：为了解广宿主降解质粒的生物修复效果，对残留的石油烃污染物进行测定，根据土壤未处理前石油烃的含量以及实验组和对照组残留的石油烃含量计算降解效率。代表性石油烃污染物包括柴油、苯、甲苯、二甲苯、菲、荧蒽。
根据污染物成分不同，采用不同的提取和测定方法。总石油烃的提取方法为：称取10g干重的风干过筛土样或底泥,置于50mL玻璃离心管中,加入20mL正己烷,超声提取20min,4000rpm离心5min,收集上清,重复上述步骤,合并上清,最后再加入20mL氯仿,超声提取20min,4000rpm离心5min,收集上清,重复上述步骤,将3次上清合并,用无水硫酸钠除水,接收滤液于已知重量的恒重烧杯中,室温放置于通风橱内氮气吹干至恒重。总石油烃(TPH)用重量法进行测定。
多环芳烃(菲、荧蒽)的提取方法为：称取10g干重的风干过筛土样或底泥,置于50mL玻璃离心管中,加入20mL二氯甲烷,超声提取20min,4000rpm离心5min,收集上清,重复上述步骤,合并上清,用无水硫酸钠除水,接收滤液于已知重量的恒重烧杯中,室温放置于通风橱内氮气吹干至恒重。HPLC条件：色谱柱：Inertsil ODS-P，250mm(id)×4.6mm，5-μm；柱温：40℃；流动相：甲醇/水梯度淋洗，甲醇:水(70:30)5min，100％甲醇50min；流速：0.8mlmin-1；进样量：20μL；紫外检测器，检测波长：254nm。
苯系物(苯、甲苯、二甲苯)提取方法为：称取10g干重的风干过筛土样或底泥,置于50mL玻璃离心管中,加入10mL甲醇：丙酮(1:1),超声提取10min,氮气吹扫浓缩。气相色谱条件：进样口200℃，检测器220℃，柱温50℃保持3min以10℃/min的速度升温至150℃，保持5min。载气为氮气，载气流速:1mL/min分流比1：25。
实施例2
采集中国科学院沈阳生态站未被石油烃污染的表层土壤，0-20cm表层土壤，过100目筛，测定土壤的含水量(便于最后续实验中调整土壤的湿度)。菲用丙酮溶解按5mg/g干土的比例掺入土壤中，翻拌均匀并使丙酮挥发干净。培养实验在1000ml广口瓶中实施，每个广口瓶中装500g菲污染土壤样品。
广宿主自转移石油烃降解质粒pW22-3G，大小为77kb；其遗传标记为绿色荧光蛋白(gfp)，降解基因为芳香环羟化双加氧酶基因(phdA)、苯双加氧酶基因(ben)、二甲苯单加氧酶基因(touA)、水杨酸羟化酶基因(nahG)、邻苯二酚2,3-双加氧酶基因)，宿主菌为Pseudomonas putidaUWC1(利福平抗性，属γ-Proteobacteria)。利用现有技术常规方式将质粒转移至宿主菌种，待用。
将上述携带广宿主自转移质粒的宿主菌进行菌体活化和菌剂制备，土壤中接菌量为105～106CFU/g干土(加入约1ml菌液)，同时添加63ml营养液。充分混匀，调整含水量为15％-20％。在培养过程中定期补水保持土壤含水量。
培养48小时后，取5g土样，而后按照上述实施例1步骤3)测定接合效率的记载制备土壤悬液并进行梯度稀释。采用荧光显微镜计算宿主菌和接合子总数，采用利福平抗性培养基计数宿主菌数目，并计算接合转移效率，结果表明48小时土壤中广宿主自转移质粒的接合效率为0.38×10-2；
再取不同培养时间土壤样品。按照上述实施例1步骤4)土壤石油烃污染物降解率的测定中记载的采用HPLC方法测定残留的菲的量。结果表明，培养2周降解率为76.5％；培养6周时降解率为84.3％；培养12周时降解率为94.8％。
实施例3
采集沈抚灌区原位石油污染农田表层(0-20cm)土壤，过2mm筛，测定总石油烃污染浓度为3482mg/kg干土，属于重度污染。取500g污染土壤样品置于1000ml玻璃缸中。
接种广宿主自转移石油烃降解质粒pS3-2G，大小为106kb；其遗传标记为抗卡那霉素(KmR)，降解基因为芳香环羟化双加氧酶基因(phdA)、苯双加氧酶基因(ben)、二甲苯单加氧酶基因(touA)、水杨酸羟化酶基因(nahG)、邻苯二酚2,3-双加氧酶基因)；宿主菌为Agrobacterium tumefaciens C58，属α-Proteobacteria)。利用现有技术常规方式将质粒转移至宿主菌种，待用。
将上述携带广宿主自转移质粒的宿主菌进行菌体活化和菌剂制备，土壤中接菌量为105-106CFU/g干土(加入约1ml菌液)，同时添加63ml营养液。充分混匀，调整含水量为15％-20％。在培养过程中定期补水保持土壤含水量。
培养48小时后，取5g土样，而后按照上述实施例1步骤3)测定接合效率的记载制备土壤悬液并进行梯度稀释。采用卡那霉素抗性平板计数宿主菌和接合子总数，采用利福平抗性培养基计数宿主菌数目，并计算结合转移效率，结果表明48小时土壤中广宿主自转移质粒的接合效率为0.24×10-2；
再取不同培养时间土壤样品。按照上述实施例1步骤4)土壤石油烃污染物降解率的测定中记载的采用重量法测定残留总石油烃含量。结果表明，培养2周降解率为68.3％；培养4周时降解率为71.6％；培养8周时降解率为85.7％，培养16周时降解率为93.2％。
Claims (4)
1.一种利用广宿主自转移降解质粒对石油污染土壤进行生物修复的方法，其特征在于：将携带含有石油烃降解基因和遗传选择标记的广宿主自转移降解质粒的宿主菌接种到待处理的污染土壤中，并添加营养液，通过微生物间的接合转移作用，使广宿主自转移质粒所携带的降解基因发挥高效降解作用，进而达到持久修复石油烃污染土壤的目的：
所述遗传选择标记为：抗生素抗性基因、β-半乳糖苷酶基因(lacZ)或绿色荧光蛋白基因(gfp)；
所述石油烃降解基因为：编码芳香环羟化双加氧酶基因(phdA)、甲苯单加氧酶基因(touA)、编码苯双加氧酶基因(ben)、编码甲苯双加氧酶基因(tod)中一种或几种；
所述宿主菌为染色体带有利福霉素抗性(RifR)选择标记的变形菌(Proteobacteria)α-,β-或γ-任一亚纲中的菌株。
2.按权利要求1所述的利用广宿主自转移降解质粒对石油污染土壤进行生物修复的方法，其特征在于：
所述营养液成分为：(NH4)2SO4 0.5g/L，NaNO3 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，KH2PO41.0g/L和NaH2PO4·H2O l.0g/L；营养液的添加量为100-150ml/kg干土。
3.按权利要求1所述的利用广宿主自转移降解质粒对石油污染土壤进行生物修复的方法，其特征在于：所述宿主菌为具有利福平抗性的根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)C58、具有利福平抗性的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)UWC1或具有利福平抗性的钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)JMP228。
4.按权利要求1所述的利用广宿主自转移降解质粒对石油污染土壤进行生物修复的方法，其特征在于：
1)宿主菌活化和扩大培养：将保存于甘油管的携带广宿主自转移质粒的宿主菌接种到含宿主菌选择标记和质粒选择标记的LB固体培养基上进行菌株活化，活化后再接种于LB液体培养中，振荡培养至菌液的菌体密度达5.0×106CFU/mL；将上述培养好的菌液按5％体积接种量接种到LB液体培养基进行扩大培养，培养至1.0×109CFU/mL；
2)菌剂制备和接种：将上述培养至1.0×109CFU/mL的菌液离心，采用无菌水洗涤菌体，并调整菌液浓度至1.0×108CFU/mL，而后将菌液按105-106CFU/g干土的接菌量接种到石油烃污染的土壤中，再添加营养液，调整含水量为15％-20％，培养时间为2-18周；进而达到持久修复石油烃污染土壤的目的；营养液的添加量为100-150ml/kg干土。
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|---|---|---|---|
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Granted publication date: 20170419 Termination date: 20181227 |
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