CN104730027A - 应用近红外光谱技术测定小麦条锈病菌夏孢子萌发率的方法 - Google Patents
应用近红外光谱技术测定小麦条锈病菌夏孢子萌发率的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及真菌孢子萌发率的检测，具体提供了一种应用近红外光谱技术测定小麦条锈病菌夏孢子萌发率的方法，基于近红外光谱技术，根据孢子萌发试验方法获得的小麦条锈菌夏孢子的萌发率及其相应样品的近红外光谱数据，建立孢子萌发率的判别模型，实现了小麦条锈病菌夏孢子萌发率的自动无损检测。
Description
技术领域
本发明涉及真菌孢子萌发率的检测，具体地说，涉及一种应用近红外光谱技术测定小麦条锈病菌夏孢子萌发率的方法。
背景技术
小麦条锈病是世界范围内的一种重要病害，该病在我国发生范围广，多次流行成灾，给我国小麦生产造成严重影响。小麦条锈病依靠夏孢子通过气流进行远程传播，在我国形成了华北－西北－长江中下游流行区系、云南流行区系和新疆流行区系共三大流行区系。小麦条锈病菌是一种专性寄生菌，其在寄主内寄生，不断进行扩展，产生的夏孢子堆破裂后散出夏孢子。目前，尚不能在人工培养基上进行条锈病菌的分离、纯化、培养和保存。用于开展研究工作的小麦条锈病菌，一般地直接收集于发病的小麦叶片，或来自于从发病叶片收集后保存起来的夏孢子，有时也来源于通过孢子捕捉器收集的空气中的夏孢子。在自然条件下，由于受到各种环境因素的影响，夏孢子存活时间较短；夏孢子一般是在低温条件下保存。夏孢子只有萌发才有可能进一步侵染为害，具有活力的夏孢子对于病原菌的有效传播非常重要，测定夏孢子的萌发率有利于更加准确地进行病害预测预报。目前，通常通过孢子萌发试验方法测定孢子萌发率(井金学，商鸿生，李振歧.紫外线照射对小麦条锈菌生物学效应的研究.植物病理学报，1993，23(4):299-304.)(张永红，黄丽丽，康振生.小麦条锈菌CY32夏孢子萌发研究.菌物学报，2006，25(4):656-659.)。另有通过检测小麦条锈菌夏孢子RNA完整性的方法定性评估其存活力的报道(乔佳兴，马丽杰，孔新宇，王军娟，胡小平.小麦条锈菌夏孢子保存时间及存活力评价.麦类作物学报，2013，33(5):1043-1047.)，认为RNA完整性好的菌株，其存活力高，反之，RNA完整性差的菌株，其存活力低。
然而，利用孢子萌发试验方法测定孢子萌发率，费时费力，易受环境或人为因素的影响，并且进行孢子萌发的计量时容易产生误差，准确性低。通过检测小麦条锈菌夏孢子RNA完整性的方法评估孢子存活力，只是通过RNA的完整性间接测定夏孢子存活力的大小，不能定量评估夏孢子的存活力。因此，需要探求一种无损、简便、快速、准确的病原菌孢子萌发率测定方法。
近红外光谱技术(near infrared reflectance spectroscopy，NIRS)作为一种快速、无损、低成本、无污染的分析技术，已被广泛应用于农业、食品、石油、化工、医药等行业。基于近红外光谱技术可进行植物病害和植物病原菌的识别，目前，尚无基于近红外光谱技术进行病原菌孢子萌发率测定的研究报道。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种应用近红外光谱技术测定小麦条锈病菌夏孢子萌发率的方法。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
一种应用近红外光谱技术测定小麦条锈病菌夏孢子萌发率的方法，其特征在于，其具体包括如下步骤：
1)收集小麦条锈病菌样品；
2)采集小麦条锈病菌样品的近红外光谱；
3)利用孢子萌发试验方法获得样品的萌发率；
4)近红外光谱数据预处理：选择矢量归一化方法对光谱进行预处理；
5)夏孢子萌发率判别模型的建立：利用支持向量回归机(supportvector regression，SVR)建立夏孢子萌发率判别模型，确定夏孢子萌发率与近红外光谱数据之间的定量关系；
6)待测条锈病菌夏孢子样品萌发率的测定：采集待测条锈病菌夏孢子样品的近红外光谱数据，经过预处理之后输入支持向量回归机判别模型，即可计算获得待测样品的夏孢子萌发率。
进一步地，所述步骤3)将采集完近红外光谱的小麦条锈病菌夏孢子样品分别与0.1％水琼脂混匀，并置于培养箱内，黑暗条件下培育萌发，然后在显微视野下，每个样品镜检200-500个夏孢子，以芽管伸长大于夏孢子直径的二分之一以上作为孢子萌发标准，计算样品夏孢子的萌发率。
作为优选，所述步骤3)将采集完近红外光谱的小麦条锈病菌夏孢子样品分别与0.1％水琼脂混匀，并置于9℃培养箱内，黑暗条件下培育萌发24h，然后在20倍显微视野下，每个样品镜检300个夏孢子，以芽管伸长大于夏孢子直径的二分之一以上作为孢子萌发标准，计算样品夏孢子的萌发率。
进一步地，所述步骤1)将小麦种子浸水催芽24h，选择发芽良好且长势一致的种子人工均匀点播在直径为10cm的小盆中，每盆点播20粒左右，然后置于环境参数为12h光照、光照强度10000lux、温度11～13℃、相对湿度60％～70％的人工气候室内培育；在小麦苗一叶一心期第一叶完全展开时，进行小麦条锈病的人工喷雾接种；从保存病菌的液氮罐中取出所需条锈病菌生理小种，40℃水浴5min，然后4℃黑暗水化12h，将适量菌种与0.2％的吐温-80配成孢子悬浮液；用手指蘸清水脱除叶片表层蜡质，然后进行人工喷雾接种，接种后置于11～13℃的黑暗条件下保湿24h；最后置于环境参数为12h光照、光照强度10000lux、温度11～13℃、相对湿度60％～70％的人工气候室内培育；待小麦苗发病以后收集条锈病菌夏孢子，并置于4℃条件下的干燥器内保存备用。
进一步地，所述步骤2)在采集光谱之前，将保存不同时间的夏孢子随机混匀，以获得萌发率介于0％～100％之间且其尽可能均匀分布的夏孢子样品，样品数量不小于30个；
光谱采集时，将每个小麦条锈病菌夏孢子样品均分为不小于3份，放入测量杯内，利用积分球漫反射方法采集小麦条锈病菌的近红外光谱信息，光谱范围为4000～12000cm-1，光谱分辨率不低于16cm-1，扫描次数不少于16次，将同一样品各份的光谱平均后作为该样品的光谱。
进一步地，所述步骤5)谱区范围选择8000～11000cm-1，利用支持向量回归机建立夏孢子萌发率判别模型。
本发明还提供了一种小麦条锈病菌夏孢子萌发率判别模型，所述模型的建立方法为：
S1：收集小麦条锈病菌样品；
S2：采集小麦条锈病菌样品的近红外光谱；
S3：利用孢子萌发试验方法获得样品的萌发率；
S4：近红外光谱数据预处理：选择矢量归一化方法对光谱进行预处理；
S5：夏孢子萌发率判别模型的建立：利用支持向量回归机建立夏孢子萌发率判别模型，确定夏孢子萌发率与近红外光谱数据之间的定量关系。
进一步地，所述模型的建立方法为：
S1：收集小麦条锈病菌样品：
在小麦苗一叶一心期第一叶完全展开时，进行小麦条锈病的人工喷雾接种；从保存病菌的液氮罐中取出所需条锈病菌生理小种，40℃水浴5min，然后4℃黑暗水化12h，将适量菌种与0.2％的吐温-80配成孢子悬浮液；用手指蘸清水脱除叶片表层蜡质，然后进行人工喷雾接种，接种后置于11～13℃的黑暗条件下保湿24h；最后置于环境参数为12h光照、光照强度10000lux、温度11～13℃、相对湿度60％～70％的人工气候室内培育；待小麦苗发病以后收集条锈病菌夏孢子，并置于4℃条件下的干燥器内保存备用；
S2：采集小麦条锈病菌样品的近红外光谱：
在采集光谱之前，将保存不同时间的夏孢子随机混匀，以获得萌发率介于0％～100％之间且其尽可能均匀分布的夏孢子样品，样品数量不小于30个；
光谱采集时，将每个小麦条锈病菌夏孢子样品均分为不小于3份，放入测量杯内，利用积分球漫反射方法采集小麦条锈病菌的近红外光谱信息，光谱范围为4000～12000cm-1，光谱分辨率不低于16cm-1，扫描次数不少于16次，将同一样品各份的光谱平均后作为该样品的光谱；
S3：利用孢子萌发试验方法获得样品的萌发率：
将采集完近红外光谱的小麦条锈病菌夏孢子样品分别与0.1％水琼脂混匀，并置于9℃培养箱内，黑暗条件下培育萌发24h，然后在20倍显微视野下，每个样品镜检300个夏孢子，以芽管伸长大于夏孢子直径的二分之一以上作为孢子萌发标准，计算样品夏孢子的萌发率；
S4：近红外光谱数据预处理：选择矢量归一化方法对光谱进行预处理；
S5：夏孢子萌发率判别模型的建立：
谱区范围选择8000～11000cm-1，利用支持向量回归机建立夏孢子萌发率判别模型，确定夏孢子萌发率与近红外光谱数据之间的定量关系。
本发明还提供了所述模型在测定小麦条锈病菌夏孢子萌发率中的应用。
具体地，所述应用为采集待测条锈病菌夏孢子样品的近红外光谱数据，经过预处理之后输入前述模型中，计算获得待测样品的夏孢子萌发率。
本发明的有益效果在于：
本发明基于近红外光谱技术，根据孢子萌发试验方法获得的小麦条锈菌夏孢子的萌发率及其相应样品的近红外光谱数据，建立孢子萌发率的判别模型，实现了小麦条锈病菌夏孢子萌发率的自动无损检测。
本发明利用建立的判别模型测定病原菌孢子萌发率，可用于小麦条锈病菌夏孢子萌发率的快速无损测定，也可应用本发明建立其他病原菌孢子萌发率的快速无损判别模型，提供了一种快速、无损、低成本、无污染、准确性高的分析技术，可以节省大量进行病原菌孢子萌发试验的时间，并实现了病原菌孢子萌发率的定量快速测定，并且可在病原菌孢子量有限的情况，节省病原菌孢子，保障其他试验的进行。
附图说明
图1为本发明实施例1中采集获得的64条近红外光谱曲线。
图2为本发明实施例1中所建模型的建模集(a)和测试集(b)的真实值与预测值关系图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
1、收集小麦条锈病菌样品：将小麦品种铭贤169的种子浸水催芽24h，选择发芽良好且长势一致的种子人工均匀点播在直径为10cm的小盆中，每盆点播20粒左右，然后置于环境参数为12h光照、光照强度10000lux、温度11～13℃、相对湿度60％～70％的人工气候室内培育。在小麦苗一叶一心期第一叶完全展开时，进行小麦条锈病的人工喷雾接种。从保存病菌的液氮罐中取出所需条锈病菌生理小种，40℃水浴5min，然后4℃黑暗水化12h，将适量菌种与0.2％的吐温-80配成孢子悬浮液。用手指蘸清水脱除叶片表层蜡质，然后进行人工喷雾接种，接种后置于11～13℃的黑暗条件下保湿24h。最后置于具有上述环境参数的人工气候室内培育。待小麦苗发病以后收集条锈病菌夏孢子，并置于4℃条件下的干燥器内保存备用。需分不同批次进行繁菌、收菌，以保证保存时间的差异而造成夏孢子萌发率的不同。待存菌量足够研究所需时进行病原菌的近红外光谱曲线的采集。
2、近红外光谱数据采集：在采集光谱之前，将保存不同时间的夏孢子随机混匀，以获得萌发率介于0％～100％之间且其尽可能均匀分布的夏孢子样品。研究中共获得64个不同萌发率的小麦条锈菌夏孢子样品，每个样品160mg。采集小麦条锈病菌近红外光谱曲线所用的仪器为德国Bruker公司生产的MPA傅立叶近红外光谱仪。光谱采集时，将每个小麦条锈病菌夏孢子样品平均分为4份，每份40mg，首先，将其中一份样品放入直径为4mm的测量杯内，尽量保持其松紧程度一致，以减小因其松紧程度不同而造成的试验误差。利用积分球漫反射方法采集小麦条锈病菌的近红外光谱信息，光谱范围为4000～12000cm-1，光谱分辨率为8cm-1，扫描次数为32次。然后，按同样方法采集其余3份样品光谱，如此，每个样品共采集4条光谱，对4条光谱求平均作为该样品的光谱，共获得64条近红外光谱，如图1所示。
3、样品萌发率数据的获得：将采集光谱后的各个小麦条锈病菌夏孢子样品分别与0.1％水琼脂混匀，并置于9℃培养箱内，黑暗条件下培育萌发24h，然后在20倍显微视野下，每个样品镜检300个夏孢子，以芽管伸长大于夏孢子直径的二分之一以上作为孢子萌发标准，计算各个样品夏孢子的萌发率。获得各个样品的萌发率之后，将采集的光谱曲线与相应样品的孢子萌发率结合进行相关的数据分析。
4、近红外光谱数据的预处理：为选择合适的近红外光谱预处理方法，采用bd2小波1层分解去噪、bd2小波2层分解去噪、bd2小波3层分解去噪、归一化(normalization)、附加散射校正(multiplicationscatter correction，MSC)、标准正态变量变换(standard normalizedvariate,SNV)、矢量归一化(vector normalization,VN)、一阶卷积求导(Savitzky-Golay first derivative)和二阶卷积求导(Savitzky-Golaysecond derivative)共计9种方法对光谱进行预处理。其中，利用Savitzky-Golay方法计算一阶导和二阶导时，窗口大小选择7，多项式次数选择3。以上计算均在MATLAB7.8.0(R2009a)中实现。使用MATLAB自带的小波工具箱进行小波去噪处理，小波去噪方法选择软阈值方法(soft thresholding)，阈值的确定选择启发式阈值选择法(heursure)。函数调用形式及参数如下：
wt＝wden(x,'heursure','s','one',N,'db2')
其中，wt为小波去噪后的光谱；x为原始光谱；N为分解层数。
5、夏孢子萌发率判别模型的建立：所有样品通过萌发率梯度排序后分别按照1:1、2:1、3:1、4:1和5:1的比例划分为建模集和测试集。为选择适合建模的谱区，将4000～12000cm-1波段划分为36种谱区，分别是：4000～5000、4000～6000、4000～7000、4000～8000、4000～9000、4000～10000、4000～11000、4000～12000、5000～6000、5000～7000、5000～8000、5000～9000、5000～10000、5000～11000、5000～12000、6000～7000、6000～8000、6000～9000、6000～10000、6000～11000、6000～12000、7000～8000、7000～9000、7000～10000、7000～11000、7000～12000、8000～9000、8000～10000、8000～11000、8000～12000、9000～10000、9000～11000、9000～12000、10000～11000、10000～12000和11000～12000cm-1。应用不同的预处理方法、建模比(建模集:测试集)及光谱范围建立支持向量回归机(SVR)模型，选择判别效果较好的模型作为检测小麦条锈病菌夏孢子萌发率的判别模型。选择径向基函数(radial basis function，RBF)作为核函数建模，使用网格搜索算法(grid search algorithm)搜索最优惩罚参数C和核函数参数g，搜索范围均为2-8～28，搜索步距均为0.8，遍历网格内所有点计算模型均方误差(mean squared error,MSE)，选择均方误差最小时的搜索结果作为模型参数。调用决定系数(R2)和均方误差评价模型的预测水平和可重复性。将不同预处理下较好的模型结果列于表1。表1中所列出的模型判别效果均较好，在这些模型中，相对而言，预处理方法选择矢量归一化，建模比为5:1，谱区范围选择8000～11000cm-1时所建模型建模集决定系数相对较高，均方误差相对较小，测试集决定系数最大，均方误差最小，且所用的谱区范围最小，因此认为该模型预测效果最好。图2表明，该模型可以很好地预测条锈病菌样品的萌发率。因此，选择该模型作为条锈病菌夏孢子萌发率的判别模型。
表1不同预处理方法下的最佳模型结果
图2所建模型的建模集(a)和测试集(b)的真实值与预测值关系图
6、待测条锈病菌夏孢子样品萌发率的测定；采集待测条锈病菌夏孢子样品的近红外光谱数据，经过预处理之后输入判别模型，即可计算获得夏孢子的萌发率。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种应用近红外光谱技术测定小麦条锈病菌夏孢子萌发率的方法，其特征在于，其具体包括如下步骤：
1)收集小麦条锈病菌样品；
2)采集小麦条锈病菌样品的近红外光谱；
3)利用孢子萌发试验方法获得样品的萌发率；
4)近红外光谱数据预处理：选择矢量归一化方法对光谱进行预处理；
5)夏孢子萌发率判别模型的建立：利用支持向量回归机建立夏孢子萌发率判别模型，确定夏孢子萌发率与近红外光谱数据之间的定量关系；
6)待测条锈病菌夏孢子样品萌发率的测定：采集待测条锈病菌夏孢子样品的近红外光谱数据，经过预处理之后输入支持向量回归机判别模型，即可计算获得待测样品的夏孢子萌发率。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)将采集完近红外光谱的小麦条锈病菌夏孢子样品分别与0.1％水琼脂混匀，并置于培养箱内，黑暗条件下培育萌发，然后在显微视野下，每个样品镜检200-500个夏孢子，以芽管伸长大于夏孢子直径的二分之一以上作为孢子萌发标准，计算样品夏孢子的萌发率。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤3)将采集完近红外光谱的小麦条锈病菌夏孢子样品分别与0.1％水琼脂混匀，并置于9℃培养箱内，黑暗条件下培育萌发24h，然后在20倍显微视野下，每个样品镜检300个夏孢子，以芽管伸长大于夏孢子直径的二分之一以上作为孢子萌发标准，计算样品夏孢子的萌发率。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤1)在小麦苗一叶一心期第一叶完全展开时，进行小麦条锈病的人工喷雾接种；接种后置于11～13℃的黑暗条件下保湿24h；最后置于环境参数为12h光照、光照强度10000lux、温度11～13℃、相对湿度60％～70％的人工气候室内培育；待小麦苗发病以后收集条锈病菌夏孢子，并置于4℃条件下的干燥器内保存备用。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤2)在采集光谱之前，将保存不同时间的夏孢子随机混匀，以获得萌发率介于0％～100％之间且尽可能均匀分布的夏孢子样品，样品数量不小于30个；
光谱采集时，将每个小麦条锈病菌夏孢子样品均分为不小于3份，放入测量杯内，利用积分球漫反射方法采集小麦条锈病菌的近红外光谱信息，光谱范围为4000～12000cm-1，光谱分辨率不低于16cm-1，扫描次数不少于16次，将同一样品各份的光谱平均后作为该样品的光谱。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤5)谱区范围选择8000～11000cm-1，利用支持向量回归机建立夏孢子萌发率判别模型。
7.小麦条锈病菌夏孢子萌发率判别模型，其特征在于，所述模型的建立方法为：
S1：收集小麦条锈病菌样品；
S2：采集小麦条锈病菌样品的近红外光谱；
S3：利用孢子萌发试验方法获得样品的萌发率；
S4：近红外光谱数据预处理：选择矢量归一化方法对光谱进行预处理；
S5：夏孢子萌发率判别模型的建立：利用支持向量回归机建立夏孢子萌发率判别模型，确定夏孢子萌发率与近红外光谱数据之间的定量关系。
8.根据权利要求7所述的模型，其特征在于，所述模型的建立方法为：
S1：收集小麦条锈病菌样品：
在小麦苗一叶一心期第一叶完全展开时，进行小麦条锈病的人工喷雾接种；从液氮罐中取出所需条锈病菌生理小种，40℃水浴5min，然后4℃黑暗水化12h，将适量菌种与0.2％的吐温-80配成孢子悬浮液；用手指蘸清水脱除叶片表层蜡质，然后进行人工喷雾接种，接种后置于11～13℃的黑暗条件下保湿24h；最后置于环境参数为12h光照、光照强度10000lux、温度11～13℃、相对湿度60％～70％的人工气候室内培育；待小麦苗发病以后收集条锈病菌夏孢子，并置于4℃条件下的干燥器内保存备用；
S2：采集小麦条锈病菌样品的近红外光谱：
在采集光谱之前，将保存不同时间的夏孢子随机混匀，以获得萌发率介于0％～100％之间且其尽可能均匀分布的夏孢子样品，样品数量不小于30个；
光谱采集时，将每个小麦条锈病菌夏孢子样品均分为不小于3份，放入测量杯内，利用积分球漫反射方法采集小麦条锈病菌的近红外光谱信息，光谱范围为4000～12000cm-1，光谱分辨率不低于16cm-1，扫描次数不少于16次，将同一样品各份的光谱平均后作为该样品的光谱；
S3：利用孢子萌发试验方法获得样品的萌发率：
将采集完近红外光谱的小麦条锈病菌夏孢子样品分别与0.1％水琼脂混匀，并置于9℃培养箱内，黑暗条件下培育萌发24h，然后在20倍显微视野下，每个样品镜检300个夏孢子，以芽管伸长大于夏孢子直径的二分之一以上作为孢子萌发标准，计算样品夏孢子的萌发率；
S4：近红外光谱数据预处理：选择矢量归一化方法对光谱进行预处理；
S5：夏孢子萌发率判别模型的建立：
谱区范围选择8000～11000cm-1，利用支持向量回归机建立夏孢子萌发率判别模型，确定夏孢子萌发率与近红外光谱数据之间的定量关系。
9.权利要求7或8所述的模型在测定小麦条锈病菌夏孢子萌发率中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，采集待测条锈病菌夏孢子样品的近红外光谱数据，经过预处理之后输入权利要求7或8所述的模型，计算获得待测样品的夏孢子萌发率。
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