CN104713907A - 离体脑片神经网络振荡记录系统及记录的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种离体脑片神经网络振荡记录系统，包括脑片记录槽和储存槽、气体供给装置、灌流给药装置、电极固定及操纵装置、温度控制装置、神经网络信号记录装置；所述脑片记录槽为长方体形状的容器，容器内设置有凹槽，凹槽两侧开有孔，凹槽后侧的弧形部分有混合氧气饱和的人工脑脊液输入口，所述混合氧气输入口通过管路连接所述气体供给装置，人工脑脊液循环输入口连接所述灌流给药装置，所述人工脑脊液循环的管路上设置有蠕动泵。本发明提出的离体脑片神经网路振荡记录双重给氧系统，对传统的记录系统进行了双重给氧，脑片储存方式、温控及引流装置等改进，使脑片长时间储存且保持其生物活性，可诱导出稳定的长时程的神经网络振荡活动。

Description

离体脑片神经网络振荡记录系统及记录的方法

技术领域

本发明属于人体或动物组织局部保存领域，具体涉及一种离体脑片的测试装置及其应用的方法。

背景技术

Gamma神经振荡是一种30-80Hz同步信号，存在于人和动物大脑的很多区域。研究神经振荡可以了解动物和人类认知、学习、记忆、兴奋、唤醒的神经特征，是医学和心理学研究的热点。

目前，已知的离体的神经网络振荡技术包括脑片记录装置、记录槽、气体供给装置、灌流给药装置、照明及温度控制装置、电极固定及操纵装置、神经网络信号记录装置、屏蔽及接地装置及系统防震装置。脑片制备后，放入记录槽进行记录及其相关的操作，或存放于储存槽内，一般只能储存2-3小时。但是由于相关的神经网络记录系统及其装置设计往往很难长时间的保证离体脑片的生物活性，传统的神经网络记录系统、局限于诱导出2-3小时的神经网络振荡活动、且神经振荡的能谱比较低，很难满足很多的实验要求。

发明内容

为了克服传统的神经网络振荡记录系统中脑片活性低、诱导出的神经网络振荡时程短、能谱低的不足，本发明提供了一种改进型的离体脑片神经网络振荡记录系统，该记录系统对传统的记录系统进行了诸多改进与创新，可使脑片长时间储存且保持其生物活性，可诱导出稳定的长时程的神经网络振荡活动，能较好的满足实验的要求，一次实验动物和组织同时可切出很多脑片，其它脑片放于脑片储存槽内，由于本储存方法能使脑片保持12小时以上良好的状态，减少了相关实验动物和组织的需要量，并且能够完成以前由于脑片状态维持良好的时间短所无法完成的实验。

进一步地，本发明提供一种离体脑片神经网络振荡记录的方法。

实现本发明目的的技术方案为：

一种离体脑片神经网络振荡记录系统，包括脑片记录槽、脑片储存槽，气体供给装置、灌流给药装置、电极固定及操纵装置、温度控制装置、神经网络信号记录装置、解剖显微镜；

所述脑片记录槽为长方体形状的容器，容器壁上开有混合氧气进口；容器内设置有凹槽，所述凹槽的投影形状为两条相对短边为弧形、两条相对长边为直线的轴对称图形(俯视图为田径跑道形状)，凹槽前侧的弧形部分突出到长方体的外部；所述凹槽两侧开有孔；所述凹槽后侧的弧形部分开有人工脑脊液循环输入口，所述混合氧气输入口通过管路连接所述气体供给装置，所述人工脑脊液(ACSF)循环输入口通过管路连接所述灌流给药装置，所述人工脑脊液循环的管路上设置有蠕动泵；

所述脑片储存槽和脑片记录槽结构一样，脑片储存槽的人工脑脊液循环输入口通过管路连接所述灌流给药装置，人工脑脊液循环的管路通过所述的蠕动泵；

所述电极固定及操纵装置上固定二个玻璃微电极，玻璃微电极从所述脑片记录槽的顶盖上插入到凹槽内；所述玻璃微电极通过导线连接所述神经网络信号记录装置；所述解剖显微镜位于所述脑片记录槽的正上方。

所述温度控制装置包括用于加热的热电阻，所述热电阻设置在脑片记录槽的长方体腔体内和/或围绕在至少一部分的人工脑脊液循环的管路外。

所述温度控制装置的热电阻设置在脑片记录槽的长方体腔体内，脑片记录槽的长方体腔体内装有去离子三蒸水,通过加热记录槽内的水控制温度，人工脑脊液循环输入口所连接的管路(含饱合氧的ACSF管路)通过腔体内并在腔体内盘绕1-5圈，热电阻加热腔体内装有的去离子三蒸水，以控制管内液体温度。

所述的离体脑片神经网络振荡记录系统，还包括屏蔽及接地装置及系统防震装置；所述屏蔽及接地装置为长方体，将所述脑片记录槽、气体供给装置、灌流给药装置、照明及温度控制装置、电极固定及操纵装置、神经网络信号记录装置放置在该长方体内，该长方体通过导线接地。所述系统防震装置为气压防震台，所述玻璃微电极、操纵单元和解剖显微镜放置在气压防震台上。

进一步地，所述脑片记录槽侧壁设置两个镀氯化银的银丝，银丝的尖端插入到凹槽中，银丝的另外一端接地。在记录槽外的前壁上装有两根接地的银丝，银丝前端经过KCL溶液电镀处理，经处理过的银丝表面镀以氯化银，把电镀处理后的氯化银丝尖端紧贴记录槽前壁插入其前端凸出的引流槽中，可以有效地减少神经网路振荡记录记录过程中出现的噪音干扰。

优选地，所述人工脑脊液循环的管路上设置有四通，所述管路通过四通分别连接脑片储存槽和灌流给药装置，所述蠕动泵为四通道恒流蠕动泵。通过一个四通道恒流蠕动泵同时驱动记录槽与储存槽两套独立的闭合式氧饱合ACSF灌流系统。

所述的离体脑片神经网络振荡记录系统，还包括一个形状和脑片记录槽一样的脑片储存槽。储存槽设置是独立于记录槽之外的ACSF循环设置，其只用于脑片的储存，而不作神经网络振荡的记录。脑片储存槽内不设置加热的热电阻。

其中，所述人工脑脊液循环的管路上设置有四通，所述管路通过四通分别连接脑片记录槽、储存槽和灌流给药装置。

一种离体脑片神经网络振荡记录的方法，采用本发明提出的离体脑片神经网络振荡记录系统，包括步骤：

将离体脑片置于脑片记录槽的凹槽中，所述凹槽底部铺设LensCleaning Tissue(Whatman international Ltd,Maidstone,England.Made inEngland,镜头清洁纸)；控制所述人工脑脊液的温度为30-32℃，将人工脑脊液混合氧气循环先经过有温控装置去离子三蒸水中，从而保持温度为30-32℃，再通入所述凹槽，通过玻璃微电极传输离体脑片的神经网络信号，记录在神经网络信号记录装置中。

其中，所述混合氧气为体积比例的95％O₂+5％CO₂，混合氧气和人工脑脊液的体积比例为0.028～0.035:1。

其中，所述脑片记录槽和脑片储存槽的长方体腔体内装有去离子三蒸水。所述去离子三蒸水可采用Milli-Q水。去离子三蒸水中持续通入混合氧气，混合氧气和去离子三蒸水的体积比例为0.028～0.035:1。混合氧气通过腔体内的三蒸水，被水合湿化。

优选地，记录神经网络信号时，所述凹槽的通气孔上覆盖有载玻片。

在界面式浸浴浴槽内部装载的是去离子三蒸水，其下接入由浸浴浴槽后壁混合氧气输入口输入的混合氧气，混合氧气从去离子三蒸水扩散出来，通过界面浴槽上方的通气孔直接扩散至盛有脑片的界面式浸浴浴槽内；界面凹槽处铺满Lens Cleaning Tissue用于引流循环中的ACSF，在界面式浴槽上方使用载玻片将其界面处封盖，以便于氧气弥漫整个脑片记录槽的凹槽，直接供给脑片氧气，并补充脑脊液氧气的消耗，减轻了由于缺氧而对脑片造成的损伤。

本发明的有益效果：

1、本发明采用多通道混合气体供给设置，使脑片的制备、转移、储存、及记录都可得到充足的、一体化的氧气供应，最大限度的减轻由于缺氧而对脑片造成的损伤。

2、本发明在脑片储存槽、脑片记录槽均使用双通路的混合氧气供给装置，并使用Lens Cleaning Tissue对ACSF进行引流和衬垫，不但可以有效防止脑片由于引流不畅而导致的浸水死亡、而且还可以使脑片保证相当的湿度，与记录槽壁保持合适的距离，最大限度的模拟脑组织在体的内环境，以往用网格衬垫，易使脑片变形，脑片的部分组织贴紧记录槽壁，引流不好，液面不好控制，且网格与脑片接触部分脑组织压迫明显，摄氧易发生障碍。

3、本发明应用MINIPULS-3四通道蠕动泵，实现了脑片储存槽、记录槽中的ACSF的恒流动态循环，使脑片在储存系统和记录系统既相对独立，又有机的结合起来，体现了整体与局部的统一。

本发明提出的改进型的离体脑片神经网路振荡记录系统，对传统的记录系统进行了诸多改进，通过混合氧气和人工脑脊液循环通入，使脑片长时间储存且保持其生物活性，可诱导出稳定的长时程的神经网络振荡活动；通过连接与解剖显微镜的银丝，起到消除噪音干扰的作用；

在玻璃电极的操纵和固定平台下方，设置有气压防震台，以防在记录电极插入目的脑区后，由于外界的轻微振动而是其电极的位置发生偏移；此外，整个系统都进行了屏蔽和地线接入，使神经网路电生理信号得以不断地纯化，能更好的满足实验的要求。

附图说明

图1：本发明实施例1的离体脑片神经网络振荡记录系统结构简图；

图2：本发明实施例1的脑片记录槽顶盖的结构图。

图3：图2的分解图。

图4：脑片记录槽顶盖的侧视图。

图5为没有装入凹槽的脑片记录槽6立体图。

图6为没有装入凹槽的脑片记录槽的俯视图。

图7为实物照片。

图8为离体脑片神经网络振荡记录系统结构图。

图中，1为凹槽，2为通气孔，3为脑片记录槽顶盖，4为凹槽前侧的弧形部分，5为人工脑脊液循环输入口，6为ACSF出口管路，7为热电阻，8为四通道蠕动泵，9为脑片储存槽，10为脑片记录槽，11为供脑片储存槽的人工脑脊液管路，12为供脑片记录槽的人工脑脊液管路，13为混合氧气储存瓶，14为混合氧气管路。

具体实施方式

下面以优选的实施例对本发明技术方案进一步说明。

本领域技术人员应当知晓，以下实施例只用来说明本发明，而不用来限制本发明的范围。

实施例1

参见图1、图8，一种离体脑片神经网络振荡记录系统，包括脑片记录槽10、气体供给装置、灌流给药装置、电极固定及操纵装置、神经网络信号记录装置；

参见图2。图2为脑片记录槽顶盖的结构，所述脑片记录槽10为长方体形状的容器，容器壁上开有混合氧气进口；容器内设置有凹槽1，凹槽1的投影形状为两条相对短边为弧形、两条相对长边为直线的轴对称图形，凹槽前侧的弧形部分4突出到长方体的外部，连接ACSF出口管路6；凹槽两侧开有通气孔2；凹槽上有人工脑脊液循环输入口5。凹槽后侧的弧形部分底部开有混合氧气输入口7和人工脑脊液循环输入口，混合氧气输入口通过管路连接气体供给装置，人工脑脊液(ACSF)循环输入口通过管路连接所述灌流给药装置，ACSF循环的管路上设置有四通道蠕动泵8(MINIPULS-3)，管路采用塑料软管。供脑片储存槽的人工脑脊液管路11和供脑片记录槽的人工脑脊液管路12均通过四通道蠕动泵8。

具体尺寸见图2、图3、图4：脑片记录槽顶盖3边长10cm，为钢化玻璃制造，厚度10mm；凹槽长6cm，两边各开有六个通气孔2，通气孔2的直径为0.5cm；为了设置凹槽，顶盖上开有梯级槽，第一级深度0.3cm、第二级深度0.3cm，第二级槽宽度2.3cm即为凹槽的宽度。图3为图2的分解图，其中，凹槽深度为2cm，凹槽的弧形部分壁厚0.3cm。当脑片记录槽顶盖上放置载玻片时，载玻片不与通气孔接触，与通气孔(通气孔的气是从下面长方体腔体冒出的)所在的第一级间隔0.3cm。

图5为没有装入凹槽的脑片记录槽的立体图；图6为没有装入凹槽的脑片记录槽的俯视图(图5开有三个孔的壁为后壁，即，有凹槽前侧的弧形部分4的壁为前壁)。参见图3右下角的小图，脑片记录槽顶盖3通过0.7cm的螺栓固定在侧壁上。

电极固定及操纵装置(微电极操纵器成仪STW-3)上固定二个玻璃微电极，从所述脑片记录槽的顶盖3上插入并深入到凹槽内；所述玻璃微电极连接有操纵单元并通过导线、信号传出装置(micro3.0接口)、滤波器、放大器连接神经网络信号记录装置；解剖显微镜位于所述脑片记录槽的正上方。

所述的离体脑片神经网络振荡记录系统，还包括照明及温度控制装置、屏蔽及接地装置及系统防震装置；温度控制装置(TC324B温控装置)包括可加热的热电阻，热电阻套在人工脑脊液循环的管路外，以及有片状的热电阻7(超薄热电阻)置于脑片记录槽10的去离子三蒸水中，供脑片储存槽的人工脑脊液管路11在腔体内盘绕两圈，从而将经过的管路中的人工脑脊液混合氧气循环保持温度为30-32℃；所述屏蔽及接地装置为长方体，将所述脑片记录槽、气体供给装置、灌流给药装置、照明及温度控制装置、电极固定及操纵装置、神经网络信号记录装置放置在该长方体内，该长方体通过导线接地。所述系统防震装置为气压防震台，所述玻璃微电极、操纵单元和解剖显微镜放置在气压防震台上。

进一步地，所述脑片记录槽侧壁设置两个镀氯化银的银丝，银丝的尖端插入到凹槽中。银丝的另外一端连接在电极固定及操纵装置上，该操纵装置接地。在记录槽外的前壁上装有两根连接于解剖显微镜的银丝，银丝前端经过KCl溶液电镀处理，经处理过的银丝表面镀以氯化银，把电镀处理后的氯化银丝尖端紧贴记录槽前壁插入前端凸出的凹槽中，可以有效地减少神经网路振荡记录记录过程中出现的噪音干扰。

所述的离体脑片神经网络振荡记录系统，还包括一个形状和脑片记录槽一样的脑片储存槽9。储存槽设置是独立于记录槽之外的ACSF循环设置，其只用于脑片的储存，而不作神经网络振荡的记录。混合氧气储存瓶13通过混合氧气管路14为离体脑片神经网络振荡记录系统提供混合氧气。

实施例2

一种离体脑片神经网络振荡记录的方法，采用实施例1的离体脑片神经网络振荡记录系统，包括步骤：

将离体脑片置于脑片记录槽的凹槽中，所述凹槽底部铺设LensCleaning Tissue(镜头清洁纸)；控制所述人工脑脊液的温度为30-32℃，将人工脑脊液混合氧气循环通入所述凹槽，通过玻璃微电极传输离体脑片的神经网络信号，记录在神经网络信号记录装置中(实物照片图7)。离体脑片用LEICA VT1000S切片机制备。

其中，所述混合氧气为体积比的95％O₂+5％CO₂，混合氧气和人工脑脊液的体积比例为0.028～0.035:1。

其中，所述脑片记录槽的长方体腔体内装有去离子三蒸水。所述去离子三蒸水可采用Milli-Q水。混合氧气和去离子三蒸水的体积比例为0.028～0.035:1。

记录神经网络信号时，所述凹槽的通气孔上覆盖有载玻片。

在界面式浸浴浴槽内部装载的是去离子三蒸水，其下接入由浸浴浴槽后壁混合氧气入输入口输入的混合氧气，混合氧气通过界面浴槽上方的通气孔直接扩散至盛有脑片的界面式浸浴浴槽内；界面凹槽处铺满Lens Cleaning Tissue用于引流循环中的ACSF，在界面式浴槽上方使用载玻片将其界面处封盖，以便于氧气的弥漫。

通过本发明的方法，一方面混合氧气通过界面式浸浴浴槽内部的去离子三蒸水来供给氧气，另一方面人工脑脊液有混合氧气供给脑片等组织氧气，形成双灌流系统，保证氧气供应，使脑片等组织的存活时间从2-3小时，增加至12小时以上。图3灌流槽上面的6个直径0.5cm的孔可使混合氧气从灌流槽里面出来，进而补充脑片所耗的氧气，脑片半浸润在脑脊液里，从而使没浸润在脑脊液里的脑片也能得到氧气供应，凹槽前方设置一个橡胶垫(起到密封的作用)，上方有载玻片，载玻片与灌流槽上面的6个直径0.5cm的孔不接触，从而形成一个相对密封的空间，充满混合氧气。

以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型，因此所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims (9)

1.一种离体脑片神经网络振荡记录系统，其特征在于，包括脑片记录、脑片储存槽、气体供给装置、灌流给药装置、温度控制装置、电极固定及操纵装置、神经网络信号记录装置、解剖显微镜；

所述脑片记录槽为长方体形状的容器，容器壁上开有混合氧气进口；容器内设置有凹槽，所述凹槽的投影形状为两条相对短边为弧形、两条相对长边为直线的轴对称图形，凹槽前侧的弧形部分突出到长方体的外部；所述凹槽两侧开有孔；所述凹槽后侧的弧形部分开有人工脑脊液循环输入口，所述混合氧气输入口通过管路连接所述气体供给装置，所述人工脑脊液循环输入口通过管路连接所述灌流给药装置，所述人工脑脊液循环的管路上设置有蠕动泵；

所述脑片储存槽和脑片记录槽结构一样，脑片储存槽的人工脑脊液循环输入口通过管路连接所述灌流给药装置，人工脑脊液循环的管路通过所述的蠕动泵；

所述温度控制装置包括用于加热的热电阻，所述热电阻设置在脑片记录槽的长方体腔体内和/或围绕在至少一部分的人工脑脊液循环的管路外；

所述电极固定及操纵装置上固定二个玻璃微电极，玻璃微电极从所述脑片记录槽的顶盖上插入到凹槽内；所述玻璃微电极通过导线连接所述神经网络信号记录装置；所述解剖显微镜位于所述脑片记录槽的正上方。

2.根据权利要求1所述的离体脑片神经网络振荡记录系统，其特征在于，所述温度控制装置的热电阻设置在脑片记录槽的长方体腔体内，脑片记录槽的长方体腔体内装有去离子三蒸水,通过加热记录槽内的水控制温度，人工脑脊液循环输入口所连接的管路通过腔体并在腔体内盘绕1-5圈。

3.根据权利要求1所述的离体脑片神经网络振荡记录系统，其特征在于，还包括屏蔽及接地装置及系统防震装置，所述屏蔽及接地装置为长方体，将所述脑片记录槽、气体供给装置、灌流给药装置、照明及温度控制装置、电极固定及操纵装置、神经网络信号记录装置放置在该长方体内，该长方体通过导线接地；所述系统防震装置为气压防震台，所述玻璃微电极、操纵单元和解剖显微镜放置在气压防震台上。

4.根据权利要求1所述的离体脑片神经网络振荡记录系统，其特征在于，所述脑片记录槽侧壁设置两个镀氯化银的银丝，银丝的尖端插入到到凹槽内；银丝的另外一端接地。

5.根据权利要求4所述的离体脑片神经网络振荡记录系统，其特征在于，所述人工脑脊液循环的管路上设置有四通，所述管路通过四通分别连接脑片储存槽和灌流给药装置，所述蠕动泵为四通道恒流蠕动泵。

6.一种离体脑片神经网络振荡记录的方法，采用权利要求1-5任一所述的离体脑片神经网络振荡记录系统，其特征在于，

将离体脑片置于脑片记录槽的凹槽中，所述凹槽底部铺设LensCleaning Tissue；控制所述人工脑脊液的温度为30-32℃，将人工脑脊液和混合氧气通入所述凹槽，通过玻璃微电极传输离体脑片的神经网络信号，记录在神经网络信号记录装置中。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述混合氧气为体积比例的95％O₂+5％CO₂，混合氧气和人工脑脊液的体积比例为0.028～0.035:1。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述脑片记录槽和脑片储存槽的长方体腔体内装有去离子三蒸水；去离子三蒸水中持续通入混合氧气，混合氧气和去离子三蒸水的体积比例为0.028～0.035:1。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，记录神经网络信号时，所述凹槽的孔上覆盖有载玻片。