CN104673895B - 快速检测单增李斯特菌的分子标记 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速检测单增李斯特菌的分子标记，为以下引物：RliB(F)gAAATAgCTCTTTgAggTAAgATggg；RliB(R)gCATAATCCTATgTATAACAggTTTTC。本发明还同时公开了利用上述分子标记进行的快速检测单增李斯特菌的方法，以待测菌液作为模板进行PCR扩增，所得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳；当电泳结果为能在500bp左右产生特异条带时，判定待测物中含有单核细胞增生李斯特菌；反之，则判定待测物中不含有单核细胞增生李斯特菌。

Description

快速检测单增李斯特菌的分子标记
技术领域
本发明涉及快速检测单增李斯特菌的分子标记及其用途。
背景技术
在我国，食源性疾病中细菌性食物中毒发生率占首位，据统计我国每年发生的细菌性食物中毒事件占食物中毒事件总数的30％～90％，人数占食物中毒总人数的60％～90％，细菌性食物中毒严重危害着人们的身体健康。
单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes，单增李斯特氏菌)是一种能引起人畜共患病的致病菌，特别对孕妇、新生儿、老年人和免疫缺陷病人危害严重、致死率高。目前，国际上公认的李斯特菌属共有6个种，即单增李斯特菌(L.monocytogenes)、伊万诺夫李斯特菌(L.ivanovii)、英诺克李斯特菌(L.innocua)、威尔斯李斯特菌(L.welshimeri)、西尔李斯特菌(L.seeligeri)和格氏李斯特菌(L.grayi)。而单增李斯特菌对人类致病性最强，其临床表现为脑膜炎、败血症和孕妇流产等，死亡率高达到20％左右。对人类而言，各年龄组均可感染而发病，但主要是免疫功能低下者最易受该菌感染，可导致脑膜炎、败血症、流产、早产和死胎等后果，病人及无症状携带者也可成为传染源。据国外有关研究报道，由单增李斯特菌引起的食物中毒案例已超过沙门氏菌，但死亡率有时可达20％～50％，被WHO列为20世纪90年代的4大食源性致病菌之一。
单增李斯特氏菌抗逆性较强，耐高渗，在酸性、碱性条件下都有较强的生存能力，能在2～42℃下生存，在冰箱冷藏室内(4℃的环境)中仍可较长时间生长繁殖，这使得该菌在环境中分布广泛，肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实是李斯特菌的感染源。人主要通过食入染菌的食物而感染单增李斯特菌，约占85％～90％的病例是由被污染的食品引起的。
近年来，欧美国家经常发生食用冷藏食物中毒和李斯特菌病的爆发，同时由于我国食品冷链迅速发展，其对冷藏食品中威胁也日益严重。因此，单增李斯特氏菌已引起了各国对食品中检测该菌的高度关注，是食品安全及食品卫生监测的重要食源性致病菌之一。
由于单增李斯特菌在自然界中分布广泛，对食品中单增李斯特菌的及时检测和鉴定成为预防李斯特氏菌食物中毒的有效方法。长期以来，单增李斯特菌的检验方法一直为传统的培养法，该方法先进行增菌，以分离培养得到的可疑菌落做生化反应实验、溶血实验、协同溶血实验(CAMP)等免疫学检测，该方法需要7～11天才能分离鉴定出李斯特氏菌，操作复杂，耗时长，不能适应实际检验工作的需要和快速检测的要求。近年来，为了提高单增李斯特菌的检出灵敏度和检测方法的特异性和简便性，人们利用生物学发展的新技术、新方法研究开发了许多单增李斯特菌检测方法，主要包括API快速反应板方法、显色培养基快速检测方法、免疫学检测方法和PCR法。
因此，建立一种快速灵敏、经济的食源性李斯特菌的检测方法具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种可以简便快速检测单增李斯特菌的方法和所用分子标记，本发明首次利用单增李斯特菌非编码RNA的特异性，通过PCR的方法，对单增李斯特菌进行快速检测验证，与其他的李斯特菌以及菌种进行区分；并且此方法无需提取菌种的DNA，可以直接使用菌液来进行PCR。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种快速检测单增李斯特菌的分子标记，为以下引物：
RliB(F)gAAATAgCTCTTTgAggTAAgATggg
RliB(R)gCATAATCCTATgTATAACAggTTTTC。
本发明还同时提供了利用上述分子标记进行的快速检测单增李斯特菌的方法，包括如下步骤：
1)、将待测菌液作为下述步骤的模板；
2)、PCR扩增
PCR反应体系如下：
PCR反应程序如下：
3)、将上述步骤2)所得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳；
当电泳结果为能在500bp左右产生特异条带时，判定待测物中含有单核细胞增生李斯特菌；
反之，则判定待测物中不含有单核细胞增生李斯特菌。
本发明利用单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)、英诺克李斯特菌(L.innocua)、威尔斯李斯特菌(L.welshimeri)、斯氏李斯特菌(L.seeligeri)、格氏李斯特菌(L.grayi)、伊氏李斯特菌(L.ivanovii)，提取DNA进行PCR验证，筛选引物。
本发明使用单核细胞增生李斯特菌、英诺克李斯特菌、威尔斯李斯特菌、斯氏李斯特菌、格氏李斯特菌、伊氏李斯特菌以及大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、农杆菌的菌液进行PCR验证。
本发明使用筛选出的引物对日常食品(阳性：感染单增李斯特菌；并做阴性对照)进行PCR验证，并且将单增李斯特菌按一定比例稀释后，PCR检测菌的测定限度，并用紫外分光光度计测定原始菌的浓度。
本发明根据单增李斯特菌非编码RNA的特异性设计引物；从而实现对单增李斯特菌进行快速检测验证，与其他的李斯特菌以及菌种进行区分。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为6种不同李斯特菌的PCR检测示意图；介于图幅的原因，分成了1-1、1-2、1-3这3部分；
图1-1中：
M:DL 2000DNA Marker；1-6依次为英诺克李斯特菌、威尔斯李斯特菌、斯氏李斯特菌、格氏李斯特菌、伊氏李斯特菌、单增李斯特菌(引物为RliA(F)和RliA(R))；7-12依次为英诺克李斯特菌、威尔斯李斯特菌、斯氏李斯特菌、格氏李斯特菌、伊氏李斯特菌、单增李斯特菌(引物为RliB(F)和RliB(R))；13-17依次为英诺克李斯特菌、威尔斯李斯特菌、斯氏李斯特菌、格氏李斯特菌、伊氏李斯特菌(引物为RliC(F)和RliC(R))；
图1-2中：
M:DL 2000DNA Marker；1为单增李斯特菌(引物为RliC(F)和RliC(R))；2-7依次为英诺克李斯特菌、威尔斯李斯特菌、斯氏李斯特菌、格氏李斯特菌、伊氏李斯特菌、单增李斯特菌(引物为RliE(F)和RliE(R))；8-9依次为英诺克李斯特菌、威尔斯李斯特菌(引物为RliF(F)和RliF(R))
图1-3中：
M:DL 2000DNA Marker；1-4依次为斯氏李斯特菌、格氏李斯特菌、伊氏李斯特菌、单增李斯特菌(引物为RliF(F)和RliF(R))；5-10依次为英诺克李斯特菌、威尔斯李斯特菌、斯氏李斯特菌、格氏李斯特菌、伊氏李斯特菌、单增李斯特菌(引物为ssrA(F)和ssrA(R))；11-16依次为英诺克李斯特菌、威尔斯李斯特菌、斯氏李斯特菌、格氏李斯特菌、伊氏李斯特菌、单增李斯特菌(引物为LhrA(F)和LhrA(R))。
图2为单增李斯特菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、农杆菌的PCR检测示意图；
M:DL 2000DNA Marker；1为单增李斯特菌；2为大肠杆菌；3为枯草芽孢杆菌；4为农杆菌。
图3是菌液PCR鉴定的可行性探究；
M:DL 2000DNA Marker；1-6依次为依次为单增李斯特菌、绵羊李斯特菌、英诺克李斯特菌、威尔斯李斯特菌、西尔李斯特菌、格氏李斯特菌。
图4是模拟日常食品进行检测；
M:DL 2000DNA Marker；1-7依次为ddH2O(含单增李斯特菌)、冰红茶(含单增李斯特菌)、冰红茶(不含单增李斯特菌)、可乐(含单增李斯特菌)、可乐(不含单增李斯特菌)、牛奶(含单增李斯特菌)、牛奶(不含单增李斯特菌)；
图5是限度的测量；
M:DL 2000DNA Marker；1-7依次为单增李斯特菌原液稀释，倍数依次分别为2、10、20、50、100、200、500倍；
图6是紫外分光光度计测量原液浓度。
具体实施方式
实施例1、运用PCR方法检测单增李斯特菌，
引物分别为RliA(F)和RliA(R)、RliB(F)和RliB(R)、RliC(F)和RliC(R)、RliE(F)和RliE(R)、RliF(F)和RliF(R)、ssrA(F)和ssrA(R)、LhrA(F)和LhrA(R)七对。
其余6对引物的序列分别为：
RliA(F):gCgATTCCAgTCATTTTTTATAAAg
RliA(R):gATgAAATgTCCgATTCTTgTCATg
RliC(F):gCATAATgCTTAAgTggggTAAg
RliC(R):gCgACAACCAATTTACTTgATTAC
RliE(F):gCAACAAAAACACCTATTTTCATTAgTgg
RliE(R):gCAAATAATCTTTACgAAACggAAAC
RliF(F):CgATAAACAAATTCTCCTTAAATAAAAAC
RliF(R):CAggAACAACCgATAgTAgCggg
ssrA(F):gCTTTCAAAAgAAAACAgCgATTATCCg
ssrA(R):gCACTTAACAggCAAAgAAATTTTg
LhrA(F):gCTTATTAAATTATTCCgCCTATAAAAg
LhrA(R):ATTTTTACTAATgTgATTTTCATgggg。
模版：单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)、英诺克李斯特菌(L.innocua)、威尔斯李斯特菌(L.welshimeri)、斯氏李斯特菌(L.seeligeri)、格氏李斯特菌(L.grayi)、伊氏李斯特菌(L.ivanovii)；用试剂盒提取上述菌种的DNA作为模版。
PCR反应体系如下：
PCR反应程序如下：
将所得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳；结果如图1所述；
根据图1，我们得知：
当模板为单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)时，只有本发明的RliB能在500bp左右产生特异条带，其余6对引物均不能产生特异的条带。
当模板为英诺克李斯特菌(L.innocua)、威尔斯李斯特菌(L.welshimeri)、斯氏李斯特菌(L.seeligeri)、格氏李斯特菌(L.grayi)、伊氏李斯特菌(L.ivanovii)时，上述7对引物均为不能产生特异的条带。
实施例2、验证菌液代替提取DNA进行验证的可行性
以本发明的RliB(F)和RliB(R)作为引物；将单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)、绵羊李斯特菌(L.iuanuii)、英诺克李斯特菌(L.innocua)、威尔斯李斯特菌(L.welshimeri)、西尔李斯特菌(L.seeligeri)、格氏李斯特菌(L.grayi)的菌液(浓度均为50ng/μL)直接作为模版加入PCR体系(PCR反应体系和PCR反应程序同实施例1)中，进行PCR，取10μL进行琼脂糖凝胶电泳。
所得结果如图3所示；根据图3，我们得知：本发明可以直接使用菌液而不是提取基因组来进行PCR验证。
实施例3、将模板改成：单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌以及农杆菌的菌液(浓度均为50ng/μL)，以本发明的RliB(F)和RliB(R)作为引物；其余内容同实施例1。
所得结果如图2所述。
根据图2，我们得知：本发明设计的分子标记有一定的专一性，只能在用单核细胞增生李斯特菌为模版的前提下才能获得条带。
实施例4、模拟日常生活中的食品进行验证
分别取1mL ddH2O、冰红茶、牛奶以及可乐，向其中加入1μL的单增李斯特菌，在37℃摇床中培养2h，再各取1μL作为模版(此时，浓度约为85ng/μL)进行PCR，反应体系与反应程序同实施例1。取10μL进行琼脂糖凝胶电泳。
另：取不含单增李斯特菌的ddH2O、冰红茶、牛奶以及可乐作为对照。
所得结果如图4所示；根据图4，我们得知：可以将本发明的分子标记应用于日常生活食品中进行验证单增李斯特菌的存在，冰红茶中含有薄荷等杀菌物质，又因为加入的单增李斯特菌量少，影响了单增李斯特菌的生长，故无特异条带。
实施例5、限度的测量
将单增李斯特菌用LB培养基进行稀释，稀释倍数分别是2、10、20、50、100、200、500倍，并且立即取稀释的菌液1μL作为模版进行PCR检测，反应体系与反应程序同实施例1。取10μL进行琼脂糖凝胶电泳。
所得结果如图5所示；根据图5，我们得知：随着浓度的降低，检测的条带越来越淡，到500倍时，已接近极限，然后测定稀释500倍的浓度，即测定的限度。
备注说明：
用紫外分光光度仪测定初始单增李斯特菌的浓度，结果如图6所示，即，吸光度为2.667k*abs。即，原始浓度为2.66×108个/mL，稀释500倍的浓度为5.32×105个/mL。
实施例6、从冰箱壁上取下一些冰，待其融化后培养(培养条件为37℃，摇床)3个小时，取1μL作为模版进行菌液PCR，取一些过期的饼干，碾磨碎后，加少许水过滤，培养(培养条件为37℃，摇床)滤液3个小时候后取1μL作为模版进行菌液PCR。另分别取正常灭菌水与正常饼干滤液作为阴性对照。
备注说明：上述冰和过期饼干，已按照常规方法检测确认含有单增李斯特菌。
结果：冰箱的冰融化后的水与过期饼干滤液作为模版均能产生出特异条带(500bp左右产生特异条带)。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (1)

1.快速检测单增李斯特菌的分子标记，其特征在于用于检测分子标记的引物为：
RliB(F)gAAATAgCTCTTTgAggTAAgATggg
RliB(R)gCATAATCCTATgTATAACAggTTTTC。
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