CN104655850B - 一种细胞早期不可逆损伤程度的检测方法及检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供的一种细胞损伤程度检测方法，通过检测细胞骨架蛋白的化学修饰变化程度作为评价细胞不可逆损伤早期的损伤程度的参数，即以细胞骨架蛋白发生化学修饰变化的分子数量与细胞骨架蛋白未发生化学修饰变化的分子数量的比值作为评价被检测样品中细胞不可逆损伤的程度的参数。该方法利用作用于细胞骨架等重要生物分子上的化学修饰的变化进行定量分析，从而反映细胞的损伤状态，该方法操作简单、灵敏度高、准确性高、对移植器官的质量评估等领域有特有的应用价值。

Description

一种细胞早期不可逆损伤程度的检测方法及检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物检测领域，特别涉及一种细胞早期不可逆损伤程度的检测方法。

背景技术

细胞是生物体的基本结构单位。细胞的生命活动是在内、外环境的动态平衡过程中进行的。细胞和组织遭受不能耐受的有害因子刺激时，则可能引起损伤。较轻的细胞损伤是可逆的，消除刺激因子后，受损伤细胞可恢复常态，通常称之为亚致死性细胞损伤。细胞的严重损伤是不可逆的，最终引起细胞死亡。引发细胞损伤的原因很多，可以归纳为：缺氧、化学物质和药物、物理因素、生物因子、营养失衡、内分泌因素、免疫反应、遗传变异、衰老等若干大类。

由多种因素引发的细胞损伤，其发生机制复杂。细胞膜的破坏、氧自由基增多、胞浆内高游离钙、缺氧、化学毒作用和遗传物质变异等，对于细胞损伤的发生具有重要意义。这几方面的机制通常是相互结合或是互为因果地导致细胞的损伤。缺氧是诸多致病因素引起细胞损伤的一个非常重要的基本环节。多种原因引发的缺氧最终都导致线粒体氧化磷酸化受抑制，使细胞能量来源三磷酸腺苷（ATP）生成减少，造成细胞膜钠-钾泵、钙泵功能低下和胞浆内蛋白质合成、脂肪代谢障碍等，造成无氧糖酵解过程的活化。酵解会进一步使细胞酸中毒、溶酶体膜破裂、大量降解酶释放形成细胞自身消化。缺氧还可使氧自由基等活性氧类物质增多，膜磷脂丢失，脂质崩解，细胞骨架破坏等。轻度、较短时间缺氧所致的细胞损伤通常是可逆的，严重缺氧或/和较长时间的轻度缺氧所致的细胞损伤是不可逆的，引发细胞坏死。

包括移植用供体器官在内的某些状态下的组织器官，由于缺氧而造成不可避免的、不同程度的细胞损伤。这些细胞损伤可直接引发误诊、误治：对于器官移植手术来说，移植排斥反应是移植失败的主因，而供体器官的质量下降可以引起超急性排斥反应和慢性排斥反应，因此供体器官质量是移植成败的重要决定因素之一。供体器官质量是由供体来源（活供体、脑死亡供体、死亡供体）、供体健康状况、热缺血时间、灌注保存方法、冷储存时间、运输方式等多种因素综合决定。由于移植医学的特殊性，供体群趋于老龄化、活供体源远远少于需求，因而死亡供体成为主要器官源，使相应的供体器官质量远远无法保障。本应在移植手术前对供体器官的质量进行严格评估，然而，世界上目前除了配型和病毒检测以外，没有对供体器官的质量监控的任何其他手段，只是对供体器官的“保质期”有大致的限定，从而造成相当一部分移植手术因源标本质量问题而失败，即便移植手术成功，受过损伤的供体器官往往也不具备正常器官的功能，使患者不必要的接受一次无意义的手术，无谓地加重病人经济负担、社会保险负担，更重要的是，使病人多承受一次危及生命的手术创伤。

目前在器官移植以外的科研、医疗领域，对细胞损伤的检测手段主要有：利用细胞缺氧后失去能量合成而致使三磷酸腺苷（ATP）水平下降为原理，对三磷酸腺苷／二磷酸腺苷比值（ATP/ADP)的检测。此类以检测氧、养为标准的对细胞损伤的评价方法，由于在常规供体器官采样操作中需要对供体器官进行灌注，而灌注液里含有上述ATP等成份，因而针对上述成份的检测无法在对供体器官质量的评估中使用，类似方法还包括针对细胞损伤后的有害分子一氧化氮（NO）、活性氧（ROS）等成份的细胞损伤评估手段。

综上所述，目前急需研发一种能够广泛应用于对器官移植中供体器官内细胞损伤进行定量评估的技术方法，以保障移植手术的合理性以及对移植术后效果的预测。

维持细胞骨架蛋白等基本组成结构的正常功能是保障细胞生存的前提。胞衬蛋白是一种细胞膜骨架蛋白,一个较大的异源二聚体蛋白,由α亚基和β亚基组成,并且具有典型的106个氨基酸构成的被称作α胞衬蛋白重复体的连续基序，在维持细胞膜的稳定、结构及形状中起重要作用。随着对α胞衬蛋白结构与功能地深入研究,人们发现α胞衬蛋白还参与多种生物途径,如细胞粘附及细胞伸展、细胞周期等。更重要的是，从病理学角度出发，骨架蛋白的损伤与细胞膜损伤、溶酶体释放一道是细胞不可逆损伤的三大标志，最终导致细胞核崩解而完全失去生命行为及生理功能。因此，α胞衬蛋白，作为细胞骨架和细胞膜的重要组成部分，是细胞不可逆损伤的评价指标。

重要的生物分子（例如细胞膜蛋白、细胞骨架蛋白等）在细胞内执行生命所需的最基本生物功能，因而维持这些重要分子的正常功能是保障细胞生存的前提。此类生物分子上的化学修饰（例如磷酸化、甲基化等）往往决定了该分子能否正常发挥其功能。在细胞损伤早期，存在于这些重要生物分子上的化学修饰随着损伤的加重而发生渐进性改变，从而影响细胞基本生理功能，最终导致细胞死亡。蛋白质的磷酸化修饰是生物体内共价修饰方式之一（指在蛋白质加入一个磷酸基团，此修饰由于能够反转蛋白的生理功能而在生物化学中占有重要地位）。在哺乳动物细胞生命周期中,大约有1/3的蛋白质发生过磷酸化修饰；在脊椎动物基因组中,有5%的基因编码的蛋白质是参与磷酸化和去磷酸化过程的蛋白激酶和磷酸(酯)酶。磷酸化修饰本身所具有的简单、灵活、可逆的特性以及磷酸基团的供体三磷酸腺苷（ATP）的易得性,使得磷酸化修饰被真核细胞所选择接受成为一种最普遍的调控手段。蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩及肿瘤发生等过程在内的所有生命活动,目前已经知道有许多人类疾病是由于异常的磷酸化修饰所引起,而有些磷酸化修饰却是某种疾病所导致的后果。在真核细胞中最常见的磷酸化修饰是在蛋白质的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基侧链羟基磷酸化。

发明内容

发明目的：本发明的目的在于提供一种灵敏、准确的早期细胞损伤程度检测方法。

技术方案：本发明提供的一种细胞损伤程度检测方法，通过检测细胞骨架蛋白的化学修饰变化程度作为评价细胞不可逆损伤早期的损伤程度的参数，即以细胞骨架蛋白发生化学修饰变化的分子数量与细胞骨架蛋白未发生化学修饰变化的分子数量的比值作为评价被检测样品中细胞不可逆损伤的程度的参数。

通过检测包括细胞骨架蛋白在内的能执行重要细胞生命功能的分子的变化来评价细胞损伤程度，由于该类分子参与细胞骨架、细胞质膜等重要细胞成分的构建，因此该类分子损伤必然造成细胞不可逆损伤。

作为优选，所述细胞骨架蛋白为α胞衬蛋白。

作为另一种优选，所述化学修饰包括磷酸化。

申请人通过大量研究发现，在生物组织和器官失去氧、养供给后的细胞损伤过程中，细胞能量来源减少，造成细胞膜钠-钾泵、钙泵功能低下，细胞膜通透性增加，高浓度钙离子进入细胞内部，导致细胞释放钙蛋白酶，钙蛋白酶在α胞衬蛋白的薄弱环节（第1176号酪氨酸处）将其降解、切断成两个降解片段。重要的是，降解产物与所剩余的完整α胞衬蛋白的比值（即降解比例）与细胞所受损伤程度呈现极为密切的正相关趋向。

申请人进一步通过对α胞衬蛋白作为细胞损伤的指示物的研究过程中发现，α胞衬蛋白的第1176号酪氨酸的磷酸化的丧失，使磷酸基团所导致的蛋白构象变化对该薄弱位点的保护作用消失，从而使该位点对钙蛋白酶的易感性增强；相对于α胞衬蛋白被钙蛋白酶切断来说，1176酪氨酸磷酸化的丧失是更为早期的细胞损伤的特征，也成为细胞损伤演变为不可逆行为的开始。更重要的是，细胞内该氨基酸的总体磷酸化水平与细胞损伤程度呈现极为密切的负相关趋向。

具体而言，细胞在不可逆损伤过程早期发生的病理生理改变（即细胞骨架蛋白α胞衬蛋白在1176号酪氨酸上的去磷酸化过程）如图1所示。图1b显示了细胞可逆性损伤的机制：细胞外游离钙离子11由于细胞膜泵失活、通透性增加而进入细胞内，同时休眠状态的钙蛋白酶12被激活；但由于α胞衬蛋白的磷酸化保护仍然存在，因而被激活状态下的钙蛋白酶15无法接近1176号酪氨酸，无法切割降解α胞衬蛋白。图1c显示了细胞不可逆损伤早期的机制：磷酸基团14从α胞衬蛋白1176号酪氨酸上脱落，钙蛋白酶15在钙离子11的协同下接近1176号酪氨酸，对α胞衬蛋白13进行切割降解。图1d显示了细胞不可逆损伤后期的机制：α胞衬蛋白13被降解，细胞骨架受损、细胞膜严重损伤，细胞走向自溶。

因而通过本发明方法可利用对α胞衬蛋白1176号酪氨酸的磷酸化程度的评价可以反映供体器官内的最早期不可逆细胞损伤程度，从而指导移植手术的供体选择。

从而，本发明提供了一种更具体的细胞损伤程度检测方法，包括以下步骤：

（1）利用捕捉抗体固定待测样品中的α胞衬蛋白；

（2）利用磷酸基团指示抗体测定固定的待测样品中的磷酸基团含量；

（3）利用α胞衬蛋白指示抗体测定固定的待测样品中的总α胞衬蛋白含量；

（4）以磷酸基团含量与总α胞衬蛋白含量的比值反映被检测样品中细胞不可逆损伤的程度。

为了更方便的检测α胞衬蛋白1176号酪氨酸的磷酸化程度，本发明提供了一种检测试剂盒，利用酶联免疫吸附法检测α胞衬蛋白1176号酪氨酸的磷酸化程度，从而反应细胞损伤程度，所述检测试剂盒包括：

酶标板；

固定于酶标孔板上的捕捉抗体；

磷酸基团指示抗体；

α胞衬蛋白指示抗体；

其中，磷酸基团指示抗体为抗α胞衬蛋白1176号酪氨酸位点磷酸化基团的单克隆抗体。

更具体而言，该方法，见图2，包括以下步骤：

图2A为以酶联免疫吸附法对1176号酪氨酸磷酸化的α胞衬蛋白含量检测示意图。其中图2（Aa）为捕捉抗体固定于酶标板上；图2（Ab）为组织悬液中的α胞衬蛋白被捕捉抗体固定于酶标板上；图2（Ac）为识别磷酸基团的单克隆磷酸基团指示抗体与α胞衬蛋白上的磷酸基团结合；图2（Ad）为显色剂和结合的磷酸基团指示抗体上的辣根过氧化物酶结合显色。

图2B为以酶联免疫吸附法对总体α胞衬蛋白含量检测示意图。其中图2（Ba）为捕捉抗体固定于酶标板上；图2（Bb）为组织悬液中的α胞衬蛋白被捕捉抗体固定于酶标板上；图2（Bc）为α胞衬蛋白指示抗体与α胞衬蛋白结合；图2（Bd）为显色剂和结合的α胞衬蛋白指示抗体上的辣根过氧化物酶结合显色。

以磷酸基团含量与总α胞衬蛋白含量的比值反映被检测样品中细胞不可逆损伤的程度。

有益效果：本发明提供的细胞不可逆损伤程度的检测方法是利用作用于细胞内重要生物分子上的化学修饰的变化进行定量分析，从而反映细胞的早期不可逆损伤的程度，该方法操作简单、灵敏度高、准确性高、因对所检测的细胞损伤阶段有明确定位而呈现特有用途。

具体而言，本发明相对于现有技术，具有以下突出的优势：

（1）广谱、稳定：细胞骨架是真核细胞中的蛋白纤维网络结构，具有维持细胞形态、承受外力、参与染色体分离、物质运输、细胞运动等多种重要的生命活动的作用，因而存在于所有真核细胞；细胞骨架的破坏是细胞损伤的基础病理变化。本发明所建立的细胞损伤评估技术，是建立在对细胞骨架完整性的检测基础上，适用于几乎所有含有细胞成份的生物样品，因而具有广谱性的特点。同时，由于细胞骨架是细胞的重要组成部分，含量丰富，因此细胞损伤后细胞骨架的变化具有渐进性的特点，这使得本发明所依赖的技术指标在相当长的细胞损伤过程中保持稳定的规律。

（2）早期：细胞骨架蛋白的修饰是维持骨架稳定、发挥正常功能的决定性调控因素。申请人发现细胞损伤的早期变化即包括了细胞骨架蛋白的修饰的改变。本发明以细胞骨架上决定骨架稳定性的蛋白磷酸化修饰为检测对象，用以反映细胞不可逆损伤的早期变化，因而具有早期鉴别的特长，更适用于器官移植等对生物样品质量要求较高的领域：供体器官的特殊性表现为采集过程需要阻断血液循环，加之大多供体器官需要由不同状态的死亡供体采集、采集后又需要运输储藏等步骤，从而不可避免地造成供体器官内细胞损伤。而对于受体患者而言，却需要最大程度上保持供体器官功能，将细胞损伤减小到最低范围。从病理学角度分析，细胞损伤分为可逆性损伤和不可逆损伤两类。供体器官内的可逆性损伤，在器官移植于受体、恢复血运后可以通过自身修复机制得以解除，不影响器官在受体内发挥生理功能。而不可逆损伤的供体器官内的细胞，则在移植后无法发挥其应有功效，成为无效移植，其自溶产物反而增加受体负担、甚至危害受体健康。因此，对移植用供体器官的质量评价，应当如本发明所述建立在对供体器官内细胞的不可逆损伤程度的观察上

（3）简单、灵敏：器官移植对供体器官的新鲜程度有极高的要求，因而移植前的质量检测应该尽量简捷，检测时间必须少于配型、病毒检测等术前准备的时间。本发明将利用现有成熟的、具有灵敏、快速特点的酶联免疫技术检测细胞骨架磷酸化修饰的变化，使得检测过程短、结果精确灵敏、重复性高。

（4）检测指标设计新颖、功能独特：本发明采用酶联免疫吸附（ELISA）技术检测α胞衬蛋白的磷酸化，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来应用于细胞不可逆损伤的定量检测，具有准确性高、检测时间短、价格低廉、判断结果有客观标准、结果便于记录和保存等优点。更重要的是，本发明是利用酶联免疫吸附技术对磷酸化的α胞衬蛋白占总体α胞衬蛋白的比例进行检测，并以磷酸化比例作为评价细胞损伤的指标，成为具有自身内部参照的指标，因而此方法可以不受不同细胞间α胞衬蛋白自然含量的影响，设计新颖、独特性、适用性强。

（5）质量评估的个体化及意义：现有的以供体器官切除到移植手术之前的时限作为“保质期”的质量评价标准，实际上忽略了供体来源（活供体、脑死亡供体、死亡供体）、供体健康状况、热缺血时间、灌注保存方法、冷储存时间、运输方式等多种因素综合对供体器官质量的影响。本发明是以供体器官内部细胞损伤导致的细微变化为检测指标，在移植手术之前对供体器官的质量进行终极检测，发现各个供体器官的个体化差异。相对于类似申请人前期研究所利用的、以监测α胞衬蛋白完全降解程度为指标的、反映非器官移植所常见的晚期不可逆损伤的技术方法而言，本发明着重监测细胞不可逆损伤的早期表现，因而更具有针对性。本发明将是第一个用于移植术中对于供体器官的质量监控手段。由于其技术特点，本发明对传统的、完全依靠医生肉眼判断的、供体器官质量评估方式进行了客观、准确、量化的改良。由于器官移植的操作特点，供体器官的损伤不可避免，因而本发明对于由死亡供体提供的移植器官、需要经历运输、储藏的多个环节的移植器官具有重要的质量评估功能，因而，本发明所及技术将帮助医生甄别供体器官质量，杜绝“夺命手术”和“无效移植”的发生。同时，本发明所及技术还可以对使用器官质量处于可用期边缘的移植手术的围手术期护理和术后疗效评价均有重要的指导意义。

（6）适用范围广。本发明所及方法适用于评价对早期不可逆损伤要求严格的组织、器官移植手术中所用的供体组织和器官，包括心、肾、肝、肺、胰、小肠、胸腺等人体的器官以及骨、韧带、皮肤、瓣膜、神经、静脉和角膜等组织，因而具有广泛的适用范围。

附图说明

图1为细胞在逆损伤过程中发生的病理生理过程图。其中a为健康细胞，b为可逆性细胞损伤，c为细胞不可逆损伤早期，d为细胞不可逆损伤后期；11为细胞外的高浓度游离钙离子，12为细胞内休眠状态下的钙蛋白酶，13为α胞衬蛋白，14为α胞衬蛋白第1176号酪氨酸上的磷酸基团，15为激活状态下的钙蛋白酶。

图2为本发明检测α胞衬蛋白1176号酪氨酸磷酸化的酶联免疫吸附法示意图；其中，21为捕捉抗体，22为α胞衬蛋白，23为α胞衬蛋白1176号酪氨酸上的磷酸基团，24为磷酸基团指示抗体，25为辣根过氧化物酶，26为显色剂，27为α胞衬蛋白指示抗体。

图3为本发明以酶联免疫吸附法评价器官质量的操作流程图。其中，31为活检取样针，32为器官，33为取样组织，34为装有含磷酸酶抑制剂的细胞裂解液的试管，35为匀浆，36为检测试剂盒。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1

检测试剂盒包括：

酶标板；

固定于酶标孔板上的捕捉抗体，捕捉抗体购自美国Abcam公司；

磷酸基团指示抗体，磷酸基团指示抗体为抗α胞衬蛋白1176号酪氨酸位点磷酸化基团的单克隆抗体；其制备方法为：

1.合成带有磷酸基团和不带有磷酸基团的短肽，短肽序列为人α胞衬蛋白上的以第1176号氨基酸为中点的连续的11个氨基酸；

2.将不同短肽注入不同小鼠以诱发免疫反应；

3.将小鼠脾细胞与杂交瘤细胞融合；

4.挑取识别带有磷酸基团的短肽但不识别不带磷酸基团的短肽的单克隆细胞，即为能生产磷酸基团指示抗体的细胞。

α胞衬蛋白指示抗体，α胞衬蛋白指示抗体购自美国Abcam公司。

体外重组的磷酸化的与非磷酸化的α胞衬蛋白标准品，购自美国Anaspec公司；

去离子水；

检测装置为常规使用的具有450纳米波长读取能力的酶标仪。酶标板包括五组，分别为a、b、c、d、e列，其中，a列为空白对照组，b列为不同浓度的磷酸化α胞衬蛋白标准品组，c列为磷酸化α胞衬蛋白检测组，d列为不同浓度的总体α胞衬蛋白标准品组，e列为总体α胞衬蛋白检测组。

通过评估肝脏细胞损伤程度评价供体肝脏质量，见图3，包括以下步骤：

（1）准备：将各检测用试剂平衡至室温，将检测用试剂由储存浓度稀释至工作浓度；将冻干保存的磷酸化α胞衬蛋白标准品以及总体α胞衬蛋白标准品以蒸馏水溶解，待用；用蛋白提取液1:1000分别稀释抗磷酸化α胞衬蛋白和抗总体α胞衬蛋白的两种酶标抗体，待用。

（2）被检器官取样：以14号90mm活检取样针获取一车祸死亡3小时供体的肝脏组织1毫克（1立方毫米）。

（3）蛋白质提取：将取样组织置于装有200微升蛋白提取液（含正钒酸钠磷酸酶抑制剂的磷酸盐缓冲液）的1.7毫升带盖微量离心管中，以手持匀浆机用微型匀浆头在3000转／分钟于湿冰上匀浆30秒；辅以17000转／分钟台式离心机在4摄氏度离心3分钟；将上清组织移入新试管，用蛋白提取液1:50稀释，置于湿冰上待用。

（4）加样、α胞衬蛋白捕获：于酶标板相应孔加入100微升的待测样品、标准品、阴性对照样品（空白蛋白提取液），加盖后置37摄氏度孵育30分钟。

（5）酶标抗体孵育：甩干步骤（4）加入的液体，磷酸盐溶液30秒静置，冲洗三次。在指定的阴性对照孔、标准品孔、待测样品孔内分别加入100微升、步骤（1）稀释的、两种酶标抗体，加盖后置于37摄氏度孵育20分钟，如步骤（4）冲洗三次。

（6）底物配制、显色：1:100混合含有过氧化氢的底物A和含有四甲基联苯胺（TMB）的底物B配制成底物工作液，每孔加底物工作溶液100微升，置室温显色5分钟左右(至总体α胞衬蛋白标准品孔呈现明显蓝色梯度为止)。

（7）终止反应、读数：每孔加入50微升硫酸终止液，立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度，根据标准品计算出第三列所读取的被测供体器官细胞内磷酸化的α胞衬蛋白含量为45纳克，第五列所读取的总α胞衬蛋白含量为60纳克，二者比例为0.75（磷酸化α胞衬蛋白含量／总体α胞衬蛋白含量），作为供体器官质量评估的参数。

（8）评价：

磷酸化α胞衬蛋白含量／总体α胞衬蛋白含量为0.8～1.0：供体器官质量可靠；

磷酸化α胞衬蛋白含量／总体α胞衬蛋白含量为0.4～0.8：供体器官为可移植器官，围手术期应做好因供体器官损伤导致受体疾患的准备和相应的预防护理；

磷酸化α胞衬蛋白含量／总体α胞衬蛋白含量小于0.4的供体器官为不可移植器官。

本实例所检测到的供体器官质量评估的参数介于0.4～0.8之间，因而器官可以被用于移植，但围手术期应严密观测肝功能变化，提高激素即免疫抑制剂用量，做好移植失败的方案；在移植手术后发现：患者肝脏功能明显好转，谷丙转氨酶由术前85单位／升降至45单位／升，证明了该器官使用的安全性好。

通过评估肾脏细胞损伤程度评价供体肾脏质量，除以下步骤外，均与上述相同：

被检器官取样：以14号90mm活检取样针获取一车祸死亡6小时供体的肾脏组织1毫克（1立方毫米）。

终止反应、读数：根据标准品计算出第三列所读取的被测供体器官细胞内磷酸化的α胞衬蛋白含量为25纳克，第五列所读取的总α胞衬蛋白含量为75纳克，二者比例为0.33，作为供体器官质量评估的参数。

由于肾脏对于缺氧耐受比肝脏略高，因而评价标准与肝脏略有不同：

磷酸化α胞衬蛋白含量／总体α胞衬蛋白含量为0.75～1.0）：供体器官质量可靠；

磷酸化α胞衬蛋白含量／总体α胞衬蛋白含量为0.25～0.8：供体器官为可移植器官，围手术期应做好因供体器官损伤导致受体疾患的准备和相应的预防护理；

磷酸化α胞衬蛋白含量／总体α胞衬蛋白含量小于0.25的供体器官为不可移植器官。

本实例所检测到的供体器官质量评估的参数介于0.25～0.8之间，因而器官可以被用于移植，但围手术期应严密观测肾脏功能变化，提高激素即免疫抑制剂用量。移植手术后发现，患者肾脏功能明显好转，血尿素氮（BUN）和血肌酐含量由术前13.3毫摩和260微摩降至6.7毫摩和113微摩，证明了该器官使用的安全性好。

Claims (3)

1.一种细胞早期不可逆损伤程度的检测方法，其特征在于：以细胞骨架蛋白1176号酪氨酸位点发生化学修饰变化的分子数量与细胞骨架蛋白1176号酪氨酸位点未发生化学修饰变化的分子数量的比值作为评价被检测样品中细胞不可逆损伤的程度的参数；其中，所述化学修饰变化为磷酸化；所述细胞骨架蛋白为α胞衬蛋白。

2.一种细胞早期不可逆损伤程度的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）利用捕捉抗体固定待测样品中的α胞衬蛋白；

（2）利用磷酸基团指示抗体测定固定的待测样品中的磷酸基团含量；

（3）利用α胞衬蛋白指示抗体测定固定的待测样品中的总α胞衬蛋白含量；

（4）以磷酸基团含量与总α胞衬蛋白含量的比值反映被检测样品中细胞不可逆损伤的程度。

3.一种细胞早期不可逆损伤检测试剂盒，其特征在于：包括

酶标孔板；

固定于酶标孔板上的捕捉抗体；

磷酸基团指示抗体；所述磷酸基团指示抗体为抗α胞衬蛋白1176号酪氨酸位点磷酸化基团的单克隆抗体；

α胞衬蛋白指示抗体。