CN104655600A - 一种测定CS/siRNA复合体系中siRNA复合率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种测定壳聚糖（CS）基载siRNA复合物体系中siRNA复合率的方法。本发明以与双链siRNA特异性结合的核酸染料加入到CS/siRNA复合物溶液中，通过测定溶液荧光强度并结合染料荧光强度-siRNA浓度标准曲线计算体系中游离siRNA浓度并得出siRNA复合率。本发明提供的方法无需将复合物与游离siRNA分离便可精确测定复合物体系中siRNA复合率，且具检测结果准确、精密度高、容易操作等优点。

Description

一种测定CS/siRNA复合体系中siRNA复合率的方法

技术领域

本发明涉及一种siRNA复合率的测定方法，具体说是一种壳聚糖作为siRNA递送载体体系时形成的CS/siRNA复合体系中siRNA复合率的一种检测方法。

背景技术

小干扰RNA(siRNA)由21～23个碱基对构成，可在细胞质中特异性与其碱基对互补的信使RNA(mRNA)结合并使其经核酸酶降解，从而阻断其编码蛋白质的表达,即通过RNA干扰(RNAi)实现基因沉默。因此，siRNA作为药物在癌症和流感、炎等病毒感染疾病治疗领域有重要科学意义和应用价值。然而，荷负点的亲水性siRNA难以跨越表面负电的疏水性细胞膜，易被核酸酶降解及快速从血液循环中清除。因此需要安全高效的载体释放系统保护并高效运送进入细胞发挥功能。

壳聚糖（Chitosan，CS），是由甲壳素（chitin）脱乙酰化制得的一种聚氨基葡萄糖，是一种含β(1,4)2乙酰胺基D葡糖单元和β(1,4)2胺基D葡糖单元的共聚物。壳聚糖是天然多糖中唯一的碱性多糖，含有游离氨基并在酸性条件下能结合氢离子，成为带正电荷的电解质，可与带负电荷siRNA通过静电相互作用，自聚集形成纳米结构复合体系，无需使用有机溶剂及超声处理，减少对核酸损伤。由于壳聚糖载体缠绕、包裹而被束缚的siRNA处于复合态，而不受束缚的siRNA处于游离态。

评价CS/siRNA纳米复合物质量的指标有粒径及粒径分布、表面zeta电位和siRNA复合率等。其中siRNA复合率（即复合态siRNA占总siRNA百分率）对siRNA最终作用效果以及壳聚糖材料优化、成本核算等方面有重要影响。目前，用于测定壳聚糖载体体系中siRNA复合率的方法往往存在较大的问题，如方法的灵敏性、重复性差，甚至无法定量。

聚丙烯酰胺及琼脂糖凝胶电泳法最常用于表征siRNA复合状态。Xiudong Liu等人报道了用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）法考察了壳聚糖分子量及脱乙酰度对siRNA复合的影响（Xiudong Liua,Kenneth A.Howard,Mingdong Dong,et al.The ifluence of polymeric properties onchitosan/siRNA nanoparticle formulation and gene silencing[J].Biomaterials28(2007)1280–1288.）。游离态siRNA在电场力作用下沿凝胶孔迁移，而复合态siRNA由于纳米粒空间位阻作用不随电场力迁移，最终游离态与复合态siRNA发生分离。后经siRNA荧光染料作用后紫外照射下siRNA呈现明亮的条带，且条带明亮程度与游离siRNA浓度正相关。实验组游离siRNA条带与不含载体的对照组siRNA对比后评价各条件下载体对siRNA复合能力。

将纳米粒复合物与游离siRNA分离后直接测定后者浓度可以得出siRNA复合率。Xudong Yuan等利用离心方法将游离siRNA分离并测得siRNA复合率（Xudong Yuan,Bruhal A.Shah,Naimesh K.Kotadia et al.The Development and Mechanism Studies of Cationic Chitosan-ModifiedBiodegradable PLGA anoparticles for Efficient siRNA Drug Delivery[J].Pharm Res(2010)27:1285–1295.）。制备的纳米粒复合物悬液经3000rpm离心20min后，纳米粒沉降而得以与游离siRNA分离。离心上清液经紫外分光光度计检测260nm处紫外吸光度值，并利用绘制的siRNA浓度-吸光度标准曲线计算游离siRNA浓度，进而计算得到纳米粒体系siRNA复合率为最高位77.7%。

凝胶电泳法表征siRNA复合状况，结果直观明了，对比强烈，虽然可以通过图像处理软件分析条带亮度而给出复合率值，然而这种定量方法重复性难以满足要求。离心、超滤等方法分离游离siRNA并测定其浓度得出复合率的方法可以实现精确定量，但分离操作繁琐，且分离过程对siRNA复合状态产生不可避免的影响，最终导致得到的复合率结果准确性差。同时，紫外灯检测方法特异性弱，灵敏性差。

发明内容

针对现有方法的缺陷，本发明的目的在于提供一种定量测定CS/siRNA体系中siRNA复合率的方法，该方法无需将纳米粒与游离siRNA分离，原位加入核酸燃料便可根据荧光强度变化精确测定游离siRNA浓度。

本发明定量检测siRNA复合率是利用核酸染料与游离siRNA结合后荧光特性发生改变的特性，根据siRNA浓度-荧光强度计算体系中游离siRNA浓度，进而计算到siRNA复合率。本发明所用核酸染料指及均购自美国Molecular Probes公司，原液为DMSO为溶剂浓度为10000X（10000倍）浓缩液，使用时根据需要选择合适的缓冲溶液将其稀释至合适的浓度，如稀释10000倍得浓度1X工作液，稀释2000倍得浓度5X工作液。核酸染料未与siRNA结合时，所发射荧光极其微弱，而嵌入siRNA后其荧光强度增强500-1000倍。在CS/siRNA体系中核酸染料可与游离siRNA自由结合，而siRNA复合后由于自身构象变化及壳聚糖空间位阻作用将无法与染料嵌合。因此，根据加入核酸染料后样品荧光强度并结合siRNA浓度-荧光强度标准曲线即可得出siRNA复合率。

由此，本发明人利用核酸染料该荧光性质，提出如下精准测定CS/siRNA体系中siRNA复合率的方法。

本发明提出的具体技术方案：

(1)将摩尔浓度为C_si，体积为V_si的siRNA加入到质量浓度为W_CS，体积为V_CS的壳聚糖（chitosan，CS）溶液中，反应经时间T₁后形成CS/siRNA复合物。

(2)将浓度为C_SY、体积为V_SY核酸染料加入到步骤（1）制备的复合物溶液中，反应时间T₂。

(3)将步骤（2）获得的溶液测定荧光强度（激发波长λ₁为470-510nm，发射波长λ₂为520-550nm）。

(4)配制系列siRNA浓度溶液，绘制siRNA浓度-荧光强度标准曲线。

(5)使用步骤（3）获得的荧光强度通过步骤（4）的标准曲线计算得到体系中游离siRNA浓度为C_si-free，并按照如下公式计算得出siRNA复合率CE：

$\mathrm{CE}=1-\frac{C_{\mathrm{si}-\mathrm{free}}\×(V_{\mathrm{si}}+V_{\mathrm{CS}}+V_{\mathrm{SY}})}{C_{\mathrm{si}}\×V_{\mathrm{si}}}\×100\%$

作为具体解决方案的优选方案，所述核酸染料为或

作为具体解决方案之一的优选方案，所述C_si为0.1-10μM，V_si为1-100μL，W_CS为0.01-1mg/mL，V_CS为1-100μL，T₁为5-60min，N为0.5-5X，V_SY为10-100μL，T₂为5-60min。

本发明效果如下：

(1)本发明可精准测定CS/siRNA体系中siRNA复合率，灵敏度高，重复性好

(2)本发明精准测定CS/siRNA体系中siRNA复合率过程，无需对纳米粒分离，检测过程不对siRNA复合状态产生影响。

(3)本发明精准测定CS/siRNA体系中siRNA复合率，消耗样品少，

操作方便，可同时测定多种样本。

附图说明

图1为核酸染料结合游离siRNA原理示意图；

图2为siRNA浓度荧光强度标准曲线（对应实施例1、

4、6）。

具体实施方式

配制体积为V_si+V_CS、摩尔浓度分别为80nM、160nM、240nM、320nM、400nM的siRNA溶液，并加入浓度为C_SY、体积为V_SY核酸染料，反应时间T₂后检测各浓度siRNA样品荧光强度，绘制siRNA浓度-荧光强度标准曲线；荧光的激发波长λ₁为470-510nm，发射波长λ₂为520-550nm；

实施例1：CS/siRNA纳米复合物siRNA复合率定量检测

(1)于96孔黑色酶标板中，取体积为4μL，浓度为5μM的siRNA加入到体积为45μL，浓度为0.45mg/mL的壳聚糖溶液（分子量40KDa，脱乙酰度70%）中，置于微量振荡器室温下避光震荡30min，得CS/siRNA复合物。

(2)取50μL2X加入到该复合物溶液中，微量振荡器室温下避光震荡30min。

(3)测定溶液490nm激发，550nm发射荧光强度为88，根据同条件siRNA浓度-荧光强度标准曲线计算得体系中游离siRNA浓度为18nM，计算得siRNA复合率为91%。

实施例2：CS/siRNA纳米复合物siRNA复合率定量检测

(1)于96孔黑色酶标板中，取体积为20μL，浓度为4μM的siRNA加入到体积为90μL，浓度为1.0mg/mL的壳聚糖溶液（分子量98KDa，脱乙酰度85%）中，置于微量振荡器室温下避光震荡30min，得CS/siRNA复合物.

(2)取100μL2X加入到该复合物溶液中，微量振荡器室温下避光震荡30min。

(3)测定溶液470nm激发，520nm发射荧光强度为128，根据同条件siRNA浓度-荧光强度标准曲线计算得体系中游离siRNA浓度为32nM，计算得siRNA复合率为92%。

实施例3：CS/siRNA纳米复合物siRNA复合率定量检测

(1)于96孔黑色酶标板中，取体积为4μL，浓度为5μM的siRNA加入到体积为45μL，浓度为0.45mg/mL的壳聚糖溶液（分子量329KDa，脱乙酰度80%）中，置于微量振荡器室温下避光震荡30min，得CS/siRNA复合物。

(2)取50μL2X加入到该复合物溶液中，微量振荡器室温下避光震荡30min。

(3)测定溶液475nm激发，525nm发射荧光强度为32，根据同条件siRNA浓度-荧光强度标准曲线计算得体系中游离siRNA浓度为8nM，计算得siRNA复合率为96%。

实施例4：CS/siRNA纳米复合物siRNA复合率定量检测

(1)于96孔黑色酶标板中，取体积为20μL，浓度为4μM的siRNA加入到体积为90μL，浓度为1.0mg/mL的壳聚糖溶液（分子量416KDa，脱乙酰度60%）中，置于微量振荡器室温下避光震荡30min，得CS/siRNA复合物.

(2)取100μL2X加入到该复合物溶液中，微量振荡器室温下避光震荡30min。

(3)测定溶液500nm激发，550nm发射荧光强度为390，根据同条件siRNA浓度-荧光强度标准曲线计算得体系中游离siRNA浓度为32nM，计算得siRNA复合率为80%。

实施例5：CS/siRNA纳米复合物siRNA复合率定量检测

(1)于96孔黑色酶标板中，取体积为1μL，浓度为30μM的siRNA加入到体积为70μL，浓度为0.43mg/mL的壳聚糖溶液（分子量160KDa，脱乙酰度80%）中，置于微量振荡器室温下避光震荡30min，得CS/siRNA复合物。

(2)取100μL2X加入到该复合物溶液中，微量振荡器室温下避光震荡30min。

(3)测定溶液475nm激发，525nm发射荧光强度为37，根据同条件siRNA浓度-荧光强度标准曲线计算得体系中游离siRNA浓度为21nM，计算得siRNA复合率为93%。

实施例6：CS/siRNA纳米复合物siRNA复合率定量检测

(1)于96孔黑色酶标板中，取体积为1μL，浓度为30μM的siRNA加入到体积为70μL，浓度为0.43mg/mL的壳聚糖溶液（分子量233KDa，脱乙酰度85%）中，置于微量振荡器室温下避光震荡30min，得CS/siRNA复合物.

(2)取100μL2X加入到该复合物溶液中，微量振荡器室温下避光震荡30min。

(3)测定溶液495nm激发，545nm发射荧光强度为370，根据同条件siRNA浓度-荧光强度标准曲线计算得体系中游离siRNA浓度为30nM，计算得siRNA复合率为90%。

Claims (5)

1.一种测定CS/siRNA复合体系中siRNA复合率的方法，其特征在于：将核酸染料加入到CS/siRNA复合物溶液中，反应5-60min，通过测定溶液中核酸染料的荧光强度，得到CS/siRNA复合物体系中游离siRNA浓度，从而计算出siRNA复合率。

2.按照权利要求1所述的测定CS/siRNA复合体系中siRNA复合率的方法，其特征在于所述方法的具体步骤如下：

（1）将摩尔浓度为C_si、体积为V_si的siRNA加入到质量浓度为W_CS、体积为V_CS的壳聚糖（chitosan，CS）溶液中，反应经时间T₁后形成CS/siRNA复合物；

（2）将浓度为C_SY、体积为V_SY核酸染料加入到步骤（1）制备的复合物溶液中，反应时间T₂；

（3）将步骤（2）获得的溶液测定荧光强度；荧光的激发波长λ₁为470-510nm，发射波长λ₂为520-550nm；

（4）配制体积为V_si+V_CS、摩尔浓度分别为80nM、160nM、240nM、320nM、400nM的siRNA溶液，并加入将浓度为C_SY、体积为V_SY核酸染料，反应时间T₂后检测各浓度siRNA样品荧光强度，绘制siRNA浓度-荧光强度标准曲线；荧光的激发波长λ₁为470-510nm，发射波长λ₂为520-550nm；

（5）将步骤（3）获得的荧光强度代入步骤（4）的标准曲线，计算得到体系中游离siRNA摩尔浓度为C_si-free，并按照如下公式计算得出siRNA复合率CE：

$\mathrm{CE}=1-\frac{C_{\mathrm{si}-\mathrm{free}}\×(V_{\mathrm{si}}+V_{\mathrm{CS}}+V_{\mathrm{SY}})}{C_{\mathrm{si}}\×V_{\mathrm{si}}}\×100\%.$

3.按照权利要求1或2所述的测定CS/siRNA复合体系中siRNA复合率的方法，其特征在于：核酸染料为或I。

4.按照权利要求1所述的测定CS/siRNA复合体系中siRNA复合率的方法，其特征在于：所述C_si为0.1-10μM，V_si为1-100μL，W_CS为0.01-1mg/mL，V_CS为1-100μL，T₁为5-60min，C_SY为0.5-5X，V_SY为10-100μL，T₂为5-60min。

5.按照权利要求1或2所述的测定CS/siRNA复合体系中siRNA复合率的方法，其特征在于：该方法适合测定分子量20kDa-500kDa，脱乙酰度60%-95%范围内的壳聚糖所制备CS/siRNA复合物中siRNA复合率。