CN104602512A

CN104602512A - 改良亚麻荠油的脂肪酸分布

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Publication number: CN104602512A
Application number: CN201380015227.7A
Authority: CN
Inventors: D·普迪克; A·托德; C·沙瓦斯; M·史密斯; H·达穆德; B·麦戈尼格尔
Original assignee: Linnaeus Plant Sciences Inc
Current assignee: Linnaeus Plant Sciences Inc
Priority date: 2012-01-23
Filing date: 2013-01-23
Publication date: 2015-05-06
Also published as: EP2806730A1; AU2013212260A1; CA2862477A1; US20160032307A1; EA201491408A1; EP2806730A4; WO2013112578A1; US20140107361A1; BR112014018175A2

Abstract

本公开提供用于改良亚麻荠(Camelina sativa)油中的脂肪酸的方法和组合物。脂肪酸去饱和酶2(FAD2)、脂肪酸去饱和酶3(FAD3)和/或脂肪酸延长酶1(FAE1)基因调控亚麻荠油中的脂肪酸组成。

Description

改良亚麻荠油的脂肪酸分布

相关申请的交叉引用

本申请要求于2012年1月23日提出的美国临时申请号61/589,806的权益，并且将其全文以引用方式并入。

技术领域

本公开涉及分子生物学领域和植物中的脂肪酸合成的调控。更具体地，本公开提供用于改良亚麻荠(Camelina sativa)油中的脂肪酸组成的方法和组合物。

背景技术

亚麻荠(Camelina sativa(L)Crtz.)是具有相对短的生长期、抗寒且耐旱的油料种子作物，并且可使用相对较少肥料生长于边际土地上。由于能够生长于主要食用作物不生长的区域和条件中，因此亚麻荠最近已在加拿大和美国被提出用于生物产业应用，例如生物柴油、润滑剂和油脂化学原料。

亚麻荠油是从种子中提取的并且通常包含25％到35％的单不饱和脂肪酸和50％到60％的多不饱和脂肪酸(PUFA)。高PUFA含量赋予了在精制油中的低氧化稳定性，因此限制了亚麻荠油在工业中的应用。除了其低氧化稳定性外，超过一个双键的存在也会导致例如复分解和臭氧分解的过程中的不合需要的副产物。

发明内容

本申请提供用于改良亚麻荠油中的脂肪酸的方法、构建体等。

在一个方面，提供用于改良亚麻荠中的脂肪酸分布的方法，其包括相对于对照亚麻荠植物阻抑FAD2和FAD3的表达。在一实施方案中，所述方法进一步包括阻抑FAE1的表达。

在另一方面，提供用于改良亚麻荠中的脂肪酸分布的方法，其包括相对于对照亚麻荠植物阻抑FAD3的表达。

在另一方面，提供用于改良亚麻荠中的脂肪酸分布的方法，其包括相对于对照亚麻荠植物阻抑FAD2的表达。

在另一方面，提供相对于对照亚麻荠植物具有受到阻抑的FAD3的转基因亚麻荠植物。在一个实施方案中，亚麻荠油是从所述植物中提取的。

在另一方面，提供相对于对照亚麻荠植物具有受到阻抑的FAD2的转基因亚麻荠植物。

另一方面提供相对于对照亚麻荠植物具有受到阻抑的FAD2和FAD3的转基因亚麻荠植物。在一个实施方案中，亚麻荠油是从所述植物的种子中提取的。

另一方面提供相对于对照亚麻荠植物具有受到阻抑的FAD2、FAD3和FAE1的转基因亚麻荠植物。

在另一方面，提供包含FAD3的分离的核酸分子。

另一方面提供包含阻抑FAD3的核酸序列的构建体。在一个实施方案中，植物细胞包含所述构建体。

在另一方面，提供包含SEQ ID NO：80、83和86(FAD2)中所述的amiRNA的构建体。

在另一方面，提供包含SEQ ID NO：89、92和95(FAD3)中所述的amiRNA的构建体。

在另一方面，提供包含SEQ ID NO：98和101(FAE1)中所述的amiRNA的构建体。

在另一方面，提供用于产生高油酸亚麻荠油的方法，其包括(a)阻抑亚麻荠中的FAD2、FAD3和FAE1，由此生成转基因亚麻荠植物，和(b)从所述转基因亚麻荠植物的种子中提取油，其中所述油是高油酸的。

在另一方面，提供用于降低亚麻荠油中的多不饱和脂肪酸的方法，其包括(a)阻抑亚麻荠中的FAD2和FAD3，由此生成转基因亚麻荠植物，和(b)从所述转基因亚麻荠植物产生的所述种子中提取油，其中所述油的多不饱和脂肪酸水平相对于来自非转基因植物的油降低。

在另一方面，提供高油酸亚麻荠油，其中所述油包含至少60％油酸(占总脂肪酸的％)。在一些实施方案中，高油酸亚麻荠油是指具有至少约50％到90％油酸的亚麻荠油。例如，高油酸亚麻荠油可具有约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％油酸。

在另一方面，提供低亚麻酸(18：3Δ9，12，15)亚麻荠油，其中所述油包含不超过10％的亚麻酸(占总脂肪酸的％)。

在另一方面，提供用于降低亚麻荠中的亚麻酸(18：3Δ9，12，15)的方法，其包括相对于对照亚麻荠植物阻抑FAD3。

在另一方面，提供用于在亚麻荠中增加蓖麻油酸并降低12-羟基-顺式-9，15-十八碳二烯酸(densipolic acid)的方法，其包括相对于表达油酸羟化酶的对照亚麻荠植物阻抑FAD2和FAD3。在一些实施方案中，高蓖麻油酸油是指具有至少约15％到30％蓖麻油酸的亚麻荠油。例如，高蓖麻油酸亚麻荠油可具有约15％、20％、25％或30％蓖麻油酸。

在另一方面，提供具有高油酸和巨头鲸鱼酸和降低的多不饱和脂肪酸的亚麻荠油。在一个实施方案中，所述油是从阻抑FAD2和FAD3的植物中提取的。在一些实施方案中，高巨头鲸鱼酸亚麻荠油是指具有至少约20-40％巨头鲸鱼酸的亚麻荠油。例如，高巨头鲸鱼酸亚麻荠油可具有约20％、25％、30％、35％或40％巨头鲸鱼酸。

在另一方面，提供包含SEQ ID NO：80、83和86(FAD2)中所述的amiRNA的转基因植物。

在另一方面，提供包含SEQ ID NO：89、92和95(FAD3)中所述的amiRNA的转基因植物。

在另一方面，提供包含SEQ ID NO：98和101(FAE1)中所述的amiRNA的转基因植物。

在另一方面，存在使用amiRNA改良亚麻荠油分布的方法。在一个实施方案中，所述amiRNA陈述于SEQ ID NO：80、83、86(FAD2)；SEQ IDNO：89、92和95(FAD3)；和/或SEQ ID NO：98、101(FAE1)中。

在另一方面，本申请提供从相对于对照亚麻荠植物具有受到阻抑的FAD2、FAD3和FAE1的转基因亚麻荠植物中提取的油。

在另一方面，申请人提供用于降低亚麻荠中的12-羟基-顺式-9，15-十八碳二烯酸的方法，其包括相对于对照亚麻荠植物阻抑FAD3。

在另一方面，提供用于改良亚麻荠中的脂肪酸分布的方法，其包括相对于对照亚麻荠植物阻抑FAD2和FAE1的表达。在一个实施方案中，转基因亚麻荠相对于对照亚麻荠植物具有受到阻抑的FAD2和FAE1的表达

在另一方面，申请人提供用于改良亚麻荠中的脂肪酸分布的方法，其包括相对于对照亚麻荠植物阻抑FAD3和FAE1的表达。在一个实施方案中，转基因亚麻荠相对于对照亚麻荠植物具有受到阻抑的FAD3和FAE1的表达。

附图说明

图1：含有amiRNA表达盒和选择标记DsRed的T-DNA插入物的示意性图谱。PsoyBcon：种子特异性大豆β伴大豆球蛋白启动子；Tphas：菜豆球蛋白(Phaseolin)终止子序列；PCMV：组成型木薯叶脉花叶病毒启动子；Tnos：来自土壤杆菌胭脂碱合酶基因的终止子序列；

图2：亚麻荠种子的靶标脂肪酸分布；

图3：高油酸亚麻荠T2种子的脂肪酸分布；

图4：18：3-沉默的亚麻荠T2种子的脂肪酸分布；

图5：单个amiRNA表达盒的T-DNA插入物的示意性图谱。A)FAD2 amiRNA和选择标记DsRed；B)FAD3 amiRNA和DsRed；和C)FAE1amiRNA和DsRed。PsoyBcon：种子特异性大豆β伴大豆球蛋白启动子；Tphas：菜豆球蛋白终止子序列；PCMV：组成型木薯叶脉花叶病毒启动子；Tnos：来自土壤杆菌胭脂碱合酶基因的终止子序列。

图6：串联amiRNA表达盒的T-DNA插入物的示意性图谱。A)串联amiRNA表达盒FAD2 amiRNA、FAD3 amiRNA和FAE1 amiRNA，其侧接有种子特异性大豆β伴大豆球蛋白启动子和菜豆球蛋白终止子序列Tphas的3’转录终止区；B)串联amiRNA表达盒FAD2 amiRNA、FAD3 amiRNA，且侧接有种子特异性大豆β伴大豆球蛋白启动子和菜豆球蛋白终止子序列Tphas的3’转录终止区；FAE1 amiRNA表达盒，其侧接来自大豆的Gy 1和来自豌豆豆球蛋白A2基因的3’转录终止区(Rerie等人(1991)Mol.Gen.Genet.225：148-157)。

具体实施方式

本发明人认识到，虽然亚麻荠可经受住不合需要的生长条件，但常规亚麻荠油的脂肪酸分布限制了其用途。亚麻荠油通常包含25％到35％的单不饱和脂肪酸和50％到60％的多不饱和脂肪酸(PUFA)。高PUFA含量赋予了低氧化稳定性，因此限制了亚麻荠油在工业中的应用。除了其低氧化稳定性外，超过一个双键的存在也会导致例如复分解和臭氧分解的过程中的不合需要的副产物。因此，为了与其它工业原料竞争，本发明人预期改良亚麻荠油的脂肪酸分布。

因此且在一个方面，申请人预期增加单不饱和脂肪酸，例如油酸(18：1，顺式-9-十八碳烯酸)、巨头鲸鱼酸(20：1，顺式-11-二十碳烯酸)和芥酸(22：1，顺式-13-二十二碳烯酸)，而降低亚油酸(18：2，顺式，顺式-9，12-十八碳二烯酸)及α亚麻酸(18：3，全顺式-9，12，15-十八碳三烯酸)。

如此，申请人发现，例如，脂肪酸去饱和酶2(FAD2)、脂肪酸去饱和酶3(FAD3)和/或脂肪酸延长酶1(FAE1)基因调控亚麻荠油中的脂肪酸组成。例如并且决不是限制性的，申请人确定了使FAD2、FAD3和FAE1沉默产生高油酸亚麻荠油，而使FAD2和FAD3沉默降低PUFA并且随后增加亚麻荠油中的油酸和巨头鲸鱼酸。

本文中所用的所有技术术语均为生物化学、分子生物学和农业中常用的术语，并且可被这一技术所属领域所属技术人员理解。那些技术术语可在以下文献中找到：MOLECULAR CLONING：A LABORATORYMANUAL，第3版，第1-3卷，Sambrook和Russel编辑，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，2001；CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR BIOLOGY，Ausubel等人编辑，Greene PublishingAssociates and Wiley-Interscience，New York，1988(定期更新)；SHORTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY：A COMPENDIUM OFMETHODS FROM CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，第5版，第1-2卷，Ausubel等人编辑，John Wiley&Sons公司，2002；GENOME ANALYSIS：A LABORATORY MANUAL，第1-2卷，Green等人编辑，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1997。涉及植物生物学技术的方法描述于本文中并且详细描述于例如以下的专著中：METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY：A LABORATORYCOURSE MANUAL，Maliga等人编辑，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1995。使用PCR的各种技术描述于例如Innis等人，PCR PROTOCOLS：A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS，Academic Press，San Diego，1990以及Dieffenbach和Dveksler，PCRPRIMER：A LABORATORY MANUAL，第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，2003中。PCR-引物对可通过已知技术，例如使用打算用于该目的的计算机程序员(例如，Primer，第0.5版，1991，Whitehead Institute for Biomedical Research，Cambridge，Mass)从已知序列获得。用于化学合成核酸的方法论述于例如Beaucage和Caruthers，Tetra.Letts.22：1859-1862(1981)以及Matteucci和Caruthers，J.Am.Chem.Soc.103：3185(1981)中。

限制酶消化、磷酸化、连接和转化是如Sambrook等人，MOLECULARCLONING：A LABORATORY MANUAL，2nd ed.(1989)，Cold Spring HarborLaboratory Press中所描述的进行。除非另外指明，否则所有用于细菌细胞的生长和维持的试剂和材料均从Aldrich Chemicals(Milwaukee，Wis.)、DIFCO Laboratories(Detroit，Mich.)、Invitrogen(Gaithersburg，Md.)或Sigma Chemical公司(St.Louis，Mo.)获得。

术语“编码(encoding和coding)”是指基因通过转录和翻译机制向细胞提供可将一系列氨基酸装配成特定氨基酸序列以产生活性酶的信息的过程。由于遗传密码的简并性，因此核酸序列的某些碱基变化不会改变蛋白质的氨基酸序列。因此，应理解，本公开涵盖任何核酸序列中的修饰，使得所述修饰不会改变或影响所编码蛋白质的功能。

在本说明书中，“表达”表示产生由基因编码的蛋白质产物。“过表达”是指转基因生物体中基因产物的产生超过正常或未经改造的生物体中的产生水平。“阻抑”或“沉默”意味着相对于正常、对照、未经改造的生物体消除或减少由基因编码的蛋白质产物的产生。

“人工miRNA”或“amiRNA”是指长度通常为约19到25个核苷酸的小寡核糖核酸，其并非天然存在并且阻抑包含靶序列转录物的多核苷酸的表达或下调靶RNA。

单不饱和脂肪酸包括但不限于油酸(18：1，顺式-9-十八碳烯酸)、巨头鲸鱼酸(20：1，顺式-11-二十碳烯酸)和芥酸(22：1，顺式-13-二十二碳烯酸)

多不饱和脂肪酸包括但不限于亚油酸(18：2，顺式，顺式-9，12-十八碳二烯酸)和α亚麻酸(18：3，全顺式-9，12，15-十八碳三烯酸)。

高油酸亚麻荠油是指具有至少约50％到90％油酸的亚麻荠油。例如，高油酸亚麻荠油可具有约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％油酸。

高巨头鲸鱼酸亚麻荠油是指具有至少约20％到40％巨头鲸鱼酸的亚麻荠油。例如，高巨头鲸鱼酸亚麻荠油可具有约20％、25％、30％、35％或40％巨头鲸鱼酸。

高蓖麻油酸油是指具有至少约15％到30％蓖麻油酸(12-羟基-9-顺式-十八碳烯酸)的亚麻荠油。例如，高蓖麻油酸亚麻荠油可具有约15％、20％、25％或30％蓖麻油酸。

如本文所用的，densipolic acid是指12-羟基-9，15-顺式-十八碳二烯酸。在一些实施方案中，例如，可通过单独阻抑FAD3来降低12-羟基-顺式-9，15-十八碳二烯酸。

A.影响亚麻荠油脂肪酸分布的序列

本发明人鉴别了三种不同的基因，即脂肪酸去饱和酶2(FAD2)、脂肪酸去饱和酶3(FAD3)和脂肪酸延长酶1(FAE1)，并且确定了每一种在调控亚麻荠油的脂肪酸分布中的作用。例如，本发明人确定，仅使FAD2沉默产生高油酸亚麻荠油，而使FAD2和FAD3一起沉默降低PUFA并且随后增加亚麻荠油中的油酸和巨头鲸鱼酸。

为了本公开的目的并且非限制性的，将实例性FAD2序列陈述于SEQID NO：A、B和C中的任一个中，每一个陈述了已公开的基因组序列的ORF。同样，将示例性FAE1序列陈述于SEQ ID NO.E、F和G中，每一个陈述了已公开的基因组序列的ORF。这些序列是示例性的，因为在异源六倍体亚麻荠基因组中存在三(3)个拷贝的FAD2基因(表示为FAD2-1、FAD2-2和FAD2-3)(Kang，2011)和FAE1基因(指定为FAE1-A、FAE1-B和FAE1-C)(Kang，2011；Hutcheon，2010)，所述基因彼此具有大约92％一致性。FAD3迄今未知，是由本发明人分离的，并且叙述于SEQ ID NO：D中

当然，本公开涵盖包含SEQ ID NO：A-G和1-153中任一个的变体的核酸分子，所述核酸分子缺失、取代、插入或添加了一个或多个碱基，所述变体编码活性类似于由SEQ ID NO：A-G和1-153编码的多肽的多肽。因此，即使在编码的氨基酸序列取代、缺失、插入或添加了一个或多个氨基酸时，具有“缺失、取代、插入或添加了一个或多个碱基的碱基序列”的序列仍然保持生理活性。例如，可缺失聚A尾或5′或3′端非翻译区，并且碱基可缺失到缺失氨基酸的程度。碱基还可以被取代，只要没有移码即可。碱基还可以被“添加”到添加氨基酸的程度。然而至关重要的是，任何所述修饰都不导致如通常由SEQ ID NO：A-G和1-153所编码的活性的损失。在这一背景下，修饰的核酸可通过例如位点特异性诱变对本发明的核苷酸碱基序列进行修饰来获得，使得特异性位点处的氨基酸被取代、缺失、插入或添加。Zoller和Smith，Nucleic Acid Res.10：6487-6500(1982)。

例如并且如本文所公开的，SEQ ID NO：1-4和76-79是pLAT14的克隆，每个克隆均为FAE1基因。类似地，SEQ ID NO：50-58是pLAT 12的克隆，每个克隆均为FAD2基因。同样，SEQ ID NO：60-75是pLAT13的克隆，每个克隆均为FAD3基因。

如本文所用的，在两个核酸或多肽序列的背景下，“序列一致性”或“一致性”包括对当针对指定区域内的最大对应进行比对时两个序列中相同残基的指代。当关于蛋白质使用序列一致性百分比时，应认识到，不相同的残基位置的区别经常在于保守氨基酸取代，其中氨基酸残基被取代为具有类似化学性质(例如电荷或疏水性)的其它氨基酸残基，因此不改变分子的功能性质。如果序列在保守取代方面不同，则可上调序列一致性百分比以校正所述取代的保守性质。区别在于所述保守取代的序列被认为具有“序列相似性”或“相似性”。进行这种调节的手段为本领域技术人员所熟知。通常这涉及将保守取代作为一部分而非完全错配进行记分，由此增强序列一致性百分比。因此，例如，如果对相同氨基酸给予1的分值并且对非保守取代给予0的分值，则对保守取代给予0与1之间的分值。例如，根据Meyers和Miller(Computer Applic.Biol.Sci.，4：11-17(1988))的算法来计算保守取代的记分，例如如在程序PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，CA，USA)中所执行的。

如本文所用的，“序列一致性百分比”意指通过在比较窗口内比较两个最佳比对序列所确定的值，其中所述比较窗口中的多核苷酸序列部分相比于用于两个序列的最佳比对的参考序列(其不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即，空位)。所述百分比是通过以下方式计算的：确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数量以获得匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较窗口中的位置的总数并将所述结果乘以100以获得序列一致性百分比。

比对用于比较的序列的方法为本领域所熟知。最佳的比对用于比较的序列可通过以下方式进行：Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.2：482(1981))的局部同源性算法；Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48：443(1970))的同源性比对算法；Pearson和Lipman(Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444(1988))的相似性搜索方法；这些算法的计算机执行，包括但不限于：PC/Gene程序(Intelligenetics，Mountain View，Calif.)中的CLUSTAL；Wisconsin Genetics Software Package(Genetics Computer Group(GCG)，575Science Dr.，Madison，Wis.，USA)中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA；以下文献对CLUSTAL程序进行了充分地描述：Higgins和Sharp，Gene 73：237-244(1988))；Higgins和Sharp，CABIOS 5：151-153(1989)；Corpet等人，Nucleic Acids Research 16：10881-90(1988)；Huang等人，Computer Applications in the Biosciences 8：155-65(1992)和Pearson等人，Methods in Molecular Biology 24：307-331(1994)。

可用于数据库相似性搜索的BLAST程序家族包括：BLASTN，针对核苷酸数据库序列的核苷酸查询序列；BLASTX，针对蛋白质数据库序列的核苷酸查询序列；BLASTP，针对蛋白质数据库序列的蛋白质查询序列；TBLASTN，针对核苷酸数据库序列的蛋白质查询序列；和TBLASTX，针对核苷酸数据库序列的核苷酸查询序列。参见CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，第19章，Ausubel等人编辑，Greene Publishingand Wiley-Interscience，New York(1995)；Altschul等人，J.Mol.Biol，215：403-410(1990)；和Altschul等人，Nucleic Acids Res.25：3389-3402(1997)。

用于进行BLAST分析的软件可例如通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。这种算法涉及首先通过鉴别查询序列中长度为W的短字来鉴别高记分序列对(HSP)，所述短字在与数据库序列中相同长度的字比对时匹配或满足一些正值阈值记分T。T称为邻近字记分阈值。这些初始邻近字命中(hit)充当种子(seed)用于起始搜索发现含有它们的更长HSP。然后，所述字命中沿着每个序列在两个方向上延伸，直到可增加积累比对分值。对于核苷酸序列来说，使用参数M(成对匹配残基的奖励分值；总是＞0)和N(错配残基的罚分值；总是＜0)来计算积累分值。对于氨基酸序列来说，使用记分矩阵来计算积累分值。

当积累比对分值从最大实现值回落数量X；积累分值由于一个或多个负分值残基比对积累而达到零或低于零；或达到两个序列中任一个的终点时，每个方向的字命中延伸停止。BLAST算法的参数W、T和X决定了比对的敏感性和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列来说)使用字长(W)11、期望值(E)10、截止值100、M＝5、N＝-4和两个链的比较作为缺省值。对于氨基酸序列来说，BLASTP程序使用字长(W)3、期望值(E)10和BLOSUM62记分矩阵作为缺省值(参见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.89.10915)。

除了计算序列一致性百分比外，BLAST算法还进行两个序列间相似性的统计学分析(参见例如arlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.90：5873-5877(1993))。通过BLAST算法提供的一种相似性量度是最小和概率(P(N))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列间偶然出现匹配的概率的指示。

BLAST搜索假定可将蛋白质建模为随机序列。然而，许多实际蛋白质包含非随机序列区域，所述非随机序列可为同聚束(homopolymeric tract)、短周期重复序列(short-period repeat)或富含一个或多个氨基酸的区域。可对无关蛋白质间的这类低复杂性区域进行比对，即使所述蛋白质的其他区域完全不同。可采用许多低复杂性过滤程序(filter program)来减少这类低复杂性比对。例如，可单独或组合采用SEG(Wooten和Federhen，Comput.Chem.，17：149-163(1993))和XNU(Claverie和States，Comput.Chem.，17：191-201(1993))低复杂性过滤程序。

可使用CLUSTAL比对方法(Higgins和Sharp(1989)CABIOS.5：151-153)利用缺省参数(空位罚分＝10，空位长度罚分＝10)进行序列的多重比对。使用CLUSTAL方法进行配对比对的缺省参数是KTUPLE 1、空位罚分＝3、WINDOWS＝5和DIAGONALS SAVED＝5。

影响脂肪酸合成和/或油分布的序列可使用本领域已知方法从头开始合成。例如，FAD序列可从适当碱基从头开始合成，例如，通过使用本文所公开的适当蛋白质序列作为指导来产生虽然不同于天然核酸序列但导致具有相同或类似氨基酸序列的蛋白质的核酸分子。当向植物中引入编码异源蛋白质的核酸序列时，可使用这一类型的合成核酸分子，所述核酸分子反映了不同密码子使用频率并且如果在未经修饰的情况下使用，则可导致宿主植物的低效率翻译。

B.阻抑基因表达

在鉴别FAD2、FAD3和FAE1的作用时，申请人确定阻抑FAD2、FAD3和/或FAE1赋予了亚麻荠油中改良的脂肪酸油分布。虽然可使用任何方法来阻抑参与脂肪酸合成的核酸序列，但本公开涵盖反义、有义共阻抑、RNAi、人工微小RNA(amiRNA)、病毒诱导的基因沉默(VIGS)、反义、有义共抑制和靶向诱变方法。

RNAi技术涉及使用RNAi质粒构建体的稳定转化(Helliwell和Waterhouse，Methods Enzymol.392：24-35(2005))。所述质粒由将在反向重复结构中沉默的靶基因的片段构成。反向重复序列由通常为内含子的间隔子隔开。由合适的启动子(例如，花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子)驱动的RNAi构建体整合到植物基因组中并且随后转基因的转录导致本身回折而形成双链发夹RNA的RNA分子。这一双链RNA结构被植物识别并切割成称为小干扰RNA(siRNA)的小RNA(长约21个核苷酸)。siRNA与蛋白质复合体(RISC)缔合，所述蛋白质复合体接着引导靶基因的mRNA的降解。

人工微小RNA(amiRNA)技术利用功能在于使植物和其它真核生物中的内源基因沉默的微小RNA(miRNA)途径(Schwab等人，Plant Cell 18：1121-33(2006)；Alvarez等人，Plant Cell 18：1134-51(2006))。在这一方法中，将待沉默基因的长21个核苷酸的片段引入到前体-miRNA基因中以形成前体-amiRNA构建体。使用本领域技术人员明了的转化方法将前体-miRNA构建体转移到植物基因组中。在前体-amiRNA转录后，加工获得靶向与21个核苷酸的amiRNA序列有核苷酸一致性的基因的amiRNA。

在RNAi沉默技术中，两种因素可影响片段长度的选择。片段越短，达成有效沉默的频率将越低，但很长的发夹增加了细菌宿主菌株中重组的机率。沉默的有效性似乎还依赖于基因且可反映靶mRNA的可及性或在该基因活跃的细胞中靶mRNA和hpRNA的相对丰度。100bp与800bp之间、优选300bp与600bp之间的片段长度通常适合使所获得的沉默频率最大化。另一考虑是待靶向的基因部分。可使用5′UTR、编码区和3′UTR片段，具有同样良好的结果。由沉默机制取决于序列同源性，因此存在相关mRNA序列交叉沉默的可能性。如果不想这样，则应当选择与其它序列具有低序列相似性的区域，例如5′或3′UTR。避免交叉同源性沉默的规则似乎是使用在构建体与非靶基因序列之间不具有超过20个碱基的序列一致性区块(block)的序列。这些相同原理中的许多适用于选择用于设计amiRNA的靶区。

病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术是RNAi技术的变化形式，其利用了植物的内源性抗病毒防御。含有宿主DNA片段的重组VIGS病毒感染植物导致靶基因的转录后基因沉默。在一个实施方案中，可使用基于烟草脆裂病毒(TRV)的VIGS系统。基于烟草脆裂病毒的VIGS系统描述于例如以下文献中：Baulcombe，Curr.Opin.Plant Biol.2：109-113(1999)；Lu等人，Methods 30：296-303(2003)；Ratcliff等人，The Plant Journal 25：237-245(2001)和美国专利号7,229,829。

反义技术涉及向植物中引入将与目标基因产生的信使RNA(mRNA)结合的反义寡核苷酸。“反义”寡核苷酸的碱基序列与所述基因的称为“有义”序列的信使RNA(mRNA)互补。mRNA的有义区段的活性被反义mRNA区段阻断，由此使基因表达有效地失活。在植物中应用反义引起基因沉默更详细地描述于Stam等人，Plant J.21：27-42(2000)中。

有义共阻抑技术涉及向植物中引入高度表达的有义转基因，从而导致转基因与内源基因两者的表达降低(Depicker和van Montagu，Curr.Opin.Cell Biol.9：373-82(1997))。所述效果取决于转基因与内源基因之间的序列一致性。

可使用靶向诱变技术(例如TILLING(靶向基因组中诱导的局部损害(Targeting Induced Local Lesions IN Genomes))和使用快中子轰击“使基因缺失”)来敲除植物中的基因功能(Henikoff等人，Plant Physiol.135：630-6(2004)；Li等人，Plant J.27：235-242(2001))。TILLING涉及利用诱变剂处理种子或单个细胞以引起点突变，然后使用用于单核苷酸突变检测的灵敏方法在目标基因中发现所述点突变。可例如通过PCR方法实现所需突变(例如导致目标基因产物失活的突变)的检测。例如，可制备衍生自目标基因的寡核苷酸引物并且可使用PCR从诱变群体中的植物扩增目标基因的区域。可将扩增的突变基因与野生型基因退火以发现突变基因与野生型基因之间的错配。检测的差异可回溯到具有突变基因的植物，由此揭示哪些诱变的植物将具有所需表达(例如目标基因的沉默)。然后可对这些植物进行选择性地繁殖以产生具有所需表达的群体。TILLING可提供包括错义和敲除突变在内的等位基因系列，所述突变展示靶向基因的降低表达。TILLING被视为不涉及转基因引入的可能的基因敲除方法，因此可更为消费者所接受。快中子轰击诱导植物基因组中也可以类似于TILLING的方式使用PCR检测到的突变，即缺失。

无论所用方法如何，如本文所用的“阻抑”或“沉默”或“抑制”可互换地使用，表示靶序列产物的表达相对于其在野生型生物体中的正常表达水平下调。阻抑包括相对于野生型表达水平降低了约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的表达。

C.核酸构建体

本公开包含可使用核酸构建体来阻抑FAD2、FAD3和/或FAE1中的至少一个，并将所述构建体引入到植物或细胞中。因此，所述核酸构建体可用于阻抑植物或细胞中FAD2、FAD3和/或FAE1中的至少一个。

重组核酸构建体可使用标准技术制得。例如，转录用核酸序列可通过利用限制酶处理含有所述序列的载体以切下适当区段来获得。转录用核酸序列还可通过将合成寡核苷酸退火并连接或通过在聚合酶链式反应(PCR)中使用合成寡核苷酸以于每个末端得到合适的限制位点来生成。然后将所述核酸序列克隆到含有合适的调控元件(例如上游启动子和下游终止子序列)的载体中。

示例性启动子包括组成型启动子，例如香石竹蚀环病毒(CERV)、花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、双增强性花椰菜花叶病毒启动子(包含两个串联的CaMV 35S启动子)(称为“双35S”启动子)。在某些情况下可能需要组织特异性启动子、组织偏好性(tissue-preferred)启动子、细胞型特异性启动子和诱导型启动子。例如，组织特异性启动子允许某些组织中的过表达或阻抑而不影响其它组织中的表达。在一个实施方案中，本公开涵盖种子特异性启动子，例如来自大豆的β伴大豆球蛋白启动子。

构建体还可含有位于核酸分子下游的终止序列，以终止mRNA的转录，并且添加了多聚A序列。所述终止子的示例包括根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂碱合酶终止子(Tnos)、根癌农杆菌甘露碱合酶终止子(Tmas)和CaMV 35S终止子(T35S)。在一个实施方案中，本公开涵盖菜豆球蛋白终止子。表达载体还可含有增强子、起始密码子、剪接信号序列和靶向序列。

构建体还可包含可在培养物中鉴别遗传改造的细胞的选择标记。所述标记可与异源核酸分子(即可操作地连接到启动子的基因)缔合。例如并且非限制性的，选择标记DsRed可由木薯叶脉花叶病毒启动子驱动。如本文所用的，术语“标记”是指编码性状或表型的基因，所述性状或表型允许选择或筛选含有所述标记的植物或细胞。例如，在植物中，标记基因可编码抗生素或除草剂抗性。这允许从未转化或未转染的细胞中选择转化的细胞。

合适的选择标记的示例包括腺苷脱氨酶、二氢叶酸还原酶、潮霉素(hygromycin)-B-磷酸转移酶、胸苷激酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸-核糖基转移酶、草甘膦和草丁膦(glufosinate)抗性和氨基-糖苷3′-O-磷酸转移酶(卡那霉素(kanamycin)、新霉素(neomycin)和G418抗性)。这些标记可包括对G418、潮霉素、博来霉素(bleomycin)、卡那霉素和庆大霉素(gentamicin)的抗性。所述构建体还可含有选择标记基因bar，所述选择标记基因赋予对除草剂膦丝菌素(phosphinothricin)类似物(如草铵膦(ammonium gluphosinate))的抗性。Thompson等人，EMBO J.9：2519-23(1987)。在一个实施方案中，选择标记包含由木薯叶脉花叶病毒启动子驱动的DsRed(ClontechLaboratories公司，2005)。其它合适的选择标记也是已知的。

可使用可见标记，例如绿色荧光蛋白(GFP)。基于对细胞分裂的控制来鉴别或选择转化的植物的方法也已有描述。参见例如WO 2000/052168和WO 2001/059086。

还可包括细菌或病毒来源的复制序列，以允许在细菌或噬菌体宿主中克隆载体。优选地，使用宽宿主范围的原核复制起点。可包括用于细菌的选择标记，以允许选择带有所需构建体的细菌细胞。合适的原核选择标记还包括对抗生素(例如卡那霉素或四环素)的抗性。

如本领域已知的，编码额外功能的其它核酸序列也可存在于载体中。例如，当农杆菌属(Agrobacterium)是宿主时，可包括T-DNA序列以促进后续转移和并入到植物染色体中。

可通过经由农杆菌属转化到宿主植物中并筛选改良的脂肪酸分布来合适地筛选所述基因构建体的活性。

合适地，可从Genbank^TM核苷酸数据库中提取所述基因的核苷酸序列并且对不切割其的限制酶进行搜索。可通过常规方法将这些限制位点添加到所述基因上，例如在PCR引物中并入这些位点或通过亚克隆进行。

优选地，构建体包含于载体内，所述载体最合适地为适于在适当宿主(植物)细胞中表达的表达载体。能够产生包含引入的DNA序列的植物的任何载体都将满足需要。

合适的载体为本领域技术人员所熟知并且概括地描述于例如以下的技术参考文献中：Pouwels等人，Cloning Vectors.A Laboratory Manual，Elsevier，Amsterdam(1986)。特别合适的载体包括Ti质粒载体。

D.遗传改造用植物

本公开包含对植物、尤其是亚麻荠的遗传操作，以阻抑FAD2、FAD3和/或FAE1。所得亚麻荠油具有改良的脂肪酸分布。

在本说明书中，“植物”表示可遗传操作的含纤维素的任何植物材料，包括但不限于分化的或未分化的植物细胞、原生质体、整个植物、植物组织或植物器官或植物的任何组份，例如叶、茎、根、芽、块茎、果实、根茎等等。

在这一背景下也包括其它产油植物。示例性作物包括但不限于棉花、大豆、亚麻、玉米、油菜子、橄榄、椰子、向日葵、红花、棕榈、花生、蓖麻子、芝麻、各种坚果和柑橘。

在本说明书中，“转基因植物”是指已并入核酸序列的植物，所述核酸序列包括但不限于通常并不存在于宿主植物基因组中的基因、通常并不转录成RNA或翻译成蛋白质(“表达的”)的核酸序列或希望引入非转化植物中的任何其它基因或核酸序列，例如通常可存在于非转化植物中但希望进行遗传改造或具有改变表达的基因。“转基因植物”类别包括初级转化体和例如通过标准基因渗入的方式或另一育种程序在谱系包括转化体的植物。

预期在一些情况下，本发明转基因植物的基因组已通过转基因的稳定引入被增大。然而，在其它情况下，引入的基因将替代内源序列。

E.遗传改造

可使用任何合适的遗传改造技术将示例性构建体和载体引入宿主细胞中。单子叶和双子叶的被子植物或裸子植物的植物细胞均可以本领域已知的各种方式进行遗传改造。例如，参见Klein等人，Biotechnology 4：583-590(1993)；Bechtold等人，C.R.Acad.Sci.Paris 316：1194-1199(1993)；Bent等人，Mol Genet.204：383-396(1986)；Paszowski等人，EMBO J.3：2717-2722(1984)；Sagi等人，Plant Cell Rep.13：262-266(1994)；和Clough，S.J.和Bent，A Plant Journal，16(6)：735-743(1998)。

例如并且决不是限制性的，对于植物转化，可使用农杆菌属种，例如根癌农杆菌和毛根农杆菌(A.rhizogenes)。参见例如Nagel等人，MicrobiolLett 67：325(1990)。简单地说，可利用植物表达载体通过例如电穿孔来转化农杆菌属，此后通过例如熟知的叶盘法将农杆菌属引入植物细胞中。用于实现这一目的的额外方法包括但不限于电穿孔、粒子枪轰击、磷酸钙沉淀、花浸(floral dip)和聚乙二醇融合、转移到发芽花粉粒中、直接转化(Lorz等人，Mol.Genet.199：179-182(1985))和本领域内已知的其它方法。如果采用选择标记，例如卡那霉素抗性，则其使得更容易确定哪些细胞已被成功地转化。

已知上文所论述的农杆菌属转化方法可用于转化双子叶植物。另外，de la Pena等人，Nature 325：274-276(1987)；Rhodes等人，Science240：204-207(1988)和Shimamato等人，Nature 328：274-276(1989)(这些文献全部以引用方式并入)已使用农杆菌属转化了谷类单子叶植物。还参见Bechtold等人，C.R.Acad.Sci.Paris 316(1994)，其显示了真空渗入用于农杆菌属介导的转化的用途。

可测量蛋白质、多肽或核酸分子在特定细胞中的存在以确定例如细胞是否已被成功地转化或转染。实施所述测定的能力为本领域所熟知，此处不再赘述。

F.分析亚麻荠油

本发明的转基因植物的特征在于种子油中的改良的脂肪酸分布。在一些情况下并且取决于受到阻抑的靶基因，可增加单不饱和脂肪酸，同时降低多不饱和脂肪酸。

例如并且决不是限制性的，改良遗传改造的植物的种子油中的三酰基甘油的脂肪酸分布可通过增加或降低种子中脂肪酸合成途径的活性来实现，其中油沉积天然存在于亚麻荠中。

在描述示例性亚麻荠植物或提取的亚麻荠油时，“增加的单不饱和脂肪酸”是指在与野生型植物和/或种子油中的单不饱和脂肪酸的量比较时，所述植物和/或种子油中的单不饱和脂肪酸的量的定量增大。单不饱和脂肪酸的定量增加可通过若干方法来测定，如例如通过气相色谱定量脂肪酸甲酯(GC-FAMES)来测定。Kunst等人Plant Physiol.Biochem.30：425-434(1992)。

类似地，示例性亚麻荠植物或提取的亚麻荠种子油可具有“降低的多不饱和脂肪酸”，这是指在与野生型植物和/或种子油中的多不饱和脂肪酸的量比较时，所述植物和/或种子油中的多不饱和脂肪酸的量的定量降低。多不饱和脂肪酸的定量降低可通过若干方法来测定，如例如通过气相色谱定量脂肪酸甲酯(GC-FAMES)来测定。Kunst等人(1992)。

可将本发明植物/油中的单不饱和脂肪酸增加到总种子油的约80％的水平。例如，使用本方法和构建体，将油酸增加到约60％，并且将巨头鲸鱼酸增加到约20％。

同样，可将多不饱和脂肪酸降低到小于总种子油的10％的水平。

下文呈现用于获得可改良亚麻荠油的脂肪酸分布的序列的方法以及用于在植物中引入所述序列以产生生产具有改良的脂肪酸分布的油的植物转化体的方法和组合物的具体示例。例如，并且如下文和本申请通篇中所述，申请人引入基于内源FAD2、FAD3和FAE1序列的amiRNA序列。实施例是说明性的而非限制性的。

实施例1.脂肪酸去饱和酶(FAD2和FAD3)和脂肪酸延长酶(FAE1)的分离

A.FAD2、FAD3和FAE1序列的分离

从来自如先前所述的亚麻荠品系CN101980(Meisel等人，2005)的绿黄色种子荚混合物分离RNA并且将其再悬浮于100μL DEPC处理的水中。为了去除任何污染性基因组DNA，将RNA与350μL RLT裂解缓冲液、250μL 96％乙醇混合并且根据制造商方案(Qiagen，Hilden)在Qiagen Rneasy小型柱上利用DNAse I进行处理。根据制造商方案使用Superscript II第一链cDNA试剂盒(Invitrogen，Carlsbad)从这一RNA制得cDNA。设计用于扩增FAD2、FAD3和FAE1基因的PCR引物并且将其提供于下表1中。

表1.用于扩增FAD2、FAD3和FAE1基因的PCR引物.

将所得PCR产物克隆到pCR8/GW/TOPO(Invitrogen，Carlsbad)中并且将来自每个基因至少16个单个大肠杆菌(Escherichia coli)克隆的质粒送去测序。使用Clustal W2分析对序列进行比对并且将这些比对发送到DuPond以用于amiRNA设计。

B.基因表达分析

从种子荚发育的5个可见阶段分离RNA：1)花、2)绿色荚、3)绿黄色荚、4)黄色荚和5)如上文所述的干燥荚。从同时生长的三株亚麻荠植物混合样品或从单个T₂植物获得试样。如上文所述移除可能的污染性基因组DNA并且同样合成cDNA。

使用BLAST搜索测序的随机亚麻荠EST库以发现对应于以下来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的基因的假定参考基因序列：ACT2(GenBankU41998)、ACT7(U27811)、GAPC1(NM_111283)、TUB9(M84706)、UBI4(U33014)和UBI10(NM_178970)。

使用Pimer3(http：//frodo.wi.mit.edu/primer3/Rozen及Skaletsky，2000)设计用于基因表达分析的引物并且将其提供于下表2中。

表2.用于扩增假定表达参考基因区的PCR引物.

在分离的亚麻荠基因组DNA和cDNA上测试引物并且所有对均产生单一产物。

有趣的是，使用基因组DNA，Csgapcl和Cstub9引物产生大于预测的产物，可能因为它们跨越内含子，这可用于确定是否存在任何污染性基因组DNA。

根据制造商说明书在Rotor-Gene Q机上使用Rotor-Gene SYBR GreenReal Time PCR试剂盒(Qiagen，Hilden)测试候选参考基因。所用模板是来自种子荚发育的5个可见阶段的cDNA样品并且使用geNorm v3.5(Vandesompele等人，2002)比较每个基因的结果以发现最稳定的表达水平。发现在所有5个发育阶段内均具有最稳定表达的基因是Csgapcl和Csubi4。

使用Primer3(http：//frodo.wi.mit.edu/primer3/Rozen和Skaletsky，2000)设计用于亚麻荠FAD2、FAD3和FAE1基因的基因表达分析的引物并且将其提供于下表3中。

表3.用于扩增FAD2、FAD3和/或FAE1基因区的PCR引物

在分离的亚麻荠基因组DNA和cDNA上测试引物并且所有对均产生单一产物。有趣的是，FAD3引物产生大于预测的产物，可能因为它们跨越内含子，这可用于确定是否存在任何污染性基因组DNA。

根据制造商说明书在Rotor-Gene Q机上使用Rotor-Gene SYBR GreenReal Time PCR试剂盒(Qiagen，Hilden)测量种子荚发育的5个可见阶段中的基因表达。每个反应均以一式两份实施作为技术重复并且对重复间的结果取平均值。在PCR实施后利用熔化曲线分析基因表达反应并且所有反应均得到指示没有污染的单峰熔化曲线。使用Livak相对计算方法(Livak和Schmittgen，2001)相对于参考基因Csgapcl的表达水平来计算基因表达水平。

实施例2：amiRN构建体

通过人工微小RNA(amiRNA)进行靶向沉默的脂肪酸生物合成基因序列包括FAD2、FAD3和FAE1基因。将amiRNA设计成靶向拟南芥(Arabidopsis)和亚麻荠基因家族并且将相应的所靶向基因连同SEQ ID NO一起提供于表4中。

表4.靶向基因沉默的拟南芥和亚麻荠脂肪酸生物合成基因

(1)人工微小RNA的设计

主要根据Schwab R等人(2005)Dev.Cell.8：517-27中所述的规则来设计将具有使所需靶基因沉默的能力的人工微小RNA(amiRNA)。总之，微小RNA序列的长度为21个核苷酸，于其5′-端以“U”开始，相对于其通过于19位包括C或G所实现的星序列(star sequence)展示5′不稳定性，并且其第10个核苷酸为“A”或“U”。对人工微小RNA设计的额外要求是amiRNA具有高度自由的δ-G，如使用ZipFold算法所计算的(Markham，N.R.和Zuker，M.，2005，NucleicAcids Res.33：W577-W581.)。

(2)人工星序列的设计

“星序列”是前体RNA中与amiRNA序列碱基配对以形成不完全的茎结构的序列。为了形成完全茎结构，星序列将为amiRNA的准确反向互补。使用mfold(M.Zuker(2003)Nucleic Acids Res.31：3406-15；和D.H.Mathews，J.等人(1999)J.Mol.Biol.288：911-940)使如“Novel andnodulation-regulated microRNAs in soybea n roots”Subramanian S，Fu Y，Sunkar R，Barbazuk WB，Zhu J，Yu O BMC Genomics.9：160(2008)中所述且于mirBase(Dezulian T，Palatnik JF，Huson DH，Weigel D(2005)GenomeBiology 6：P13)获得的大豆前体序列折叠。

然后用amiRNA序列替代miRNA序列并且用amiRNA的准确反向互补替代内源星序列。引入人工星序列的变化，使得茎结构将保持与内源结构相同。然后利用mfold使改变的序列折叠并且通过肉眼比较原始结构和改变的结构。如果需要，引入对人工星序列的进一步改变以维持原始结构。

使用上述准则针对表4中列出的拟南芥和亚麻荠序列设计amiRNA和与amiRNA配对的相应星序列并且将其列于表5中。

表5.靶向拟南芥和亚麻荠脂肪酸生物合成序列的amiRNA和相应星序列

(3)基因组微小RNA前体向人工微小RNA前体的转换

可使用重叠PCR将基因组miRNA前体基因(“主链”)(例如US2009/0155909A1(WO 2009/079548)和US20090155910A1(WO2009/079532)中针对大豆基因组miRNA前体159(SEQ ID NO：152)或396b(SEQ ID NO：153)所述的那些)转换成amiRNA，并且可对所得DNA进行完全测序且然后克隆于能够转化的载体中的适当启动子下游。

或者，amiRNA可由例如Codon Devices(Cambridge，MA)、DNA 2.0(Menlo Park，CA)或Genescript(Piscataway，NJ)商业合成。然后将合成的DNA克隆于能够进行大豆转化的载体中的适当启动子下游。人工miRNA还可使用In-Fusion^TM技术(Clontech，Mountain View，CA)构建。

(4)In-Fusion^TM即用型(ready)表达载体的生成

如US 2009/0155910A1中所述，使用重叠PCR将大豆基因组miRNA前体基因转换成amiRNA前体159-fad2-1b和396b-fad2-1b并且将所得前体amiRNA单个地克隆于质粒PHP27253(还称为质粒KS332，描述于美国专利申请号60/939,872中)中的β伴大豆球蛋白启动子下游，以分别形成表达构建体PHP32511和PHP32510。

改变微小RNA GM-159和GM-396b前体以包括直接侧接星序列和微小RNA序列的Pme I位点以形成In-Fusion^TM即用型微小RNA前体。将这些序列克隆到KS332的Not I位点中以形成In-Fusion^TM即用型微小RNAGM-159-S332和GM-396b-KS332质粒(分别为SEQ ID NO：104和105)。为了移除DSred盒，利用BamHI来消化GM-396b-KS332(SEQ ID NO：105)并且再次连接含有GM-396b前体的片段以产生pKR2007(SEQ ID NO：106)。

利用HindIII消化质粒GM-159-S332(SEQ ID NO：104)并且将含有GM-159前体的片段克隆到含有载体主链DNA的pKR2007(SEQ ID NO：106)的HindIII片段中，以产生pKR2009(SEQ ID NO：107)。

在所有这些表达载体中，表达盒(β伴大豆球蛋白启动子：In-Fusion^TM即用型微小RNA前体：菜豆球蛋白终止子)侧接有AscI位点。

(5)生成amiRNA前体以使拟南芥和亚麻荠脂肪酸生物合成基因沉默

当合成GM-159主链中的amiRNA前体时，使用微小RNAGM-159前体(实施例1)作为PCR模板。针对每个将使用5′和3′寡核苷酸引物扩增的amiRNA/星序列设计寡核苷酸对，所述寡核苷酸引物于寡核苷酸的3′端与GM-159前体区相同且于寡核苷酸的5′端含有目标21bp amiRNA或星序列(如表5中所列出)和与pKR2009(SEQ ID NO：107)的Pme I位点的任一侧同源的区。根据Clontech提供的方案设计寡核苷酸引物并且在In-Fusion^TM重组反应后不会留下Pme I位点的任何足印(footprint)。

使用类似方法来设计用于GM-396b主链中的amiRNA前体的寡核苷酸，不同之处是使用微小RNA GM-396b作为PCR模板并且寡核苷酸的5′区与pKR2007(SEQ ID NO：106)的Pme I位点的任一侧同源。

使用提供有In-Fusion^TM试剂盒的制造商方案将对应于每个引物组的扩增的DNA重组到的pKR2007或pKR2009中，所述载体已预先用Pme I消化以使载体线性化。以这种方式，产生用于表5中所列出的每个amiRNA/星序列的表达载体。

然后用AscI消化这些质粒并且将含有amiRNA表达盒的片段亚克隆到KS 102(描述于WO 02/00904中)或pNEB193(New England Biolabs)的AscI位点中。所得含有适于使fad2、fad3和fae1基因沉默的amiRNA-396b或amiRNA-159前体的质粒的序列SEQ ID NO列于表6中。

表6(a).用于靶向沉默的拟南芥和亚麻荠脂肪酸生物合成基因序列的amiRNA表达构建体

表6(b).用于转化的亚麻荠品系的amiRNA表达构建体

表6(b)提供了示例性构建体和相应的转化的亚麻荠品系。将来自进入载体的Asc I片段连接到含有选择标记DsRed(Clontech Laboratories，I.2005)的二元载体中。AmiRNA盒1-24由来自大豆的单个β伴大豆球蛋白启动子驱动。盒25-28包括用于串联FAD2/FAD3amiRNA的β伴大豆球蛋白启动子和用于FAE1 amiRNA的gy1启动子。二元载体指定a)取向与选择标记相同的表达盒、b)取向相对于选择标记相反的表达盒。

实施例3：亚麻荠转化

A.植物材料

从加拿大农业和农产品萨斯卡通研究工作站(Saskatoon ResearchStation，Agriculture and Agri-Food Canada)获得亚麻荠保藏号CN101980。使植物生长在具有16h光8h暗的光周期、20-60％(环境)湿度和利用高压钠灯增强的自然照明的22℃温室中。

B.根癌农杆菌菌株GV3101pMP90

通过热休克法将上文实施例2中所述的重组amiRNA载体引入根癌农杆菌菌株GV3101pMP90(Koncz和Schell，1986)中。在具有50mg/L卡那霉素和25mg/L庆大霉素(Gentamycin)的含有1.5％琼脂的Luria Broth上选择转化的菌落。

C.亚麻荠转化

使用拟南芥花浸法的改良形式(Clough，1998)进行亚麻荠转化。简单地说，将含有二元载体的根癌农杆菌的5mL培养物在Luria培养液中在28℃生长过夜。将5mL过夜培养物转移到含有500mL相同培养基的2L烧瓶中且在28℃、250rpm振荡培育器中生长16-20小时。通过以4000G离心10分钟来收获土壤杆菌细胞并且将细胞沉淀物悬浮于含有0.1％v/v SilwetL77(Lehle Seeds，Round Rock，TX，USA)的2L 5％蔗糖中。

使亚麻荠植物在上述生长条件下在Sunshine Professional Mix中以每6英寸罐3到4粒种子生长。在开花期早期，将亚麻荠植物的花部浸入上述土壤杆菌溶液中。不需要真空渗入。将处理过的植物侧放在吸收纸上并且用吸收纸和塑料覆盖过夜。在早上，移去植物的覆盖物并使其直立。为了增加转化频率，一周后重复所述过程。然后使T0植物成熟并且收获T1种子。

D.筛选亚麻荠T1种子

在收获后，通过在具有556nm激发和586发射的荧光下照射种子使用Leica 10446246滤光片在立体显微镜上检测DsRed-阳性T1种子。使植物自授精并且生长到成熟。从单个植物收获T2种子用于脂肪酸分析。

实施例4：转基因亚麻荠植物的分子分析

如实施例上文2中所述，使DsRed-阳性种子发芽并且通过PCR在标准Taq DNA聚合酶条件(Qiagen)下使用对β伴大豆球蛋白启动子序列具有特异性的引物来确认所得T1植物。具体地，设计正向引物和反向引物以扩增所有本发明构建体所共有的β伴大豆球蛋白启动子内的473bp区。

正向引物：TCGTATTCTCTTCCGCCACCTCAT

反向引物：CCATAAGCCGTCACGATTCAGATG

选择对β伴大豆球蛋白启动子序列为阳性的T2品系。

进一步通过DNA印迹(Southern blot)分析对所选T2品系进行表征。简单地说，使用Dellaporta玉米DNA提取法(Coldspring Harbour LaboratoryManual，1984)的改良形式从嫩叶中提取基因组DNA。利用Pst1将5微克基因组DNA消化16小时，然后在0.8％琼脂糖凝胶上于1％TAE缓冲液中在40伏下电泳6小时。通过向下毛细管印迹利用0.5M NaOH和1.5M NaCl将DNA转移到Amersham Hybond N+上。DNA探针是通过如上文所述的PCR扩增制得的β伴大豆球蛋白启动子。

实施例5：脂肪酸甲酯气相色谱(GC-FAMES)

为了确定种子总脂肪酸组成，将从各单个T1亚麻荠植物收集的20-30粒种子的混合物置于具有2mL 1M于甲醇中的HCl(Supelco)和0.5mL己烷的Pyrex螺口管中。将管盖紧并且在80℃加热6-16h。冷却后，添加2mL0.9％NaCl和1mL己烷，并且通过收集己烷相来回收脂肪酸甲酯(FAMES)。使用装配有DB-23毛细管柱(0.25mm 30m，0.25μM厚度；J&W，Folsom，CA，USA)的Agilent 6890N GC进行FAMES气相色谱，如先前所述(Kunst，1992)。

实施例6：亚麻荠种子中的FAD2基因的amiRNA沉默

对于每个FAD2 amiRNA构建体来说，使至少20株T1植物生长到成熟并且收获种子。如下表7中所示，FAD2B-159amiRN构建体产生FAD2基因的最佳沉默，导致混合的T2代种子中亚麻荠种子油的亚油酸的9倍降低和α-亚麻酸的6倍降低，并且使得油酸含量能够增加4倍。数据代表来自每个构建体的最佳T2品系的20-30粒混合的种子。

表7.FAD2敲除品系中的亚麻荠种子油的脂肪酸组成

有趣的是，在FAD2沉默品系中，20：1也增加了高达1.5倍。最佳品系的单种子GC-FAMES显示了在多拷贝品系中高达63％和在单拷贝品系中一致高达61％的油酸水平。使单插入品系生长用于进一步研究并且在T3代中获得纯合植物，如通过DsRed表达、DNA印迹和qPCR所确定。

另外，在FAD2-amiRNA转基因种子中产生18：2-9，15。这种脂肪酸通常并不存在于野生型亚麻荠中，而较早发现于用FAD3转化的拟南芥中(Puttick等人，2009)。

下表8显示来自FAD2B-159amiRNA T2品系Du3-27的23粒单种子的GC-FAMES数据，确认分离有5粒无效的并且18粒种子显示57％与61％之间的相对18：1含量和相应降低的18：2和18：3。

表8.FAD2B-159 amiRNA品系Du03-27单种子的脂肪酸组成

实施例7：亚麻荠种子中的FAD3基因的amiRNA敲除

对于每个FAD3 amiRNA构建体来说，使至少20株T1植物生长到成熟并且收获种子。下表9显示FAD3敲除品系中的亚麻荠种子油的脂肪酸分布。如下文所示，使FAD3沉默导致18：2的显著增强和18：3的降低。

表9.FAD3敲除品系中的亚麻荠种子油的脂肪酸组成

实施例8：亚麻荠种子中的FAE1基因的amiRNA敲除

对于每个FAE1 amiRNA构建体来说，使至少20株T1植物生长到成熟并且收获种子。下表10显示FAE1敲除品系中的亚麻荠种子油的脂肪酸分布。如下所示，使FAE1沉默增加了18：1-9(油酸)并且降低了20：0和20：1-11(巨头鲸鱼酸)。

表10.FAE1敲除品系中的亚麻荠种子油的脂肪酸组成

实施例9：阻抑亚麻荠种子中的FAD2、FAD3和FAE1基因的堆叠的表达构建体的设计

使用本领域内所熟知的方法制得堆叠的FAD2/FAD3和FAD2/FAD3/FAE1 amiRN构建体。

例如，使用本领域技术人员所熟悉的克隆方法(例如PCR、限制酶消化等)，将表6中所示的靶向fad2或fad3的单个amiRNA前体一起组合到单个转录单元中，使得两种amiRNA前体一起在单个β伴大豆球蛋白启动子下游表达。在一些情况下，还将靶向FAE1的第三种amiRNA前体与fad2和fad3 amiRNA前体组合以生成靶向所有三种基因的三重amiRNA单元。在每种情况下，包括β伴大豆球蛋白启动子、多重amiRNA和菜豆球蛋白转录终止子的完整盒均侧接有AscI位点以使得能够克隆到其它表达载体中。

如表6中所示，amiRNA前体159-fad2a(SEQ ID NO：136)、159-fad2b(SEQ ID NO：137)、159-Fad2c(SEQ ID NO：138)、159-fad3a(SEQ ID NO：142)、159-fad3b(SEQ ID NO：143)、159-faeIa(SEQ ID NO：146)、159-faeIb(SEQID NO：147)和159-faeIc(SEQ ID NO：148)的长度为958个nt并且基本上类似于SEQ ID NO：152中所述的脱氧核糖核苷酸序列，其中SEQ ID NO：152的核苷酸276到296分别被fad2a amiRNA(SEQ ID NO：80)、fad2b amiRNA(SEQ ID NO：83)、fad2c amiRNA(SEQ ID NO：86)、fad3a amiRNA(SEQ IDNO：89)、fad3b amiRNA(SEQ ID NO：92)、FAE1a amiRNA(SEQ ID NO：95)、FAE1b amiRNA(SEQ ID NO：98)或FAE1c amiRNA(SEQ ID NO：101)替代。SEQ ID NO：152的核苷酸121到141分别被159-fad2a星序列(SEQ IDNO：81)、159-fad2b星序列(SEQ ID NO：84)、159-fad2c星序列(SEQ ID NO：87)、159-fad3a星序列(SEQ ID NO：90)、159-FAD3B星序列(S EQ ID NO：93)、159-fae 1a星序列(SEQ ID NO：96)、159-fae 1b星序列(SEQ ID NO：99)或159-fae 1c星序列(SEQ ID NO：102)替代。

从表6，amiRNA前体396b-fad2a(SEQ ID NO：139)、396b-fad2b(SEQID NO：140)、396b-fad2c(SEQ ID NO：141)、396b-fad3a(SEQ ID NO：144)、396b-fad2b(SEQ ID NO：145)、396b-fae1a(SEQ ID NO：149)、396b-fae1b(SEQ ID NO：150)和396b-fae1c(SEQ ID NO：151)的长度为574个nt并且基本上类似于SEQ ID NO：153中所述的脱氧核糖核苷酸序列，其中SEQ IDNO：153的核苷酸196到216分别被fad2a amiRNA(SEQ ID NO：80)、fad2bamiRNA(SEQ ID NO：83)、fad2c amiRNA(SEQ ID NO：86)、fad3a amiRNA(SEQ ID NO：89)、fad3b amiRNA(SEQ ID NO：92)、fae1a amiRNA(SEQ IDNO：95)、fae1b amiRNA(SEQ ID NO：98)或fae1c amiRNA(SEQ ID NO：101)替代且其中SEQ ID NO：153的核苷酸262到282分别被396b-fad2a星序列(SEQ ID NO：82)、396b-fad2b星序列(SEQ ID NO：85)、396b-fad2c星序列(SEQ ID NO：88)、396b-fad3a星序列(SEQ ID NO：91)、396b-fad3b星序列(SEQ ID NO：94)、396b-fae1a星序列(SEQ ID NO：97)、396b-fae1b星序列(SEQ ID NO：100)或396b-fae1c星序列(SEQ ID NO：103)替代。

所实现的示例性amiRNA组合和相应的载体序列描述于表11中。

表11.用于靶向沉默亚麻荠脂肪酸生物合成基因序列的前体amiRNA组合和amiRNA表达载体

如上表11中所示，将amiRNA前体159-fad2a(SEQ ID NO：136)和396b-fad3b(SEQ ID NO：143)组合到一个转录单位中的amiRNA前体159-fad2a/396b-fad3b(SEQ ID NO：154)的长度为1556个nt并且基本上类似于SEQ ID NO：152中所述的脱氧核糖核苷酸序列(159-fad2a/396b-fad3b的nt 16到974)，其中SEQ ID NO：152的核苷酸276到296被159-fad2aamiRNA(SEQ ID NO：80)替代且其中SEQ ID NO：152的核苷酸121到141被159-fad2a amiRNA星序列(SEQ ID NO：81)替代。amiRNA前体159-fad2a/396b-fad3b(SEQ ID NO：154)也基本上类似于SEQ ID NO：153中所述的脱氧核糖核苷酸序列(159-fad2a/396b-fad3b的nt 982到1555)，其中SEQ ID NO：153的核苷酸196到216被396b-fad3b amiRNA(SEQ ID NO：92)替代且其中SEQ ID NO：153的核苷酸262到282被396b-fad3b amiRNA星序列(SEQ ID NO：94)替代。

从表11，将amiRNA前体159-fad2b(SEQ ID NO：137)和396b-fad3b(SEQ ID NO：143)组合到一个转录单位中的amiRNA前体159-fad2b/396b-fad3b(SEQ ID NO：156)的长度为1556个nt并且基本上类似于SEQ ID NO：152中所述的脱氧核糖核苷酸序列(159-fad2b/396b-fad3b的nt 16到974)，其中SEQ ID NO：152的核苷酸276到296被159-fad2bamiRNA(SEQ ID NO：83)替代且其中SEQ ID NO：152的核苷酸121到141被159-fad2b amiRNA星序列(SEQ ID NO：84)替代。amiRNA前体159-fad2b/396b-fad3b(SEQ ID NO：156)也基本上类似于SEQ ID NO：153中所述的脱氧核糖核苷酸序列(159-fad2b/396b-fad3b的nt 982到1555)，其中SEQ ID NO：153的核苷酸196到216被396b-fad3b amiRNA(SEQ ID NO：92)替代且其中SEQ ID NO：153的核苷酸262到282被396b-fad3b amiRNA星序列(SEQ ID NO：94)替代。

将amiRNA前体396b-fad3b(SEQ ID NO：143)和159-fad2a(SEQ IDNO：136)组合到一个转录单位中的amiRNA前体396b-fad3b/159-fad2a(SEQ ID NO：158)的长度为1556个nt长度并且基本上类似于序列SEQ IDNO：153中所述的脱氧核糖核苷酸(396b-fad3b/159-fad2a的nt 7到581)，其中SEQ ID NO：153的核苷酸196到216被396b-fad3b amiRNA(SEQ IDNO：92)替代且其中SEQ ID NO：153的核苷酸262到282被396b-fad3bamiRNA星序列(SEQ ID NO：94)替代。amiRNA前体396b-fad3b/159-fad2a(SEQ ID NO：158)也基本上类似于SEQ ID NO：152中所述的脱氧核糖核苷酸序列(396b-fad3b/159-fad2a的nt 588到1546)，其中SEQ ID NO：152的核苷酸276到296被159-fad2a amiRNA(SEQ ID NO：80)替代且其中SEQ IDNO：152的核苷酸121到141被159-fad2a amiRNA星序列(SEQ ID NO：81)替代。

将amiRNA前体396b-fad3b(SEQ ID NO：143)和159-fad2b(SEQ IDNO：137)组合到一个转录单位中的amiRNA前体396b-fad3b/159-fad2b(SEQ ID NO：160)的长度为1556个nt并且基本上类似于SEQ ID NO：153中所述的脱氧核糖核苷酸序列(396b-fad3b/159-fad2b的nt 7到581)，其中SEQ ID NO：153的核苷酸196到216被396b-fad3b amiRNA(SEQ ID NO：92)替代且其中SEQ ID NO：153的核苷酸262到282被396b-fad3b amiRNA星序列(SEQ ID NO：94)替代。amiRNA前体396b-fad3b/159-fad2b(SEQ IDNO：160)也基本上类似于SEQ ID NO：152中所述的脱氧核糖核苷酸序列(396b-fad3b/159-fad2b的nt 588到1546)，其中SEQ ID NO：152的核苷酸276到296被159-fad2b amiRNA(SEQ ID NO：83)替代且其中SEQ IDNO：152的核苷酸121到141被159-fad2b amiRNA星序列(SEQ ID NO：84)替代。

将amiRNA前体159-fad2a(SEQ ID NO：136)、396b-fad3b(SEQ ID NO：143)和159-fae1a(SEQ ID NO：146)组合到一个转录单位中的amiRNA前体159-fad2a/396b-fad3b/159-Fae1a(SEQ ID NO：162)的长度为2530nt并且基本上类似于SEQ ID NO：152中所述的脱氧核糖核苷酸序列(159-fad2a/396b-fad3b/159-fae1a的nt 25到983)，其中SEQ ID NO：152的核苷酸276到296被159-fad2a amiRNA(SEQ ID NO：80)替代且其中SEQ IDNO：152的核苷酸121到141被159-fad2a amiRNA星序列(SEQ ID NO：81)替代。amiRNA前体159-fad2a/396b-fad3b/159-fae 1a(SEQ ID NO：162)也基本上类似于SEQ ID NO：153中所述的脱氧核糖核苷酸序列(159-fad2a/396b-fad3b/159-fae 1a的nt 991到1564)，其中SEQ ID NO：153的核苷酸196到216被396b-fad3b amiRNA(SEQ ID NO：92)替代且其中SEQ ID NO：153的核苷酸262到282被396b-fad3b amiRNA星序列(SEQ IDNO：94)替代。amiRNA前体159-fad2a/396b-fad3b/159-fae 1a(SEQ IDNO：162)也基本上类似于SEQ ID NO：152中所述的脱氧核糖核苷酸序列(159-fad2a/396b-fad3b/159-fae 1a的nt 1571到2529)，其中SEQ ID NO：152的核苷酸276到296被159-fae 1a amiRNA(SEQ ID NO：95)替代且其中SEQ ID NO：152的核苷酸121到141被159-fae 1a amiRNA星序列(SEQ IDNO：96)替代。

将amiRNA前体396b-fad3b(SEQ ID NO：143)、159-fad2a(SEQ ID NO：136)和159-fae1a(SEQ ID NO：146)组合到一个转录单位中的amiRNA前体396b-fad3b/159-fad2a/159-fae1a(SEQ ID NO：164)的长度为2530个nt并且基本上类似于SEQ ID NO：153中所述的脱氧核糖核苷酸序列(396b-fad3b/159-fad2a/159-fae1a的nt 16到590)，其中SEQ ID NO：153的核苷酸196到216被396b-fad3b amiRNA(SEQ ID NO：92)替代且其中SEQID NO：153的核苷酸262到282被396b-fad3b amiRNA星序列(SEQ ID NO：94)替代。amiRNA前体396b-fad3b/159-fad2a/159-fae1a(SEQ ID NO：164)也基本上类似于SEQ ID NO：152中所述的脱氧核糖核苷酸序列(396b-fad3b/159-fad2a/159-fae 1a的nt 597到1555)，其中SEQ ID NO：152的核苷酸276到296被159-fad2a amiRNA(SEQ ID NO：80)替代且其中SEQID NO：152的核苷酸121到141被159-fad2a amiRNA星序列(SEQ ID NO：81)替代。AmiRNA前体396b-fad3b/159-fad2a/159-fae 1a(SEQ ID NO：164)也基本上类似于SEQ ID NO：152中所述的脱氧核糖核苷酸序列(396b-fad3b/159-fad2a/159-fae 1a的nt 1571到2529)，其中SEQ ID NO：152的核苷酸276到296被159-fae 1a amiRNA(SEQ ID NO：95)替代且其中SEQ ID NO：152的核苷酸121到141被159-fae 1a amiRNA星序列(SEQ IDNO：96)替代。

从表11，将amiRNA前体159-fad2b(SEQ ID NO：137)、396b-fad3b(SEQ ID NO：143)和159-fae 1a(SEQ ID NO：146)组合到一个转录单位中的amiRNA前体159-fad2b/396b-fad3b/159-fae1a(SEQ ID NO：166)的长度为2530个nt并且基本上类似于SEQ ID NO：152中所述的脱氧核糖核苷酸序列(159-fad2b/396b-fad3b/159-fae 1a的nt 25到983)，其中SEQ ID NO：152的核苷酸276到296被159-fad2b amiRNA(SEQ ID NO：83)替代且其中SEQID NO：152的核苷酸121到141被159-fad2a amiRNA星序列(SEQ ID NO：84)替代。amiRNA前体159-fad2b/396b-fad3b/159-fae 1a(SEQ ID NO：166)也基本上类似于SEQ ID NO：153中所述的脱氧核糖核苷酸序列(159-fad2b/396b-fad3b/159-fae 1a的nt 991到1564)，其中SEQ ID NO：153的核苷酸196到216被396b-fad3b amiRNA(SEQ ID NO：92)替代且其中SEQ ID NO：153的核苷酸262到282被396b-fad3b amiRNA星序列(SEQ IDNO：94)替代。AmiRNA前体159-fad2b/396b-fad3b/159-fae 1a(SEQ IDNO：166)也基本上类似于SEQ ID NO：152中所述的脱氧核糖核苷酸序列(159-fad2b/396b-fad3b/159-fae 1a的nt 1571到2529)，其中SEQ ID NO：152的核苷酸276到296被159-fae 1a amiRNA(SEQ ID NO：95)替代且其中SEQ ID NO：152的核苷酸121到141被159-fae 1a amiRNA星序列(SEQ IDNO：96)替代。

将amiRNA前体396b-fad3b(SEQ ID NO：143)、159-fad2b(SEQ IDNO：137)和159-fae1a(SEQ ID NO：146)组合到一个转录单位中的amiRNA前体396b-fad3b/159-fad2b/159-fae 1a(SEQ ID NO：168)的长度为2530个nt并且基本上类似于SEQ ID NO：153中所述的脱氧核糖核苷酸序列(396b-fad3b/159-fad2b/159-fae 1a的nt 16到590)，其中SEQ ID NO：153的核苷酸196到216被396b-fad3b amiRNA(SEQ ID NO：92)替代且其中SEQID NO：153的核苷酸262到282被396b-fad3b amiRNA星序列(SEQ ID NO：94)替代。AmiRNA前体396b-fad3b/159-fad2b/159-fae 1a(SEQ ID NO：168)也基本上类似于SEQ ID NO：152中所述的脱氧核糖核苷酸序列(396b-fad3b/159-fad2b/159-fae 1a的nt 597到1555)，其中SEQ ID NO：152的核苷酸276到296被159-fad2b amiRNA(SEQ ID NO：83)替代且其中SEQID NO：152的核苷酸121到141被159-fad2b amiRNA星序列(SEQ ID NO：84)替代。AmiRNA前体396b-fad3b/159-fad2b/159-fae 1a(SEQ ID NO：168)也基本上类似于SEQ ID NO：152中所述的脱氧核糖核苷酸序列(396b-fad3b/159-fad2b/159-fae 1a的nt 1571到2529)，其中SEQ ID NO：152的核苷酸276到296被159-fae 1a amiRNA(SEQ ID NO：95)替代且其中SEQ ID NO：152的核苷酸121到141被159-fae1a amiRNA星序列(SEQ IDNO：96)替代。

除靶向fad2和fad3的双重amiRNA前体和靶向fad2、fad3和fae1的三重amiRNA前体外，还制得了以下构建体，其中将靶向fad2和fad3的双重amiRNA前体置于β伴大豆球蛋白启动子下游并且将靶向fae 1的第二amiRNA前体置于单独盒中大豆球蛋白Gyl启动子下游(Nielsen，NC等人(1989)PlantCell1：313-328)。所实现的示例性amiRNA组合和相应的载体序列描述于表12中。

表12.用于靶向沉默亚麻荠脂肪酸生物合成基因序列的前体amiRNA组合和amiRNA表达载体

实施例10：亚麻荠种子中的FAD2、FAD3和FAE1基因的amiRNA敲除

对于每个堆叠的FAD2/FAD3和FAD2/FAD3/FAE1 amiRNA构建体来说，如上文实施例9中所公开的，使至少20株T1植物生长到成熟并且收获种子。下表13和表14显示堆叠的敲除品系中的亚麻荠种子油的脂肪酸分布。在最佳品系中，使FAD2、FAD3和FAE1沉默使种子油中18：1-9(油酸)增加到大于6倍并且使PUFA(亚油酸、亚麻酸)降低到总脂肪酸的小于10％，并且使其它MUFA(巨头鲸鱼酸和芥酸)降低到总脂肪酸的小于4％。

表13.由大豆启动子β伴大豆球蛋白驱动的堆叠的FAD2、FAD3和FAE1 amiRNA串联的敲除品系中亚麻荠种子油的脂肪酸组成.

表14.由大豆启动子β伴大豆球蛋白驱动的堆叠的FAD2和FAD3amiRNA串联和在大豆Gyl启动子下的FAE1 amiRNA的敲除品系中亚麻荠种子油的脂肪酸组成.

Claims

1.一种用于改良亚麻荠(Camelina sativa)中的脂肪酸分布的方法，其包括相对于对照亚麻荠植物阻抑FAD2和FAD3的表达。

2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括阻抑FAE1的表达。

3.一种用于改良亚麻荠中的脂肪酸分布的方法，其包括相对于对照亚麻荠植物阻抑FAD3的表达。

4.一种转基因亚麻荠植物，其相对于对照亚麻荠植物具有受到阻抑的FAD2。

5.一种转基因亚麻荠植物，其相对于对照亚麻荠植物具有受到阻抑的FAD3。

6.一种从根据权利要求4或5所述的植物提取的亚麻荠油。

7.一种转基因亚麻荠植物，其相对于对照亚麻荠植物具有受到阻抑的FAD2和FAD3。

8.一种从根据权利要求7所述的植物提取的亚麻荠油。

9.一种转基因亚麻荠植物，其相对于对照亚麻荠植物具有受到阻抑的FAD2、FAD3和FAE1。

10.一种分离的核酸分子，其包含FAD3。

11.一种构建体，其包含阻抑FAD3的核酸序列。

12.一种植物细胞，其包含根据权利要求1所述的构建体。

13.一种构建体，其包含SEQ ID NO：80、83、86(FAD2)中所述的amiRNA。

14.一种构建体，其包含SEQ ID NO：89、92、95(FAD3)中所述的amiRNA。

15.一种构建体，其包含SEQ ID NO：98、101(FAE1)中所述的amiRNA。

16.一种用于产生高油酸亚麻荠油的方法，其包括：

(a)阻抑亚麻荠中的FAD2、FAD3和FAE1，由此生成转基因亚麻荠，和

(b)从所述转基因亚麻荠种子中提取油，其中所述油是高油酸的。

17.一种用于降低亚麻荠油中的多不饱和脂肪酸的方法，其包括

(a)阻抑亚麻荠中的FAD2和FAD3，由此生成转基因亚麻荠，和

(b)从所述转基因亚麻荠种子中提取油，其中所述油具有相对于来自非转基因植物的油降低的多不饱和脂肪酸水平。

18.一种高油酸亚麻荠油，其中所述油包含至少60％油酸(占总脂肪酸的％)。

19.一种低亚麻酸(18：3Δ9，12，15)亚麻荠油，其中所述油包含不超过10％的亚麻酸(占总脂肪酸的％)。

20.一种用于降低亚麻荠中的亚麻酸(18：3Δ9，12，15)的方法，其包括相对于对照亚麻荠植物阻抑FAD3。

21.一种用于在亚麻荠中增加蓖麻油酸并降低12-羟基-顺式-9，15-十八碳二烯酸的方法，其包括相对于表达油酸羟化酶的对照亚麻荠植物阻抑FAD2和FAD3。

22.一种亚麻荠油，其具有高的油酸、巨头鲸鱼酸和芥酸和降低的多不饱和脂肪酸。

23.根据权利要求22所述的亚麻荠油，其中所述油是从阻抑FAD2和FAD3的植物中提取的。

24.一种转基因植物，其包含SEQ ID NO：80、83和86(FAD2)中所述的FAD2 amiRNA。

25.一种转基因植物，其包含SEQ ID NO：89、92和95(FAD3)中所述的FAD3 amiRNA。

26.一种转基因植物，其包含SEQ ID NO：98、101(FAE1)中所述的FAE1 amiRNA。

27.一种使用amiRNA改良亚麻荠油分布的方法。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述amiRNA为SEQ IDNO：1(FAD2)、SEQ ID NO：2(FAD3)和/或SEQ ID NO：3(FAE1)所述。

29.一种从根据权利要求9所述的植物提取的亚麻荠油。

30.一种用于降低亚麻荠中的12-羟基-顺式-9，15-十八碳二烯酸的方法，其包括相对于表达油酸羟化酶的对照亚麻荠植物阻抑FAD3。

31.一种用于改良亚麻荠中的脂肪酸分布的方法，其包括相对于对照亚麻荠植物阻抑FAD2和FAE1的表达。

32.一种用于改良亚麻荠中的脂肪酸分布的方法，其包括相对于对照亚麻荠植物阻抑FAD3和FAE1的表达。