CN104593322A - 水牛卵母细胞玻璃化冷冻后孤雌激活方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水牛卵母细胞玻璃化冷冻后孤雌激活方法，该法采用优化的离子霉素联合6-DMAP的激活处理方式，改良优化了已有水牛卵母细胞玻璃化冷冻后孤雌激活方法。实验证明，孤雌激活条件对冷冻复苏水牛卵母细胞的发育潜能存在一定影响。应用本发明专门针对冷冻复苏后的卵母细胞的孤雌激活方法，可提高其激活率，进而提高冻融后卵母细胞的存活率和发育潜能。

Description

水牛卵母细胞玻璃化冷冻后孤雌激活方法

技术领域

本发明属于哺乳动物繁殖领域，尤其涉及一种水牛卵母细胞玻璃化冷冻后孤雌激活方法。

背景技术

水牛是联合国粮农组织认为最具开发潜力和开发价值的家畜之一。通过玻璃化冷冻的方法将其具有遗传价值的卵子进行保存，可提高水牛卵子的使用价值。目前，水牛卵母细胞的玻璃化冷冻进程仍十分缓慢，很多研究者把玻璃化冷冻的优化都集中在冷冻程序上，而忽略了激活条件是否也存在问题。玻璃化冷冻除了冻融后超微结构的改变等因素外，激活条件也是一个重要的因素。

卵母细胞激活是家畜显微受精和细胞核移植的关键技术环节，经孤雌生殖而产生的单倍体和纯合双倍体细胞系在各种遗传学中都具有重要的价值，可用于间接评估研究胚胎发育初始机制。随着这些研究的不断深入，利用孤雌激活得到的囊胚内细胞团建立胚胎干细胞系，挖掘优良的遗传资源，有助于阐明孤雌生殖与有性生殖的内在联系与差异。孤雌生殖技术也是衡量体外培养卵母细胞成熟的方法，尤其对评价动物卵母细胞玻璃化冷冻后发育潜能的高低至关重要。Lan(文献1)和Nasr-Esfahani(文献2)通过系统地分析不同的激活条件，表明离子霉素处理时间与浓度明显影响到卵母细胞的发育能力。同样，2010年，Nasr-Esfahani(文献3)也发现6-DMAP的处理会影响到纺锤体轴的旋转、原核的形成和胚胎的发育。离子霉素是通过引发Ca²⁺内流或钙库释放而达到卵母细胞的激活；6-DMAP则主要抑制成熟促进因子(Maturation or M-Phase Promoting Factor,MPF)和/或细胞静止因子(Cytostatie Factor,CSF)的活性和第二极体的排出，形成二倍体胚胎。2012年，Asgari(文献4)研究发现绵羊成熟卵母细胞经玻璃化冷冻后，细胞结构发生一系列变化，而这些变化在一定程度上具有轻微激活卵母细胞的特征，相比于新鲜卵母细胞的激活，其激活阈值相对较低。

目前，几乎所有冷冻复苏后的卵母细胞在进行这些操作时普遍采用与新鲜卵母细胞一样的激活程序。事实上，复苏的卵母细胞与新鲜的卵母细胞相比，在某些方面可能没有处于同样的水平，导致其孤雌激活条件与新鲜的卵母细胞有所不同，若采用与新鲜卵母细胞同等的激活条件，将降低冻融后卵母细胞的激活率，同时也会降低卵母细胞的后续发育能力。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种专门针对冷冻复苏后的卵母细胞可提高其激活率的水牛卵母细胞玻璃化冷冻后孤雌激活方法，进而提高冻融后卵母细胞的存活率和发育潜能。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：水牛卵母细胞玻璃化冷冻后孤雌激活方法，先将冻融恢复后的卵母细胞置于3.5μmol/L的离子霉素工作液激活处理5min，再移入2mmol/L的含6-DMAP的工作液培养2-4h。

上述水牛卵母细胞玻璃化冷冻后孤雌激活方法，先将冻融恢复后的卵母细胞置于3.5μmol/L的离子霉素工作液激活处理5min，再移入2mmol/L的含6-DMAP的工作液培养4h，然后经培养液洗涤3次移入颗粒细胞单层微滴于39℃，5％CO₂和最大饱和湿度的培养箱中共培养。

共培养过程中，每隔2天半量更换培养液，培养48h后检查分裂率，7-8天记录囊胚发育率。

目前水牛卵母细胞玻璃化冷冻后孤雌激活历经三步骤：卵母细胞的采集与成熟；对卵母细胞进行冷冻-解冻；将冻融后的卵母细胞进行激活。传统方法进行孤雌激活时，没有考虑到复苏的卵母细胞与新鲜的卵母细胞可能存在一定水平的不同，未对激活条件进行针对性研究，而往往直接采用与新鲜卵母细胞同等的激活条件，因而降低了冻融后卵母细胞的激活率，同时也会降低卵母细胞的后续发育能力。为此，发明人对现有技术进行了深入研究，深度优化了水牛卵母细胞玻璃化冷冻后孤雌激活方法，从而建立了本发明的方法。该法采用优化的离子霉素(ionomycin)联合6-DMAP(6－二甲基氨基嘌呤)的激活处理方式，改良了已有水牛卵母细胞玻璃化冷冻后孤雌激活方法。实验证明，孤雌激活条件对冷冻复苏水牛卵母细胞的发育潜能存在一定影响。应用本发明专门针对冷冻复苏后的卵母细胞的孤雌激活方法，可提高其激活率，进而提高冻融后卵母细胞的存活率和发育潜能。

附图说明

图1是研究和应用本发明水牛卵母细胞玻璃化冷冻后孤雌激活方法的流程图。

具体实施方式

一、试验材料

水牛卵巢由南宁屠宰场提供。试验所用的试剂除TCM-199购自Gibco公司外，其他试剂如无特殊说明均购自Sigma化学公司。主要仪器设备有体视显微镜、CO₂培养箱、4℃冰箱、液氮罐。

二、试验方法

(1)卵母细胞的收集与体外成熟

卵母细胞的收集与体外成熟的操作方法参考Zhuang(文献5)。从屠宰场获得卵巢后，剪去周边多余的组织，再用注射器抽取卵巢表面直径为2-6mm卵泡中的卵母细胞，在39℃，5％CO₂和最大饱和湿度的培养箱中进行体外成熟培养22-24h。成熟培养后，挑选排出第一极体、胞质均匀、饱满的成熟卵母细胞，进行后续实验。

(2)卵母细胞的冷冻

将步骤(1)成熟培养后的细胞，挑选排出第一极体、胞质均匀、饱满的成熟卵母细胞进行冷冻。玻璃化冷冻水牛卵母细胞的操作方法参考(文献6)。冷冻时将室温调至22-24℃。首先将成熟卵母细胞先移入含有20％FBS的冷冻基础液(TCM199-Hepes缓冲液)中5min，随后移入冷冻平衡液(TCM199-Hepes+20％FBS+10％二甲基亚砜+10％乙二醇)中1min，观察卵母细胞大体渗透充分后，移入冷冻液(TCM199-Hepes+20％FBS+20％二甲基亚砜+20％乙二醇+0.5M蔗糖)中，30s内转移到冷冻管内，迅速投入液氮。每次操作卵母细胞数为5个，所带液体体积<1μL。

(3)卵母细胞的解冻

步骤(2)的卵母细胞在液氮保存1-2d，随即解冻。将解冻液(TCM199-Hepes+20％FBS+0.5M蔗糖)提前2h于培养箱预热。解冻过程均在37℃的加热板上进行，将冷冻管从液氮中取出，将含有卵母细胞端的冷冻管迅速浸入解冻液中使卵母细胞排到解冻液。在解冻液平衡5min，将其移入含有20％FBS的冷冻基础液中5min，最后移入含有20％FBS的冷冻基础液，在39℃，5％CO₂和最大饱和湿度的培养箱中复苏1-1.5h后进行后续实验。

(4)孤雌激活

将步骤(3)冻融恢复后的卵母细胞按实验设计方案置于离子霉素工作液激活处理，再移入含6-DMAP的工作液培养，最后经培养液洗涤3次移入颗粒细胞单层微滴于39℃，5％CO₂和最大饱和湿度的培养箱中共培养，对照组直接进行常规激活(即5μmol/L离子霉素激活5min，结合2mmol/L 6-DMAP处理4h)。每隔2天半量更换培养液，培养48h后检查分裂率，7-8天记录囊胚发育率。

(5)实验设计

试验1离子霉素作用浓度对水牛卵母细胞玻璃化冷冻后孤雌激活效果的影响

将冻融恢复后的卵母细胞随机分为4组进行以下处理：

I组：5μmol/L 5min ionomycin+2mmol/L 4h 6－DMAP；

II组：3.5μmol/L 5min ionomycin+2mmol/L 4h 6－DMAP；

III组：2μmol/L 5min ionomycin+2mmol/L 4h 6－DMAP；

IV组：1μmol/L 5min ionomycin+2mmol/L 4h 6－DMAP；

对照组为新鲜的成熟卵母细胞。

最后移入制备好的颗粒细胞单层共培养，观察后续发育能力。

试验26-DMAP浓度和处理时间对水牛卵母细胞玻璃化冷冻后孤雌激活效果的影响

从试验1中选取离子霉素的最佳处理浓度进行试验2。将冻融恢复后的卵母细胞随机分为4组进行以下处理：

I组：ionomycin处理+2mmol/L 4h 6－DMAP；

II组：ionomycin处理+2mmol/L 2h 6－DMAP；

III组：ionomycin处理+1mmol/L 4h 6－DMAP；

IV组：ionomycin处理+1mmol/L 2h 6－DMAP；

对照组为新鲜的成熟卵母细胞。

激活后移入制备好的颗粒细胞单层共培养，观察后续发育能力。

三、试验结果

1.离子霉素作用浓度对水牛卵母细胞玻璃化冷冻后孤雌激活效果的影响

水牛成熟卵母细胞经玻璃化冷冻并解冻复苏，使用不同浓度的离子霉素进行孤雌激活，如表1所示，其卵裂率、4-细胞率、8细胞率和囊胚率比对照组均有所下降(P<0.01)。在四个处理组中，当离子霉素浓度为3.5μmol/L时，其卵裂率(57.0±1.1)％、8细胞率(31.1±2.1)％和囊胚率(11.2±0.9)％均显著高于其它处理组(除I组的4-细胞率外)

(P<0.05)。结果表明，水牛成熟卵母细胞玻璃化冷冻-解冻复苏后，使用3.5μmol/L的离子霉素激活5min，可提高卵母细胞冻融后孤雌激活率。

表1 不同浓度的离子霉素对水牛卵母细胞玻璃化冷冻后孤雌激活效果的影响

表1中，同列数值上标不同小写字母表示差异显著(p<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下表同。

2.6-DMAP浓度和处理时间对水牛卵母细胞玻璃化冷冻后孤雌激活效果的影响

首先，采用由试验1优化的离子霉素激活浓度3.5μmol/L激活5min，随后联合6-DMAP不同浓度和处理时间激活解冻复苏后的水牛成熟卵母细胞。由表2可知，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ与IV组卵母细胞解冻后孤雌激活的卵裂率、4-细胞率、8细胞率和囊胚率均显著低于对照组(p<0.01)。其中，II组的卵裂率显著高于其他三个处理组(p<0.05)，而II组的4-细胞率、8-细胞率和囊胚率均显著高于III组和IV组(p<0.05)，但与I组差异不显著(p>0.05)，然而仍存在着稍高于I组的趋势。结果表明，水牛成熟期卵母细胞玻璃化冷冻-解冻复苏后，使用3.5μmol/L的离子霉素激活5min，随后用2mmol/L 6-DMAP处理2h可提高卵母细胞冻融后孤雌激活的效果。

表2 6-DMAP浓度和处理时间对水牛卵母细胞玻璃化冷冻后孤雌激活效果的影响

四、结论

冷冻复苏后的卵母细胞在细胞和分子水平上承受各种损伤，包括皮质颗粒的过早释放导致透明带硬化，膜选择渗透性降低，大量胞浆细胞器破坏、微绒毛消失、减数分裂的纺锤体受干扰、线粒体变性、非整倍体的出现和核分裂，而这些损伤使得冷冻复苏的卵母细胞通过内质网钙库的释放以及胞外大量Ca²⁺的内流导致在一定程度上卵母细胞被激活。因此，有可能冷冻复苏的卵母细胞激活阈值较低，只需要低于新鲜卵母细胞所需要的Ca²⁺浓度即可被激活；另一方面，冷冻复苏的卵母细胞在离子霉素处理过长时间对于存活率以及后续发育能力都有不利的影响。

为此，发明人对水牛卵母细胞玻璃化冷冻后孤雌激活方法进行了优化，先进行体外成熟培养，然后进行玻璃化冷冻保存，最后对冻融后的卵母细胞进行孤雌激活。按照本发明的方法，采用3.5μmol/L的离子霉素激活5min联合2mmol/L 6-DMAP处理2h可达到最大激活率。研究显示，采用原有激活方法的激活率为46.7％，而使用本发明优化后的方法，其激活率则为60.6％。可见，本发明对水牛卵母细胞玻璃化冷冻后孤雌激活的效果显著，为全面了解影响水牛卵母细胞玻璃化冷冻的因素，从而构建完善的激活培养体系奠定了基础。同时，本发明分析复苏后卵母细胞的发育潜能与孤雌激活条件的关系，揭示孤雌激活条件与冷冻复苏卵母细胞间可能存在的关联，为研究玻璃化冷冻对水牛卵母细胞冷冻效果的影响提供技术支持及理论参考。

参考文献

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Claims (3)

1.一种水牛卵母细胞玻璃化冷冻后孤雌激活方法，其特征在于：先将冻融恢复后的卵母细胞置于3.5μmol/L的离子霉素工作液激活处理5min，再移入2mmol/L的含6-DMAP的工作液培养2-4h。

2.根据权利要求1所述的水牛卵母细胞玻璃化冷冻后孤雌激活方法，其特征在于：先将冻融恢复后的卵母细胞置于3.5μmol/L的离子霉素工作液激活处理5min，再移入2mmol/L的含6-DMAP的工作液培养4h，然后经培养液洗涤3次移入颗粒细胞单层微滴于39℃，5％CO2和最大饱和湿度的培养箱中共培养。

3.根据权利要求2所述的水牛卵母细胞玻璃化冷冻后孤雌激活方法，其特征在于共培养过程中，每隔2天半量更换培养液，培养48h后检查分裂率，7-8天记录囊胚发育率。