CN104593304A - 一种海洋氨氧化古菌的快速富集培养方法 - Google Patents

一种海洋氨氧化古菌的快速富集培养方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104593304A
CN104593304A CN201510029597.7A CN201510029597A CN104593304A CN 104593304 A CN104593304 A CN 104593304A CN 201510029597 A CN201510029597 A CN 201510029597A CN 104593304 A CN104593304 A CN 104593304A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ocean
ammonia oxidation
ancient bacterium
enrichment
ancient
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510029597.7A
Other languages
English (en)
Inventor
胡宝兰
刘帅
何崭飞
叶天强
田光明
徐新华
郑平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang University ZJU
Original Assignee
Zhejiang University ZJU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University ZJU filed Critical Zhejiang University ZJU
Priority to CN201510029597.7A priority Critical patent/CN104593304A/zh
Publication of CN104593304A publication Critical patent/CN104593304A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种海洋氨氧化古菌快速富集培养的方法，包括以下几个步骤：A：富集培养接种物来源的选择和前处理；B：海洋氨氧化古菌培养条件的确定，包括培养温度、氨氮浓度、pH、溶解氧浓度的确定；C：海洋氨氧化古菌富集培养基的配制，培养基中添加抗生素和微生物三羧酸循环的中间代谢产物。D：海洋氨氧化古菌的富集培养；E：海洋氨氧化古菌富集过程中的分子生物学检测。海洋氨氧化古菌的富集将为氨氧化古菌生理特性的研究奠定基础，同时，由于氨氧化古菌具有较宽的环境条件耐受范围，若将其引入废水生物脱氮中，可以带来巨大的经济和环境效益。

Description

一种海洋氨氧化古菌的快速富集培养方法
技术领域
本发明涉及一种海洋氨氧化古菌的快速富集培养方法。
背景技术
硝化-反硝化生物脱氮是废水脱氮最常用的技术之一，氨氧化过程是硝化过程的关键步骤和限速步骤。长期以来，氨氧化细菌被认为是氨氧化过程的主要承担者。2005年，氨氧化古菌的发现为自然界氨氧化乃至氮循环过程增添了新内容。近年来，一系列的生理学研究表明，氨氧化古菌对极端环境的适应性远胜于氨氧化细菌，这也使得氨氧化古菌在废水脱氮工艺中的应用有了巨大的前景和不容无视的优势。
氨氧化细菌是废水处理系统中常见的微生物，但因其生长缓慢、世代时间较长而难以进行大规模培养，而且氨氧化细菌受环境条件的影响较大。相比而言，氨氧化古菌具有较宽的环境条件耐受范围。氨氧化古菌对基质氨氮的亲和力远高于氨氧化细菌，其亲和力常数为0.13-2.0μM；实验室中培养的氨氧化细菌在pH值低于6.5时无法正常生长，而氨氧化古菌可以在pH值为4.5左右时进行氨的氧化；氨氧化细菌的最适生长温度为30-35oC，氨氧化古菌可以在2-80oC条件下正常生长；氨氧化古菌对氧气的亲和力比氨氧化细菌高10倍以上。上述特性使得氨氧化古菌在废水深度处理、酸性废水的生物脱氮、高温/低温废水生物脱氮以及低溶解氧废水的生物脱氮等方面具有不容忽视的优势。
氨氧化古菌广泛分布于各个生态系统中，包括海洋生态系统、淡水生态系统、农田生态系统、湿地生态系统等。氨氧化古菌在自然界中的数量巨大，其数量通常为氨氧化细菌数量的10-1000倍。在海洋环境中，氨氧化古菌可以占到微生物总数量的20%，所以选择海洋沉积物作为接种物为氨氧化古菌的快速富集培养奠定了基础。
传统的梯度稀释-平板划线法对海洋氨氧化古菌的富集培养并不适用。首先是因为海洋生境中细菌的数量多于古菌，利用传统方法进行富集，富集培养液中会存在大量的非目标菌；其次，氨氧化古菌伴生细菌生长的现象明显，原因是氨氧化古菌基因组中缺少三羧酸循环关键环节催化酶的编码基因，氨氧化古菌必须利用细菌三羧酸循环代谢产生的中间产物才能正常生长。因此在传统方法中，一旦氨氧化古菌的伴生菌死亡，氨氧化古菌就无法继续生长。
发明内容
本发明的目的是为了获得海洋氨氧化古菌的高富集培养物，从而提供了一种海洋氨氧化古菌的快速富集培养方法。
本发明的技术方案如下：
一种海洋氨氧化古菌的快速富集培养方法，所述方法包括下述步骤：
A：富集培养接种物来源的选择和前处理；
B：海洋氨氧化古菌培养条件的确定，包括培养温度、氨氮浓度、pH、溶解氧浓度的确定；
C：海洋氨氧化古菌富集培养基的配制，培养基中添加抗生素和微生物三羧酸循环的中间代谢产物；
D：海洋氨氧化古菌的富集培养；
E：海洋氨氧化古菌富集过程中的分子生物学检测。
优选的，所述步骤A中，选取不同海域的海底沉积物，通过氨氧化古菌功能基因的定量检测，确定用氨氧化古菌数量最多的沉积物样品作为海洋氨氧化古菌富集培养的接种物。
优选的，所述步骤A中，首先测定沉积物孔隙水的氨氮浓度、pH，然后将沉积物置于1L的烧杯中，加入一定量的海水，搅拌后静置沉淀，舍弃底部生物量较少的沙粒，抽取上部沉积物作为海洋氨氧化古菌富集培养的接种物。
优选的，所述步骤B中，海洋氨氧化古菌培养温度控制在沉积物样品采集海域的年平均温度15oC；培养基pH控制在7.5±0.1（与沉积物孔隙水平均pH接近）；富集培养基氯化铵浓度为0.25mM，与原位生境浓度接近；富集培养中溶解氧浓度控制在1.0-1.5mg/L，更加适合对氧气亲和力高的氨氧化古菌生长。
优选的，所述步骤C中，海洋氨氧化古菌富集培养基包括：沉积物样品采集海域海水、氯化铵（终浓度为0.25mM）、抗生素和三羧酸循环的中间代谢产物。
优选的，所述步骤C中，抗生素包括链霉素、庆大霉素、奇霉素、青霉素，培养基中四种抗生素浓度均为50mg/L。
优选的，所述步骤C中，三羧酸循环的代谢产物包括α-酮戊二酸、草酰乙酸、丙酮酸，三种中间产物的浓度均为100μM。
优选的，所述步骤C中，富集培养基的配制方法为：称取氯化铵0.014g、四种抗生素各0.05g、α-酮戊二酸0.015g、草酰乙酸0.013g、丙酮酸0.009g，溶于1L海水中，将pH调为7.5±0.1，配制完成后，使用0.22μm的滤膜进行过滤，防止非目标菌随培养基进入富集培养物中。
优选的，所述步骤D中，氨氧化古菌的富集培养在连续流反应器中进行，水力停留时间为48h。
优选的，所述步骤E中，氨氧化古菌富集培养的过程中，使用荧光定量PCR和荧光原位杂交对氨氧化古菌的富集程度进行实时监测。
本发明的有益效果：1）海洋氨氧化古菌富集培养物的获得将为海洋氨氧化古菌的生理特性研究奠定基础，同时为海洋氨氧化过程和氮循环的研究提供基础数据和理论支撑。2）氨氧化古菌对于环境条件的变化有很强的耐受性，其耐低氧的特性可以大大降低生物脱氮过程硝化段的运行成本，其对氨氮极高的亲和力可以为废水的深度处理提供保障和新思路。
附图说明
图1是海洋氨氧化古菌的快速富集培养方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图、附表及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
如图1所示，本发明的流程如下：
（1）选取舟山潮间带、舟山潮下带和东海大陆架沉积物三个取样点，通过氨氧化古菌功能基因的定量检测，确定用氨氧化古菌数量最多的东海大陆架沉积物作为海洋氨氧化古菌富集培养的接种物。
（2）首先测定大陆架沉积物孔隙水的氨氮浓度、pH，然后将沉积物置于1L的烧杯中，加入一定量的海水，搅拌后静置沉淀，舍弃底部生物量较少的沙粒，抽取上部沉积物作为海洋氨氧化古菌富集培养的接种物。
（3）海洋氨氧化古菌培养温度控制在东海大陆架海域45m水深的年平均温度15oC；培养基pH控制在7.5±0.1（与大陆架沉积物孔隙水平均pH接近）；富集培养基氯化铵浓度为0.25mM，与原位生境浓度接近；富集培养中溶解氧浓度控制在1.0-1.5mg/L，更加适合对氧气亲和力高的氨氧化古菌生长。
（4）海洋氨氧化古菌富集培养基包括：东海大陆架海域海水、氯化铵（终浓度为0.25mM）、抗生素和三羧酸循环的中间代谢产物。
（5）抗生素包括链霉素、庆大霉素、奇霉素、青霉素，培养基中四种抗生素浓度均为50mg/L。
（6）三羧酸循环的代谢产物包括α-酮戊二酸、草酰乙酸、丙酮酸，三种中间产物的浓度均为100μM。
（7）富集培养基的配制方法为：称取氯化铵0.014g、四种抗生素各0.05g、α-酮戊二酸0.015g、草酰乙酸0.013g、丙酮酸0.009g，溶于1L海水中，将pH调为7.5±0.1，配制完成后，使用0.22μm的滤膜进行过滤，防止非目标菌随培养基进入富集培养物中。
（8）氨氧化古菌的富集培养在连续流反应器中进行，水力停留时间为48h。
（9）氨氧化古菌富集培养的过程中，使用荧光定量PCR和荧光原位杂交对氨氧化古菌的富集程度进行实时监测，所用引物和探针如表1所示。
表1 氨氧化古菌和氨氧化细菌分子检测所用引物和探针
以上所述仅为本发明的较佳实施方案，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种海洋氨氧化古菌的快速富集培养方法，其特征在于，包含以下几个步骤：
A：富集培养接种物来源的选择和前处理；
B：海洋氨氧化古菌培养条件的确定，包括培养温度、氨氮浓度、pH、溶解氧浓度的确定；
C：海洋氨氧化古菌富集培养基的配制，培养基中添加抗生素和微生物三羧酸循环的中间代谢产物；
D：海洋氨氧化古菌的富集培养；
E：海洋氨氧化古菌富集过程中的分子生物学检测。
2.如权利要求1中所述的海洋氨氧化古菌的快速富集培养方法，其特征在于，所述步骤A中富集培养接种物来源的选择具体为：选取不同海域的海底沉积物，通过氨氧化古菌功能基因的定量检测测定海底沉积物中氨氧化古菌数量，使用氨氧化古菌数量最多的沉积物样品作为海洋氨氧化古菌富集培养的接种物。
3.如权利要求1中所述的海洋氨氧化古菌的快速富集培养方法，其特征在于，所述步骤A中富集培养接种物来源的为：首先测定沉积物样品孔隙水的氨氮浓度、pH，然后将沉积物置于1L的烧杯中，加入500-700mL的海水，搅拌后静置沉淀，舍弃底部生物量较少的沙粒，取上部沉积物作为海洋氨氧化古菌富集培养的接种物。
4.如权利要求1中所述的海洋氨氧化古菌的快速富集培养方法，其特征在于，所述步骤B具体为：海洋氨氧化古菌培养温度控制在15oC；培养基pH控制在7.5±0.1，与沉积物孔隙水平均pH接近；富集培养基氯化铵浓度为0.25mM，与原位生境浓度接近；富集培养中溶解氧浓度控制在1.0-1.5mg/L，更加适合对氧气亲和力高的氨氧化古菌生长。
5.如权利要求1中所述的海洋氨氧化古菌的快速富集培养方法，其特征在于，所述步骤C中海洋氨氧化古菌富集培养基包括：沉积物样品采集海域海水、氯化铵、抗生素和三羧酸循环的中间代谢产物。
6.如权利要求1或5中所述的海洋氨氧化古菌的快速富集培养方法，其特征在于，所述步骤C中的抗生素为链霉素、庆大霉素、奇霉素和青霉素，培养基中四种抗生素浓度均为50mg/L。
7.如权利要求1中所述的海洋氨氧化古菌的快速富集培养方法，其特征在于，所述步骤C中的三羧酸循环的代谢产物为α-酮戊二酸、草酰乙酸和丙酮酸，三种中间产物的浓度均为100μM。
8.如权利要求1中所述的海洋氨氧化古菌的快速富集培养方法，其特征在于，所述步骤C中的富集培养基的配制步骤为：称取氯化铵0.014g、四种抗生素各0.05g、α-酮戊二酸0.015g、草酰乙酸0.013g、丙酮酸0.009g，溶于1L海水中，将pH调为7.5±0.1，配制完成后，使用0.22μm的滤膜进行过滤，防止非目标菌随培养基进入富集培养物中。
9.如权利要求1中所述的海洋氨氧化古菌的快速富集培养方法，其特征在于，所述步骤D中的氨氧化古菌的富集培养在连续流反应器中进行，水力停留时间为48h。
10.如权利要求1中所述的海洋氨氧化古菌的快速富集培养方法，其特征在于，所述步骤E中的分子生物学检测为在氨氧化古菌富集培养的过程中，使用荧光定量PCR和荧光原位杂交对氨氧化古菌的富集程度进行实时监测。
CN201510029597.7A 2015-01-21 2015-01-21 一种海洋氨氧化古菌的快速富集培养方法 Pending CN104593304A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510029597.7A CN104593304A (zh) 2015-01-21 2015-01-21 一种海洋氨氧化古菌的快速富集培养方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510029597.7A CN104593304A (zh) 2015-01-21 2015-01-21 一种海洋氨氧化古菌的快速富集培养方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104593304A true CN104593304A (zh) 2015-05-06

Family

ID=53119362

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510029597.7A Pending CN104593304A (zh) 2015-01-21 2015-01-21 一种海洋氨氧化古菌的快速富集培养方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104593304A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105907656A (zh) * 2016-03-24 2016-08-31 中国科学院城市环境研究所 一种延长氨氧化古菌传代时间的培养方法
CN114314861A (zh) * 2022-01-13 2022-04-12 厦门大学 一种水体脱氮方法
CN115097886A (zh) * 2022-06-29 2022-09-23 上海市政工程设计研究总院（集团）有限公司 污水处理中溶解氧浓度的控制方法及系统、设备及介质
CN115259378A (zh) * 2022-08-25 2022-11-01 华南农业大学 一种富集污水处理系统中氨氧化古菌的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102250783A (zh) * 2010-08-30 2011-11-23 烟台大学 一种氨氧化菌富集培养的方法
CN102559489A (zh) * 2012-01-18 2012-07-11 北京工业大学 一种快速富集氨氧化菌的方法和装置
CN103451120A (zh) * 2013-02-04 2013-12-18 哈尔滨工业大学深圳研究生院 一种污水处理系统中氨氧化古细菌富集培养的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102250783A (zh) * 2010-08-30 2011-11-23 烟台大学 一种氨氧化菌富集培养的方法
CN102559489A (zh) * 2012-01-18 2012-07-11 北京工业大学 一种快速富集氨氧化菌的方法和装置
CN103451120A (zh) * 2013-02-04 2013-12-18 哈尔滨工业大学深圳研究生院 一种污水处理系统中氨氧化古细菌富集培养的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
叶磊等: "白洋淀湖滨湿地岸边带氨氧化古菌与氨氧化细菌的分布特性", 《生态学报》 *
岳洋洋: "污水处理系统中氨氧化古细菌富集筛选及氨氧化特性研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 *
罗剑飞等: "氨氧化古菌研究进展", 《华南理工大学学报（自然科学版）》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105907656A (zh) * 2016-03-24 2016-08-31 中国科学院城市环境研究所 一种延长氨氧化古菌传代时间的培养方法
CN114314861A (zh) * 2022-01-13 2022-04-12 厦门大学 一种水体脱氮方法
CN114314861B (zh) * 2022-01-13 2023-09-15 厦门大学 一种水体脱氮方法
CN115097886A (zh) * 2022-06-29 2022-09-23 上海市政工程设计研究总院（集团）有限公司 污水处理中溶解氧浓度的控制方法及系统、设备及介质
CN115259378A (zh) * 2022-08-25 2022-11-01 华南农业大学 一种富集污水处理系统中氨氧化古菌的方法
CN115259378B (zh) * 2022-08-25 2024-04-12 华南农业大学 一种富集污水处理系统中氨氧化古菌的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Li et al. Aerobic denitrifying bacterial communities drive nitrate removal: performance, metabolic activity, dynamics and interactions of core species
Fallowfield et al. The photosynthetic treatment of pig slurry in temperate climatic conditions: a pilot-plant study
CN102747014B (zh) 一株高盐生物脱氮的盐弧菌菌株及其在废水处理中的应用
Wang et al. Microbial community of sulfate-reducing up-flow sludge bed in the SANI® process for saline sewage treatment
Han et al. Dynamic characteristics of microbial community and soluble microbial products in partial nitrification biofilm system developed from marine sediments treating high salinity wastewater
Feng et al. Microbial communities and sediment nitrogen cycle in a coastal eutrophic lake with salinity and nutrients shifted by seawater intrusion
Sobczyłski et al. The variability and stability of water chemistry in a deep temperate lake: results of long-term study of eutrophication.
Calicioglu et al. Carbon-to-nitrogen and substrate-to-inoculum ratio adjustments can improve co-digestion performance of microalgal biomass obtained from domestic wastewater treatment
Li et al. Vertical distribution of microbial community and metabolic pathway in a methanogenic propionate degradation bioreactor
CN104593304A (zh) 一种海洋氨氧化古菌的快速富集培养方法
Zhao et al. Effects of operation parameters on nutrient removal from wastewater and high-protein biomass production in a duckweed-based (Lemma aequinoctialis) pilot-scale system
Van den Brand et al. Effects of chemical oxygen demand, nutrients and salinity on sulfate-reducing bacteria
Xing et al. Microbial activity and community structure in a lake sediment used for psychrophilic anaerobic wastewater treatment
Lindeboom et al. Piezo-tolerant natural gas-producing microbes under accumulating p CO 2
Kim et al. Optimizing cultivation strategies for robust algal growth and consequent removal of inorganic nutrients in pretreated livestock effluent
Zheng et al. Influence of polyaluminum chloride on microbial characteristics in anaerobic membrane bioreactors for sludge digestion
Shan et al. Microbial community analysis in a combined anaerobic and aerobic digestion system for treatment of cellulosic ethanol production wastewater
Tsushima et al. Microbial community structure and population dynamics of granules developed in expanded granular sludge bed (EGSB) reactors for the anaerobic treatment of low-strength wastewater at low temperature
Kim et al. Shift of microbial community structure by substrate level in dynamic membrane bioreactor for biohydrogen production
CN104609536B (zh) 一种启动高盐废水好氧生化处理系统的方法
Xu et al. Effects of sulfide availability on the metabolic activity and population dynamics of cable bacteria in freshwater sediment
Yang et al. A special light-aerobic condition for photosynthetic bacteria-membrane bioreactor technology
Hariz et al. Growth and biomass production of native microalgae Chlorella sp., chlamydomonas sp. and Scenedesmus sp. cultivated in Palm Oil Mill Effluent (POME) at different Cultivation conditions
Sanchez-Zurano et al. Respirometric assessment of bacterial kinetics in algae-bacteria and activated sludge processes
Huang et al. Denitrification performance and microbial community structure of a combined WLA–OBCO system

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20150506