CN104560992A - 一种用于预防和治疗人乳头瘤病毒感染和宫颈癌的微小rna - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医学技术领域,涉及一种用于预防和治疗人乳头瘤毒感染以及人宫颈癌的微小RNA。实验证实,本发明中的微小RNA可以直接靶向细胞内的人乳头瘤病毒E6基因,下调其表达,并最终抑制肿瘤细胞的增殖,诱导肿瘤细胞的凋亡。进一步可制备预防和治疗人乳头瘤毒的感染以及由该病毒所引起的宫颈癌的药物。
Description
技术领域:
本发明属于生物医学技术领域,涉及一种用于预防和治疗人乳头瘤毒感染以及人宫颈癌的微小RNA。
技术背景:
宫颈癌是全球范围内最常见的女性生殖道恶性肿瘤。据统计,全世界每年大约有将近50万的宫颈癌新发病例,超过27万妇女死于该病。近年来其发病率不断上升且出现年轻化趋势,死亡率也有回升的趋势。因此,研发新的安全有效的治疗靶点刻不容缓。
人乳头瘤病毒(humanpapilloma virus,HPV)是一种无包膜双链环状DNA病毒,其基因组全长约7200-8000bp,编码6个早期蛋白(E1,E2,E4,E5,E6,E7)和两个晚期蛋白(L1和L2)。根据致癌危险性,分为高危型HPV和低危型HPV,前者与宫颈癌及重度癌前病变相关,后者则引起生殖道疣等良性病变。现已明确,高危型HPV感染是导致宫颈癌的直接病因和首要病因。国内外经过长期、大规模的临床流行病学调查发现,超过99%的宫颈癌样本存在HPV病毒感染,其中,HPV16为主要感染型别。HPV病毒感染宫颈组织后,通常要经过一个较为长期、缓慢的过程,一般为十余年甚至数十年,组织才会出现癌变。因此,在这个长期持续的HPV感染过程中,寻找抗HPV感染及其病毒癌基因的靶点,可以阻断HPV持续感染以及组织癌变,是预防和治疗宫颈癌的关键。
微小RNA(microRNA,miRNA)是一类长约19~25nt的单链小分子非编码RNA,通常与靶基因的3‘非翻译区结合,有时也可与5‘非翻译区或编码区结合,降解靶基因mRNA或抑制其翻译,从而在转录后水平负向调控基因表达。miRNA广泛存在于从植物、线虫到人类的细胞中,参与调控一系列的生命活动。截止目前,miRBase数据库中收录各物种中已发现的成熟miRNA共达21264个,其中在人类中发现并已经得到实验证实的有2042个(Release19:August2012)。近年的研究显示miRNA与多种恶性肿瘤密切相关,其可充当癌基因或抑癌基因的角色,在肿瘤血管生成、肿瘤细胞的增殖、凋亡、浸润及转移等过程中发挥重要作用。
近年来,越来越多的证据显示miRNA具有直接抗病毒作用。从2005年至今,有多条人类细胞miRNA被报道可直接靶向攻击外源性致病病毒,调控病毒基因的表达,如:miR-196、miR-448抗HCV病毒;miR-199a、miR-210、miR-125a抗HBV病毒;以及一系列miRNAs抗HIV、H5N1、H1N1病毒等。这种作用模式被证实在机体抗病毒感染免疫中发挥重要作用。由于miRNA的内源性及相对安全性,利用其靶向攻击外源性病毒这一特性开发相应的药物或方法,可以模拟机体抗病毒免疫,为预防和/或治疗病毒感染诱发恶性疾病(如丙型肝炎、乙型肝炎、艾滋病等)带来了新的契机。
然而,宫颈癌作为与病毒感染明确相关的恶性肿瘤中的一种,到目前为止还没有任何文献报道某种miRNA可以直接靶向HPV病毒、调控HPV病毒基因的表达。尚未见任何一种人类miRNA应用于抗HPV病毒。而阻断HPV持续感染恰恰是预防和治疗宫颈癌的关键。
发明内容:
鉴于上述技术背景,本发明的目的在于提供一种新的用于由HPV感染及宫颈癌的治疗靶点及方法。
具体的,本发明提供了一种可用于预防和治疗人乳头瘤毒的感染以及由该病毒所引起的宫颈癌的微小RNA核酸序列,具体为:5’AUAUACCUGUUCGGUCUCUUUA3’。本发明的一个实施例中,所述微小RNA可以靶向人乳头瘤病毒E6基因的第207-232nt,所述第207-232nt的序列为:5’AACAGTTACTGCGACGTGAGGTATAT3’。
本发明还涉及上述微小RNA及其各种载体、药物组合物在预防和治疗HPV病毒感染以及由该病毒引起的宫颈癌的药物中的用途。
所述药物组合物指含有有效量的上述核酸序列以及药学上可接受的赋形剂。
本发明中,所述人乳头瘤病毒可以引起人宫颈癌的高危亚型,包括:HPV16,HPV18HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73、HPV82。
另外,本发明还涉及用本发明提供的上述核酸序列、载体或药物组合物来调控HPV E6基因的表达。
本发明中,所述的微小RNA可以下调人乳头瘤病毒E6基因表达,并最终抑制肿瘤细胞的增殖,诱导肿瘤细胞的凋亡。
本发明通过生物信息学方法预测出上述微小RNA的核酸序列。进而,本发明将该微小RNA及其预测靶标序列分别克隆于双荧光素酶报告基因载体内,结果发现报告基因活性明显被抑制,证实该微小RNA可与该靶标相互作用。为了评价该微小RNA对HPV16感染的宫颈癌细胞生长的影响,本发明将该微小RNA表达质粒转染入HPV16阳性的宫颈癌SiHa细胞株,流式细胞仪检测法、Hoechst染色法、Roche细胞分析仪检测法结果均显示外源性上调细胞内该微小RNA的表达可明显减缓细胞增殖、增加细胞凋亡,证实该微小RNA介导的对HPV病毒的沉默效应可以干扰肿瘤细胞的生长结局。同时,RT-PCR法结果显示E6癌基因的mRNA表达明显减少。由此,本发明证实了该微小RNA可通过靶向HPV16-E6基因,直接靶向攻击HPV16病毒,影响病毒的致癌能力,从而有效抑制宫颈癌细胞的生长、诱导宫颈癌细胞凋亡。鉴于miRNA的内源性及相对安全性,如果将其应用于药物,模拟人类细胞受到HPV感染后免疫系统产生的抗病毒免疫反应,将有望成为一种新型的预防和治疗HPV感染以及由HPV感染引起的宫颈癌的治疗方法及要素。
附图说明:
图1:将该微小RNA序列克隆于pSilencer4.1-CMV载体内,其预测靶标序列克隆于psiCheck-2载体内,两种重组质粒共转染于HPV阴性的宫颈癌C33A细胞,为实验组;空白质粒和靶标荧光报告基因质粒共转染C-33A细胞,为对照组。图1显示了转染48小时后检测的荧光素酶活性:实验组的荧光活性比对照组减少29.23%,报告基因表达明显被抑制,数据具有统计学意义(P<0.001)
图2:将该微小RNA表达质粒(pSilencer4.1-miRNA-CMV)转染入HPV16阳性的宫颈癌SiHa细胞株,为实验组;未转染质粒及转染空白质粒的SiHa细胞为正常对照组及阴性对照组。图2显示了流式细胞仪检测细胞凋亡率结果:实验组的早期凋亡率分别为正常对照组和阴性对照组的3.1倍和2.6倍,晚期凋亡率分别为9.5倍和10.4倍,总凋亡率分别为5.8倍和5.4倍,差异有统计学意义(P<0.05)。
图3:显示了Hoechst染色法检测SiHa凋亡细胞结果:实验组细胞荧光染色阳性率分别为正常对照组和阴性对照组的43.3倍和23.9倍。差异有统计学意义(P<0.001)。
图4:显示了由Roche xCELLigence RTCA DP细胞分析仪监测的SiHa细胞增殖指数绘制的细胞生长曲线:转染了微小RNA表达质粒的实验组的细胞增殖指数均较正常对照组和阴性对照组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);细胞生长曲线明显可见实验组的细胞增殖及伸展能力显著受抑制。
图5:利用RT-PCR法检测SiHa细胞中HPV16病毒E6癌基因的mRNA表达水平。图5显示了RT-PCR检测电泳条带结果:实验组细胞转染微小RNA表达质粒后出现E6mRNA表达量明显下降。
图6:显示了RT-PCR电泳条带的灰度值分析结果:转染了微小RNA表达质粒的实验组E6mRNA表达量较正常对照组和阴性对照组下降27.52%和23.42%,数据有统计学差异(P<0.05),而对照GAPDH表达量则与对照组无明显变化,无统计学差异。
具体实施方式:
实施例1
1.质粒构建:
根据pri-hsa-miRNA前体序列设计扩增引物,DNA合成技术得到第一链DNA,通过PCR扩增得到双链DNA,连接入pSilencer4.1-CMV载体;用BamHI和HindIII分别双酶切miRNA扩增片段及psilener4.1-CMV载体,构建微小RNA表达质粒。根据对应的靶位点信息设计oligo引物,将含有微小RNA靶标序列的片段连接入psi-check2载体。用XhoI和NotI分别双酶切靶标序列扩增片段及psi-check2荧光素酶双报告基因载体,构建微小RNA靶标序列表达荧光报告基因质粒。随后转化E.coli DH5α宿主菌,将抽提后的质粒进行测序鉴定及浓度测定。通过生物信息学方法预测出上述微小RNA的核酸序列可以靶向人乳头瘤病毒E6基因的第207-232nt,序列为:5’AACAGTTACTGCGACGTGAGGTATAT3’。
2.细胞培养及转染:
将C-33A细胞和SiHa细胞分别培养于含体积分数10%胎牛血清的MEM培养液中,置于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。转染前一日,细胞胰蛋白酶消化并接种于24孔板中。将微小RNA表达质粒与其相应靶标荧光素酶报告基因质粒制成混合液,与LipofectamineTM2000稀释液混合,加入接种C-33A细胞的24孔板中,6小时后换成含10%胎牛血清的MEM培养液,为实验组。将空白载体质粒与靶标荧光素酶报告基因质粒依照同法共转染C-33A细胞,作为阴性对照。将LipofectamineTM2000稀释液及微小RNA质粒稀释液制成混合液,加入接种SiHa细胞的培养板孔中,6小时后换成10%胎牛血清的MEM培养液,为实验组。空白质粒转染SiHa细胞,作为阴性对照,未转染质粒的SiHa细胞为正常对照。24小时后收集细胞培养上清液以备检测。以上每步均重复三遍。
3.荧光素酶双报告基因系统检测荧光素酶活性:
转染后的C-33A细胞,培养24小时后细胞裂解。将100μl荧光素酶测试试剂II和20μl细胞裂解液加入化学发光分析仪检测管中混匀,置入化学发光分析仪,检测内参报告基因荧光素酶(即萤火虫荧光素酶)表达量,读取数值并记录为F1。随后加入100μl Stop&Glo工作液,吹打混匀,检测主报告基因荧光素酶(即海肾荧光素酶)表达量,读取数值并记录为F2。F2/F1比值即所得荧光素酶活性。采用SPSS StatisticsV20.0统计软件对所有数据进行正态性及方差齐性检验,采用方差分析比较组间差异。4.Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞仪检测SiHa细胞凋亡率:
转染后24小时的SiHa细胞,胰蛋白酶消化,收集细胞。用冰冷的磷酸缓冲液(PBS)洗涤一次,在100μl结合缓冲液重悬细胞。于每100μl细胞悬液中加入5μlAF488-annexin-V和1μl PI工作液,室温孵育15分钟,离心弃上清。加入400μl结合缓冲液,置于流式细胞仪检测细胞凋亡率。
5.Hoechst染色检测SiHa凋亡细胞:
转染24hr后SiHa细胞,PBS洗涤三次。4%多聚甲醛0.5ml固定,0.5ml Hoechst33258工作液(10μg/ml)染色。抗荧光淬灭封片液进行封片。荧光显微镜下观察,激发波长为350nm,发射波长为460nm。
6.Roche细胞分析仪检测SiHa细胞增殖:
SiHa细胞自铺板开始至miRNA质粒转染后,每4hr将xCELLigence E板置于xCELLigence RTCA DP细胞分析仪板槽内检测一次细胞增殖指数。细胞增殖指数取决于(Rn-Rb)/15的值(Rn为生长有细胞的培养板底面电极电阻;Rb为仅含有培养液的背景培养板底面电极电阻)。监测120hr,绘制细胞增殖曲线。对各组数据进行正态性及方差齐性检验,采用方差分析比较组间差异。
7.RT-PCR法检测E6mRNA的表达:
提取转染后细胞总RNA进行逆转录聚合酶链反应。E6的上游引物序列为5'AGCGACCCAGAAAGTTACCA3',下游引物序列为5'GCATAAATCCCGAAAAGCAA3',扩增长度为134bp。以GAPDH为内参。PCR反应条件为:94℃预变性3min,然后94℃变性30s、50℃退火40s、72℃延伸1min,30个循环后再72℃终末延伸10min。取产物进行琼脂糖凝胶电泳。TotalLab100软件分析条带。
SEQUENCE LISTING
<110> 复旦大学附属妇产科医院
<120> 一种用于预防和治疗人乳头瘤病毒感染和宫颈癌的微小RNA
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial
<400> 1
auauaccugu ucggucucuu ua 22
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 2
aacagttact gcgacgtgag gtatat 26
Claims (5)
1.一种微小RNA,其特征在于所述微小RNA的核酸序列为:5’AUAUACCUGUUCGGUCUCUUUA3’。
2.根据权利要求1所述的微小RNA,其特征在于所述微小RNA可以靶向人乳头瘤病毒E6基因的第207-232nt,所述第207-232nt的序列为:5’AACAGTTACTGCGACGTGAGGTATAT3’。
3.根据权利要求1所述的微小RNA,其特征在于所述的微小RNA可以下调人乳头瘤病毒E6基因表达,并最终抑制肿瘤细胞的增殖,诱导肿瘤细胞的凋亡。
4.如权利要求1所述的微小RNA在制备用以预防和治疗人乳头瘤病毒感染和由该病毒引起的宫颈癌的药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于所述人乳头瘤病毒为可以引起人宫颈癌的高危亚型,包括:HPV16,HPV18HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73、HPV82。
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- 2013-10-10 CN CN201310470105.9A patent/CN104560992B/zh active Active
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