CN104548078A - 自发性脑出血动物模型平台及其在药物筛选中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于在待测物中筛选自发性脑出血相关药物的方法，包括以下步骤：（1）对大鼠进行训练，让其从步行台一侧跑至另一侧；（2）对步骤（1）得到的大鼠进行诱发模拟自发性脑出血症状的处理；（3）短期或长期观察和定量分析步骤（3）得到的大鼠通过步行台的步态指标；（4）根据（3）的分析结果对所述大鼠的自发性脑出血的疾病程度和恢复状况进行判断。本发明的方法可用于短期和长期研究和观察，检测的指标可稳定可靠，与自发性脑出血相关性明显大于现有技术。本发明还提供了用于在待测物中筛选自发性脑出血相关药物的方法。

Description

自发性脑出血动物模型平台及其在药物筛选中的用途

技术领域

本发明涉及疾病和药物研究领域。具体的，本发明提供了一种研究自发性脑出血的动物模型平台，以及使用所述动物模型平台筛选自发性脑出血药物的方法。

背景技术

自发性脑出血（Spontaneous intracerebral hemorrhage，ICH）是指非外伤情况下各种原因引起的脑大、小动脉，静脉和毛细血管自发性破裂引起的脑内出血。ICH是一种多因素疾病，受环境和遗传因素共同作用。其症状包括意识障碍、偏瘫、失语、蛛网膜下腔出血、视力下降、视网膜出血等。其发病原因包括高血压，淀粉样变性血管病、先天性血管瘤、动静脉畸形、凝血障碍等以及烟雾病、结节性多动脉炎、抗凝剂和抗血小板聚集剂的应用和某些药物的使用。在欧美国家，自发性脑出血患者占全部卒中患者的10%～20%，病死率和致残率都很高，有资料显示病死率达23%～52%。在我国，根据2005年中国脑血管病防治指南，脑出血发病率为60～80/10万人口/年，占全部卒中病例的30%左右，急性期病死率约为30%～40%。大脑半球出血约占80%，脑干和小脑出血约占20%。至于复发性脑出血的发生率，根据国外资料，亚洲国家为l.8%～11%，欧洲国家为6%～24%，拉丁美洲为6%～30%。

自发性脑出血已通过各种动物模型得到复制并深入机制研究。在ICH的行为学研究中，其研究方法包括化学性损害模型，机械损伤模型和基因遗传模型。化学性损害模型包括用胶原酶或自体血注入等方法对动物例如灵长类或啮齿类动物进行处理。胶原酶介导建立的动物模型是常见的ICH模型之一，能很好地模拟ICH的临床症状和病理学特点。不同的ICH致病模型模拟的ICH的病理、发病机制、临床症状和病理学特点不同。不同的动物在同一个ICH致病模型也有一定区别。例如，不同动物对胶原酶敏感性有差异。因此通常需要针对特定的医学或药物开发研究目的开发特定的ICH致病模型，以及选择特定的动物类型，以及观察这种特定动物模型的特定参数，才能尽量准确地获得待测医疗手段或药物是否对ICH有效的判断。

应用于检测ICH模型中行为学检测方法主要有：前肢上抬实验、伸爪实验、圆柱体实验、改良神经功能缺损评分（mNSS）、转角实验等。数十年来上述行为学检测方法被用于检测中枢神经系统损伤后的感觉功能研究。然而，这些方法被用于评估单方面功能障碍时，有许多限制。例如，前肢上抬实验和改良神经功能缺损评分需要固定大鼠躯干；圆柱体实验仅测试前肢，后肢则被忽视。很少有研究测试了动物单侧脑出血情况下的不对称感觉以及运动功能障碍。

ICH患者可能会需要数年时间来恢复长期脑功能障碍。临床研究的目的就是改善人类的功能恢复。目前大多使用ICH的动物模型来模拟临床情况。尽管障碍表现可以非常接近ICH症状，但用现今的研究技术进行微创检测发现，通常动物经过最初的脑出血之后约2个月即可几乎完全恢复。很少有研究进行长期性功能障碍的评估。

因此，显然还需要一种对ICH短期和长期功能障碍和症状敏感的可重复性高的方法，来评估脑出血后单侧中枢神经混乱和其回复过程造成的的损伤程度和长期残余损伤，特别是胶原酶诱导的ICH大鼠模型的行为状态判断方法以及使用这种方法评估药物或疗法对ICH的效果。

因此，本报告的目的，即是对步态参数进行探索性分析来确定这些ICH大鼠模型的变化，并通过对ICH大鼠的步态分析探索其长期障碍表现。

发明内容

本发明提供了一种用于研究自发性脑出血（ICH）的动物模型平台，所述模型平台利用胶原酶(Collagenase)诱发大鼠出现ICH症状，并采用定量分析大鼠通过步行台的步态及姿势指标来作为检测ICH行为学检测的特征参数。本发明还提供的利用所述平台用作在待测物中研究或筛选ICH相关药物的方法。

具体的，本发明提供了一种用于制备自发性脑出血动物模型的方法，包括以下步骤：

（1）对大鼠进行训练，包括将大鼠放入步行台，让其从步行台一侧跑至另一侧，训练至大鼠能连续地通过步行台，

（2）对步骤（1）得到的大鼠进行诱发模拟自发性脑出血症状的处理；

（3）短期或长期观察和定量分析步骤（3）得到的大鼠通过步行台的步态指标；

（4）根据（3）的分析结果对所述大鼠的ICH的疾病程度和恢复状况进行判断。

在本发明的其中一个方面，其中所述自发性脑出血动物模型用于自发性脑出血的长期和短期研究。

在本发明的其中一个方面，其中所述方法中的步骤（1）为将大鼠放入步行台，让其自由从通道一侧自由跑至另一侧，训练合格的大鼠为在没有推拉的状态下通过走道。优选的，以大鼠至少可以连续三次正确地无停顿地通过通道为训练合格条件。更优选的，以大鼠至少可以连续三次正确地无停顿地在1.0-2.5秒内通过通道为训练合格条件。

在本发明的其中一个方面，其中所述方法中的步骤（2）所述诱发模拟自发性脑出血症状的处理为将胶原酶（例如IV型胶原酶）施用于大鼠脑半球的纹状体。可选择施用于大鼠一侧或两侧脑半球的纹状体。造成的脑部损伤通常反映在对侧肢体受损（例如运动功能等受损）。

在本发明的其中一个方面，其中所述大鼠通过步行台的步态指标包括静态指标和/或动态指标。静态指标可包括爪印面积、最大接触面积、接触时间、接触平均强度、最大接触平均强度或其任意组合。动态指标可包括行走时间，速度变异率，步频，摇摆速度，步幅，接触率、占空比、支撑比例类型、爪间距离、步伐周期或其任意组合。

在本发明的其中一个方面，其中所述方法中的步骤（3）中为短期观察和定量分析。短期可以是指在对步骤（2）进行模拟自发性脑出血症状的处理后1天到30天内（例如在第1-3天，优选在第3天）。观察和分析的步态指标为爪印面积、最大接触面积、前爪接触时间、压力、摇摆速度、后爪占空比、步幅、前爪间距、支撑比例类型例如三爪支撑模式、步频和平均速度中的一种或多种的组合。在本发明的其中又一个方面，步骤（3）中当出现：

（a）前肢和/或后肢爪印面积变小；

（b）前爪接触时间上升；

（c）压力变小；

（d）后爪摇摆速度下降；

（e）后爪占空比下降；

（f）步幅下降；

（g）前爪间距下降；

（h）三爪支撑模式比例上升；

（i）步频下降；或

（j）（a）-（i）中的任意两种或多种的组合时，

判断为大鼠的对侧脑部受损。

在本发明的其中一个方面，其中所述方法中的步骤（3）中为长期观察和定量分析。长期一般是指在对步骤（2）进行模拟自发性脑出血症状的处理后1天到60天内（例如在第1-56天内，优选在第1,3，28,35和56天）。观察和分析的步态指标包括爪印面积、最大接触面积、前爪接触时间、压力、摇摆速度、后爪占空比、步幅、前爪间距、支撑比例类型例如三爪支撑模式、步频和平均速度中的一种或多种的组合，优选为爪印面积、站立期持续时间和压力方面的一种或多种的组合。在本发明的其中又一个方面，其中步骤（3）中当在出现：

（a）前肢和/或后肢爪印面积变小；

（b）前爪接触时间与另一侧前爪接触时间的比值上升；

（c）后爪接触时间与另一侧后爪接触时间的比值下降；

（d）压力下降；

（e）步幅下降；

（f）前爪间距下降；

（g）三爪和四爪支撑模式出现的比例增多，双爪和单爪支撑模式出现的比例减少；或

（h）（a）-（g）中的任意两种或多种的组合时，

判断为大鼠的对侧脑部受损。

在本发明的其中一个方面，其中所述方法中的步骤（3）通过动物步态分析系统平台来观察和分析大鼠通过步行台的所述特征指标，所述平台包括具有通道和玻璃地板的步行台、玻璃光源、摄像头、图像采集卡和分析装置，大鼠沿通道走过步行台时，爪子接触被玻璃光源照亮的玻璃地板，留下的爪印被步行台下方的摄像头拍摄到后送入图像采集卡，通过分析装置分析这些爪印可以得到步序，步态，时长，每个爪子的步长，每对前爪和后爪之间的距离，爪印的长度宽度，爪子的压力参数，并由此统计或计算出所述步态指标。

在本发明的一个方面，步骤（3）采用了动物步态分析系统平台，例如可商购的步行台（Catwalk）动物步态分析系统平台来观察和定量分析大鼠通过步行台的前述特征指标。所述动物步态分析系统平台包括玻璃地板和上下左右封闭，两端具有入口和出口的通道的步行台、玻璃光源、摄像头、图像采集卡和分析装置，大鼠沿通道走过步行台时，爪子接触被玻璃光源照亮的玻璃地板，留下的爪印被步行台下方的摄像头拍摄到后送入图像采集卡，通过分析装置分析这些爪印和相关时间可以得到步序，步态，时长，每个爪子的步长，每对前爪和后爪之间的距离，爪印的长度宽度，爪子的压力等参数，并由此统计或计算出所述步态指标。通过对所述参数和的统计或计算，可以对所述动态指标和静态指标进行定量分析。动物步态分析系统平台中的通道通常由与玻璃地板两端垂直连接的侧壁和顶盖组成。封闭通道具有供大鼠通过的入口和出口。动物步态分析系统平台中的分析装置通常为带有统计或计算软件程序的计算机系统。

在本发明中，观察和定量分析大鼠通过步行台的步态指标。ICH动物模型的行为学指标包括体现平衡协调的指标、疼痛的指标、步态指标和姿势指标等。通过前述动物步态分析系统平台可以观察和分析脚掌尺度指标（可作为疼痛的指标）、步态指标和姿势指标等指标。在本发明中出乎意料地发现，步态指标能够准确定性和定量地反映ICH模型动物的行为学状态，通过和组织学和脑容量测量的比较，发现这些步态指标在该动物模型的短期和长期观察中与ICH的相关度稳定和敏感，比其它常用的模型的相关度高，特别是在长期观察和分析中特别有用。

其中，大鼠通过步行台的步态指标中有关指标和参数的定义如下。

爪印面积（Print area，mm²）：站立期（stance phase）鼠爪与地板接触的总面积。

最大接触面积（Maximum contact，mm²）：站立期爪-地最大接触时的爪面积。

站立期持续时间（Duration of stance phase，sec）：站立期或摇摆期（swingphase）的持续时间取决于行进速度和功能紊乱程度。站立期持续时间为整个步伐持续时间的分数：站立分数=[站立持续时间/（站立持续时间+摇摆持续时间）]×100%。

最大接触平均强度（Max Contact Mean Intensity，[a.u.]）：单个爪与走道地板最大接触点的压力平均值。

爪间距离（Base of support，BOS，mm）：两前爪或两后爪的间距。

占空比（Duty cycle，%）：步伐周期内（站立+摇摆）站立的百分比：

占空比=站立/（站立+摇摆）×100%。

步幅（Stride length，cm）：同一爪连续落点间的距离。基于同一爪最大接触时的两个连续爪印中心的横坐标。

支撑模式比例（Support on，%）：同时与地板接触的所有爪子组合的持续时间比例：零爪，单爪，对角双爪（a diagonal pair of paws）（右前-左后或左前-右后），环绕双爪（girdle paws）（右前-左前或右后-左后），三爪和四爪。

步频=（步数-1）/(最后站立的最初接触时间-初始站立的最初接触时间)。

行走时间（Run duration）：单向单次通过玻璃地板所需要的时间。

速度变异率（Walking speed variation）：行走过程中即时速度的变异率。

摇摆周期：每个步伐周期中，动物足悬空的时间。

摇摆速度（Swing speed）=步幅/摇摆周期。

步伐周期（Step cycle）:行走过程中，同一只足接触玻璃地板时，间隔的周期。

接触时间（Stance）：每个步伐周期中，单只爪接触地面的时间。

接触率（Duty cycle）：每一步伐周期中，支撑时间占整个周期的百分率。

支撑周期：足接触地面的时间。

对角双足支撑模式（Support-diagonal）：对角双足同时支撑地板周期占总支撑周期的百分率。

三足支撑模式（Three-point support）：三足同时支撑地板周期占总支撑周期的百分率。

四足支撑模式（Four-point support）：四足同时支撑地板周期占总支撑周期的百分率。

本发明还提供了一种用于在待测物中筛选自发性脑出血相关药物的方法，包括利用前述方法来制备自发性脑出血动物模型，并包括将待测物给予所述方法中步骤（2）得到的大鼠的步骤，以及根据所述方法中步骤（4）的判断来对待测物是否可作为ICH相关药物进行初步判断。

在本发明的其中又一个方面，利用所述平台在待测物中筛选自发性脑出血相关药物的方法中设立药物处理组、正常对照组和自发性脑出血（ICH）模型组。药物处理组可给予不同的待测物，还可以给予不同浓度的待测物。自发性脑出血模型组和正常对照组的大鼠的其它处理条件和步骤与药物处理组的大鼠相同，只是自发性脑出血模型组的大鼠在步骤（3）给予待测物，以及正常对照组的大鼠不给予诱发模拟自发性脑出血症状的处理和待测物。通过检测药物处理组与自发性脑出血模型组的大鼠的所述通过步行台的步态指标和姿势指标是否有明显统计学差异，来对待测物是否可作为自发性脑出血相关药物进行初步判断。

若经过待测物处理后，药物处理组与ICH组对比，步态和姿势的指标不同，且经过标准的统计学检测后，有明显统计学意义，则初步认为此待测物对ICH有影响，可对其做进一步的研究。例如，可对该待测物进行是否ICH相关蛋白的拮抗剂、激动剂或反向激动剂等的研究，或对其进行修饰，用于研究自发性脑出血的机理或治疗药物或方法研究等。

例如，若经过待测物处理后，药物处理组与ICH组对比，步态和姿势的失调现象得到明显改善，且经过标准的统计学检测后，有明显统计学意义，则可初步判断此待测物对ICH模型鼠有治疗作用。

附图说明

图1为本发明的实施例的实验过程的时间进程。

图2a为ICH后第3、7、14、28和56天具有代表性的MRI扫描血肿最大直径图像。

图2b为MRI扫描组织损失体积和尼氏染色组织切片的对比。

图3a为ICH后第3、7、14、28和56天具有代表性的MRI扫描血肿最大直径图像。

图3b回归分析显示MRI测得组织损失体积和组织切片测得的结果之间有显著的关联性。

图3c为ICH组和假手术组大鼠的mNSS评分。

图3d为圆柱体实验结果。

图3e为单侧ICH处理大鼠在ICH处理后第3天有显著差异的步态参数的图示。

图4a-4f为步行台方法在ICH和假手术后56天内持续观察测得的步态参数的爪印面积结果。

图5a-5f为步行台方法在ICH和假手术后56天内持续观察测得的步态参数结果。

图6a-6f为步行台方法在ICH和假手术后56天内持续观察测得的步态参数的步幅结果。

具体实施方式

为了更好地理解和阐释本发明，下面将参照附图对本发明作进一步的详细描述。

实施例

1.实验方法

1.1动物准备及颅内输液

随机选取成年雄性Sprague-Dawley大鼠（250-300g），所有动物被安置于一12/12光暗周期可自由获取食物和水的环境内。

图1为实验过程的时间进程。实验动物分为ICH组群和假手术组群（shamgroups）。图1中坐标上的数值表示ICH或假手术之后的天数。T：训练；B：基线评估（baseline evaluations）。

实验动物的ICH组（或称为ICH处理组）进行了脑部人为损伤模拟ICH的处理。具体的，在本实验中，用0.2ml/100g的5mg/ml氯胺酮和2.5mg/ml甲苯噻嗪的混合溶液给大鼠进行腹腔注射使其麻醉，然后将大鼠固定于一体定位架上，再进行头皮切口。然后使用立体坐标定位右脑半球的纹状体：前0.2mm，横向3.0mm至前囱，深6.0mm，然后钻一个1mm的钻孔，插入26号针头。用微型注射泵注入IV型胶原酶（1.2μl，Sigma，C51380.25U于1μl0.9%NaCl）钻孔用牙科用粘固剂封闭，封闭切口，给动物保持温暖使其进行恢复。

1.2神经学结果测量

1.2.1改良神经功能缺损评分（Modified Neurologic Severity Scores,mNSS）

mNSS用于评估第1天至第56天ICH大鼠的神经性障碍。该评分是一种复了合运动、感觉（视觉、触觉和体感）、平衡和反射测试的评估方式。神经功能分级范围从0到18，0表示正常神经功能，18表示最大功能障碍。分数越高，受伤越严重。

1.2.2圆柱体实验（Cylinder test）

前肢不对称使用实验（圆柱体实验）用于测试第0天（手术前）至第56天的前肢使用情况。这一方法可体现对纹状体脑出血损伤敏感。大鼠被放置于一独立的透明圆柱体（直径20cm，高45cm）内，用镜子从侧面录像5分钟。实验者需在录像前确保整个圆柱体在画面内。前肢在墙上的最初位置和随后沿墙的移动作为前肢自发使用的实例。患肢的使用比例用下述公式计算：

1.2.3步态分析：步行台数据采集

步态分析的步行台实验（Catwalk test）可使大量运动参数易于定量。步行台装置包括一台录像机，一个一米长的玻璃板和一从玻璃走道地板一侧照射到地板的荧光光束。当老鼠在微光环境下沿走道行进时，光向下反射，动物的明亮的爪印将被安装在玻璃下的录像机捕捉到。然后由步行台电脑程序自动分析爪印镜头。

动物在受伤前接受一周的训练。每天至少六次使其熟悉走道及训练其通过走道。两个条件被用于确保步态分析的精确：（1）大鼠需在没有推拉的状态下通过走道；（2）每只老鼠需最少正确通过3次。因为大鼠由于虚弱和压力无法在第一天完成奔跑，步态分析在第0天进行，之后每周一次从第1天到第56天。一次标准的通过包含六步周期，从所有步伐周期数据中取平均数用于分析。本实验的ICH模型使用的步态参数如下：

1.2.4核磁共振成像（MRI）

MRI在第0天至第56天由一台3-T临床扫描仪（Achieva,Philips Healthcare,Best,The Netherlands）实施。T2加权成像参数为：二维快速自旋回波（TSE）序列与TSE因子=10，回声延迟时间/重复时间（TE/TR）=100ms/2000ms，视场（FOV）=40mm×40mm×28mm，采集矩阵=132×133，像素大小=0.3×0.3×2mm³，信号平均数量（NSA）=3，切片厚度=2.0mm，层间距=0.2mm。4个切片用于评估血肿和伤害体积，用Philips DICOM观察器分析其图像。组织损失体积用下述方程计算。

组织损失体积=非受伤半球剩余体积-受伤半球剩余体积；

半球体积=（半球冠状面面积-脑室面积-受创面积）平均值×切片间距×切片数

1.2.5组织学和脑容量测量

在ICH处理后第3、7、14、28、42和56天，取出大鼠的大脑，用甲酚紫染色。组织损失体积用点成像系统和下述方程计算：

组织损失体积=正常半球剩余体积-受伤半球剩余体积；

半球体积=（半球完整冠状面面积-脑室面积-受创面积）平均值×切片间距×切片数

2.实验结果

2.1MRI扫描和组织切片的病变图像

所有实验动物都显示出在第1天组织损失体积最大，实验中的所有动物组（每时间点n=6）均表现出相当大的ICH区域。图2a显示了在第1、3、7、14、28、56天每次在最大血肿直径水平（maximum hematoma diameter level）扫描的MRI图像。血肿在第1天开始形成并持续增长，在第3天达到其峰值体积。大部分血肿在ICH一个月后被吸收，而其最终在1到2个月之间消退成一腔室。ICH组（n=6）的组织损失体积在第1天最大（79.17±2.68mm³），之后随时间推移变化（单因素方差分析，p<0.0005）。在ICH后的第一个月，组织损失体积随血肿消退线性减少，在第28天时体积减少至大约第一天的四分之一（25.71±2.05mm³,p<0.0005）。一个月后，组织损失体积随空腔形成和脑室扩大线性增长，在第56天达到36.11±2.48mm³。

与MRI图像一致的，ICH大鼠（每时间点n=6）的尼氏染色部分（theNissl-stained sections）显示了血肿形成中胶原酶注射的结果——右侧纹状体大面积损伤（图2b）。将所得组织损失体积进行测量并与MRI图进行对应（图2c）。定量测量显示体积随着血肿和水肿（with the hematoma andedema）开始从第3天的73.18±1.77mm³到第7天随血肿消退和脑室扩大而减少到的35.59±2.30mm³。第14天（p<0.0005）和第56天（p=0.005）的样本由尼氏染色部分测量得到的组织损失体积显著地小于由MRI图像测量得到的。回归分析表明，由MRI图像得到的体积测量结果和由组织切片得到的结果间有显著的相关性（R²=0.9115,p<0.005;图3b）。

2.2ICH影响的mNSS评分

如图3c所示，在mNSS分析中，所有动物组（n=10每组）从第3天到第35天均表现出显著的神经紊乱，并且在第3天时达最高评分11.25±0.92（p<0.01）。

2.3ICH影响的圆柱体实验评分

如图3d所示，在墙面探测实验影响对侧前肢使用期间显示出没有时间影响（p=0.879）或时间×组群影响（p=0.332），但一直有一个显著的组群效应（p=0.018）。在第14天（p<0.001）和第21天（p<0.05）出现显著的不同：ICH组群（n=10每组）比假手术组群（sham groups）更少的使用对侧前肢（p=0.005）。

2.4ICH影响的步行台实验步态分析

对大鼠ICH后的mNSS神经学评分结果显示大部分严重的损伤发生于第1天到第3天。比较了ICH组群和假手术组群（sham groups）（n=10每组）第3天的步态参数以确认受损步态参数。

ICH处理后第3天的步行台测试结果可如下表1显示。

表一

^*p＜0.05；^**p＜0.01；^***p＜0.001

如表一所示，经统计学分析，单侧ICH处理大鼠在ICH处理后第3天的爪印面积、最大接触面积、前爪接触时间（fore paw stance）、压力、摇摆速度、后爪占空比、步幅、前爪BOS、支撑比例类型（support on style）（三爪支撑）、步频和平均速度等参数与对照组比较有显著的差别，显示出损伤。在图3e归纳了有显著差异的参数。

在本发明的其中一个方面，上述指标可通过对侧肢体与同侧肢体的比值进行提现。由此，可以最大程度地避免实验动物体重等非脑损伤影响因素的影响。

在本专利中，“对侧”是指受损脑部的另一侧肢体或器官。例如，对右脑半球的纹状体通过注入胶原酶造成右脑半球损伤，其左侧肢体（前肢或后肢）即为对侧肢体。类似的，“同侧”是指受损脑部的同一侧肢体或器官。例如，对右脑半球的纹状体通过注入胶原酶造成右脑半球损伤，其右侧肢体（前肢或后肢）即为同侧肢体。

同时，对ICH处理后的大鼠进行了长期评测（56天内）。

图4a-4f为步行台方法在ICH和假手术后56天内持续观察测得的步态参数的爪印面积结果。图4a和图4b显示，与假手术组在同一时间点进行比较，ICH组大鼠对侧前爪（左前）爪印面积（图4a）和对侧后爪（左后）爪印面积（图4b）减少。显示数据为：平均值±s.e.m^***p<0.001，^**p<0.01，^*p<0.05。图4a显示，ICH组大鼠对侧前爪（左前）爪印面积在术后第3天减少了20%，此现象持续了约两个月。图4b显示，ICH组大鼠对侧后爪（左后）爪印面积在术后第3天减少到约80%，在第49天恢复到约92%。回归分析（图4c）显示减少的左前爪爪印面积和mNSS评分有显著的关联性(R²=0.7981，p<0.05)。图4d显示，左前爪爪印面积和左前爪使用率有显著的关联性（R²=0.6031，p<0.05）。图4e显示，左前爪爪印面积与MRI图像测得组织损失体积有显著的关联性（R²=0.9714，p<0.01）。图4f显示，左前爪爪印面积与组织切片测得组织损失体积有显著的关联性（R²=0.6031，p<0.01）

图5a-5f为步行台方法在ICH处理和假手术后56天内持续观察测得的步态参数。与假手术组在同一时间点进行比较，图5a显示，ICH组大鼠对侧前爪（左前）站立期持续时间减少，图5b显示，对侧后爪（左后）站立期持续时间增加。图5c显示，ICH组大鼠对侧前爪（左前）压力和图5d显示，对侧后爪（左后）压力减少。图5e和5f分别为56天内持续观察得到的平均速度-时间和体重-时间数据。显示数据为平均值±s.e.m^***p<0.001，^**p<0.01，^*p<0.05。

图6a-6f为步行台方法在ICH和假手术后56天内持续观察测得的步态参数的步幅结果。图6a-6d显示，在同一时间点上与假手术组进行比较，ICH处理组大鼠四爪步幅均减少，图6e显示，前爪间距和后爪间距（E）均减少。图6f显示，ICH组大鼠在支撑模式上，单爪、对角双爪、环绕双爪和同侧双爪百分比减少，三爪和四爪模式增加。显示数据为平均值±s.e.m^***p<0.001，^**p<0.01，^*p<0.05。

本发明首次使用步行台系统测量自发性脑出血大鼠模型的运动障碍。现有技术已有关于大脑中动脉梗塞[Vandeputte C,等,Automated quantitativegait analysis in animal models of movement disorders.BMC Neurosci,2010.11:92.，Tauber SC等,Long-term intrathecal infusion of outer surface protein Cfrom Borrelia burgdorferi causes axonal damage.J Neuropathol Exp Neurol,2011.70:748-57.]、锥体束病变[Starkey ML,等Assessing behavioural functionfollowing a pyramidotomy lesion of the corticospinal tract in adult mice.ExpNeurol,2005.195:524-39.]、颈椎脊髓挫伤[Gensel JC等Behavioral andhistological characterization of unilateral cervical spinal cordcontusion injury in rats.J Neurotrauma,2006.23:36-54.]和帕金森氏症(PD)[Vandeputte C等Automated quantitative gait analysis in animal models ofmovement disorders.BMC Neurosci,2010.11:92.]模型的研究的报告。但这些研究观察的时期都比较短，最长的观察时间也只是在帕金森氏症动物系统中，观察影响持续时间最长，也只有两周。以及在在髓质纤维切除损伤[StarkeyML等,Assessing behavioural function following a pyramidotomy lesion of thecorticospinal tract in adult mice.Exp Neurol,2005.195:524-39.]研究中观察了两周。

而发明人发现本发明的用于研究ICH的动物模型平台能够同时观察和研究ICH的短期和长期神经损伤，其中发现损伤恢复多在1个月内，包括最大面积、占空比、步幅、前爪间距、支撑模式和步频的恢复。而爪印面积、站立期持续时间和压力方面障碍持续时间较长（多至2个月）。实验表明本发明的步行台测试方法所测的步态和姿势指标稳定可靠，可用于ICH损伤模型的治疗策略筛选。

除非另外指出，本发明的实践将使用生物技术、有机化学、无机化学等的常规技术，显然除在上述说明和实施例中所特别描述之外，还可以别的方式实现本发明。其它在本发明范围内的方面与改进将对本发明所属领域的技术人员显而易见。根据本发明的教导，许多改变和变化是可行的，因此其在本发明的范围之内。本文所提到的所有专利、专利申请与科技论文均据此通过引用结合到本文。

Claims (11)

1.一种用于制备自发性脑出血动物模型的方法，包括以下步骤：

（1）对大鼠进行训练，包括将大鼠放入步行台，让其从步行台一侧跑至另一侧，训练至大鼠能连续地通过步行台，

（2）对步骤（1）得到的大鼠进行诱发模拟自发性脑出血症状的处理；

（3）短期或长期观察和定量分析步骤（3）得到的大鼠通过步行台的步态指标；

（4）根据（3）的分析结果对所述大鼠的自发性脑出血的疾病程度和恢复状况进行判断。

2.权利要求1的方法，其中所述自发性脑出血动物模型用于自发性脑出血的长期和短期研究。

3.权利要求1的方法，其中步骤（1）为将大鼠放入步行台，让其自由从通道一侧自由跑至另一侧，训练合格的大鼠为在没有推拉的状态下通过走道，优选的，以大鼠至少可以连续三次正确地无停顿地通过通道为训练合格条件，更优选的，以大鼠至少可以连续三次正确地无停顿地在1.0-2.5秒内通过通道为训练合格条件。

4.权利要求1的方法，其中步骤（2）所述诱发模拟自发性脑出血症状的处理为将胶原酶，例如IV型胶原酶施用于大鼠一侧脑半球的纹状体。

5.权利要求1的方法，其中所述步态指标包括静态指标和/或动态指标，其中静态指标选自爪印面积、最大接触面积、接触时间、接触平均强度、最大接触平均强度或其任意组合，动态指标包括行走时间，速度变异率，步频，摇摆速度，步幅，接触率、占空比、支撑比例类型、爪间距离、步伐周期或其任意组合。

6.权利要求1的方法，其中步骤（3）中为短期观察和定量分析，在对步骤（2）进行模拟自发性脑出血症状的处理后1天到30天内（例如在第1-3天，优选在第3天），观察和分析的步态指标为爪印面积、最大接触面积、前爪接触时间、压力、摇摆速度、后爪占空比、步幅、前爪间距、支撑比例类型例如三爪支撑模式、步频和平均速度中的一种或多种的组合。

7.权利要求6的方法，其中步骤（3）中当出现：

（a）前肢和/或后肢爪印面积变小；

（b）前爪接触时间上升；

（c）压力变小；

（d）后爪摇摆速度下降；

（e）后爪占空比下降；

（f）步幅下降；

（g）前爪间距下降；

（h）三爪支撑模式比例上升；

（i）步频下降；或

（j）（a）-（i）中的任意两种或多种的组合时，

判断为大鼠的对侧脑部受损。

8.权利要求1的方法，其中步骤（3）中为长期观察和定量分析，在对步骤（2）进行模拟自发性脑出血症状的处理后1天到60天内（例如在第1-56天内，优选在第1,3，28,35和56天），观察和分析的步态指标包括爪印面积、最大接触面积、前爪接触时间、压力、摇摆速度、后爪占空比、步幅、前爪间距、支撑比例类型例如三爪支撑模式、步频和平均速度中的一种或多种的组合，优选为爪印面积、站立期持续时间和压力方面的一种或多种的组合。

9.权利要求8的方法，其中步骤（3）中当出现：

（a）前肢和/或后肢爪印面积变小；

（b）前爪接触时间与另一侧前爪接触时间的比值上升；

（c）后爪接触时间与另一侧后爪接触时间的比值下降；

（d）压力下降；

（e）步幅下降；

（f）前爪间距下降；

（g）三爪和四爪支撑模式出现的比例增多，双爪和单爪支撑模式出现的比例减少；或

（h）（a）-（g）中的任意两种或多种的组合时，

判断为大鼠的对侧脑部受损。

10.权利要求1-9中任一项的方法，其中步骤（3）通过动物步态分析系统平台来观察和分析大鼠通过步行台的所述特征指标，所述平台包括具有通道和玻璃地板的步行台、玻璃光源、摄像头、图像采集卡和分析装置，大鼠沿通道走过步行台时，爪子接触被玻璃光源照亮的玻璃地板，留下的爪印被步行台下方的摄像头拍摄到后送入图像采集卡，通过分析装置分析这些爪印可以得到步序，步态，时长，每个爪子的步长，每对前爪和后爪之间的距离，爪印的长度宽度，爪子的压力参数，并由此统计或计算出所述步态指标。

11.一种用于在待测物中筛选自发性脑出血相关药物的方法，包括利用权利要求1-10中任一项的制备自发性脑出血动物模型的方法来制备自发性脑出血动物模型，并包括将待测物给予所述方法中步骤（2）得到的大鼠的步骤，以及根据所述方法中步骤（4）的判断来对待测物是否可作为自发性脑出血相关药物进行初步判断。