CN104515839A - 一种预测紫杉烷类化疗药物疗效的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种预测紫杉烷类化疗药物疗效的试剂盒。该试剂盒含有预测紫杉烷类化疗药物疗效的生物标志物的检测试剂。所述的生物标志物包含：GeneID：3845的KRAS核酸序列。本发明还提供了一种预测紫杉烷类化疗药物疗效的方法。本发明的研究表明，紫杉烷类化疗药物在K-ras野生型的肿瘤细胞中药效明显，而在K-ras突变型的肿瘤细胞中相对耐药，因此，通过检测患者样品中K-ras基因型，可预测患者用紫杉烷类化疗药物进行治疗的临床疗效，并通过抑制K-ras基因的表达或活性提高紫杉烷类抗肿瘤药疗效。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种预测紫杉烷类化疗药物疗效的生物标志物，具体涉及一种通过检测患者样品中K-ras基因型预测紫杉烷类抗肿瘤药物疗效的方法、试剂盒，以及一种通过抑制K-ras基因表达和活性提高紫杉烷类抗肿瘤药疗效的方法。
背景技术
恶性肿瘤是危害人类健康的重要疾病之一，据WHO统计数据显示，2007年世界范围内，肿瘤引起的死亡人数约790万，占总死亡数的13%，并预计2030年每年1200万人将死于肿瘤。随着工业时代的到来，我国的肿瘤发病率以每年3-4%增长，因此，未来我国对肿瘤的预防和治疗面临巨大的压力。与创新药物的开发同样重要的是，如何对已有抗肿瘤药物更合理的应用，提高肿瘤治疗的临床效果，为个体化医疗提出了重要的挑战。
K-RAS是小分子量GTP酶超级族成员之一，该信号的激活参与调节细胞的增殖，分化和生存。所述K-RAS基因突变广泛存在恶性肿瘤中，21～43%的非小细胞肺癌（NSCLC），33%左右的结直肠癌以及72～82.4%的胰腺癌等肿瘤存在K-RAS的基因突变，K-RAS突变使GTPase丧失水解GTP能力，导致K-RAS不依赖胞外信号的作用下持续结合GTP而呈过度激活状态，持续性激活c-Raf/MEK/ERK（而不是B-RAF）和PI3K/AKT/mTOR信号通路，导致细胞恶性转化和促进肿瘤细胞的生存、增殖以及转移等。
临床研究显示，肿瘤K-RAS的基因型已用于预测肿瘤患者对表皮生长因子受体（EGFR）抑制剂的反应性；K-RAS突变后，可不依赖EGFR激活而持续性活化EGFR下游信号通路，导致EGFR抑制剂的耐药或无反应，为EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKI）抗肿瘤疗效的负性分子标志物；但是，目前尚不清楚所述K-RAS的基因型是否可预测肿瘤对紫杉烷等化疗药物的反应。
紫杉烷类抗肿瘤药包括紫杉醇（paclitaxel，）和多西紫杉醇（docetaxel，）等，其作用机制是促进微管蛋白聚合及抑制微管解聚，“冻结”微管的组成部分——细胞内骨架的合成，进而破坏肿瘤细胞的有丝分裂，是一种临床应用广泛的细胞毒类的化疗药。目前临床治疗中主要用于乳腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌、软组织肉瘤、头颈癌、胃癌、卵巢癌和前列腺癌等，其单独和联合用药均有显著疗效。
发明内容
本发明的目的是提供一种预测紫杉烷类化疗药物疗效的生物标志物和试剂盒。
本发明的另一目的是提供上述试剂盒的应用，即一种预测紫杉烷类化疗药物疗效的方法。
本发明提供了一种预测紫杉烷类化疗药物疗效的试剂盒，包含能特异性识别患者样品中K-ras基因的检测试剂。
本发明的试剂盒含有一种预测紫杉烷类化疗药物疗效的生物标志物。所述的生物标志物包含：Gene ID：3845的KRAS核酸序列，可以通过检测其第12、13、61位密码子是否存在突变来预测紫杉烷类化疗药物的疗效。
检测方法包括以下步骤：
（1）检测患者的样品中K-ras基因第12、13、61位密码子是否存在突变；
（2）若检测的K-ras基因第12、13、61位密码子未突变（即K-ras野生型的肿瘤患者），采用紫杉烷类药物进行治疗；
（3）若K-ras基因第12、13、61位密码子突变（即K-ras基因第12、13、61位密码子突变的肿瘤患者），采用其他不受K-ras基因突变影响的药物进行治疗（采用紫杉烷类药物进行治疗的临床疗效不好）。
所述的预测紫杉烷类化疗药物疗效的试剂盒，包含能特异性识别患者样品中K-ras基因的相关检测试剂。
例如，所述的检测试剂包括：
（1）特异性的结合于K-ras蛋白的抗体或片段；
或者
（2）特异性干扰K-ras基因表达的siRNA。
所述样品包括取自患者的体液或组织。
所述的紫杉烷类化疗药物包括紫杉醇(Paclitaxel)、多西紫杉醇(Docetaxel)、卡巴他赛（Cabazitaxel）等。
所述的紫杉烷类化疗药物的临床用药方式包括单独使用，以及和其他肿瘤治疗药物的联合应用。
所述的肿瘤包括卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤等。
所述的疗效为总生存期（Overall survival，OS）、无进展生存期（Progress FreeSurvival,PFS）等。
另一方面，本发明提供了上述试剂盒的应用，即通过检测K-ras基因型来预测紫杉烷类化疗药物疗效，所述方法包括步骤：
（1）测定患者样品中K-ras基因型；和
（2）确定样品中K-ras基因型；
对K-ras野生型的肿瘤患者应用紫杉烷类化疗药物进行治疗，对K-ras野生型的肿瘤患者可采用其他化疗药物进行治疗。
例如，所述的应用是测定K-ras基因型第12、13、61位密码子，包括以下步骤：
（1）检测患者的样品中K-ras基因第12、13、61位密码子是否存在突变；
（2）若检测的K-ras基因第12、13、61位密码子未突变，采用紫杉烷类药物进行治疗；
（3）若K-ras基因第12、13、61位密码子突变，采用其他不受K-ras基因突变影响的药物进行治疗。
所述样品包括取自患者的体液或组织。
因而，上述方法还包括抽提样品的基因组DNA的步骤。
具体而言，本发明提供了一种增加紫杉烷类化疗药物疗效的方法，包括以下步骤：
（1）检测患者的样品中K-ras基因第12、13、61位密码子是否存在突变；
（2）对于K-ras突变型的肿瘤患者，通过抑制K-ras基因的表达或活性，增加紫杉烷类化疗药物的疗效，包括向患者给予治疗有效量的①特异性的结合于K-ras蛋白的抗体或片段；②特异性干扰K-ras基因表达的siRNA。
所述的紫杉烷类化疗药物包括紫杉醇(Paclitaxel)、多西紫杉醇(Docetaxel)、卡巴他赛（Cabazitaxel）等。
所述的紫杉烷类化疗药物的临床用药方式包括单独使用，以及和其他肿瘤治疗药物的联合应用。
所述的肿瘤包括卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤等。
所述的疗效为总生存期（Overall survival，OS）、无进展生存期（Progress FreeSurvival,PFS）等。
本发明的研究表明，紫杉烷类化疗药物在K-ras野生型的肿瘤细胞中药效明显，而在K-ras突变型的肿瘤细胞中相对耐药，因此，通过检测患者样品中K-ras基因型，可预测患者用紫杉烷类化疗药物进行治疗的临床疗效，并通过抑制K-ras基因的表达或活性提高紫杉烷类抗肿瘤药疗效。
附图说明
图1紫杉烷类肿瘤药多西紫杉醇在K-ras不同基因型（vector，WT，G12V，G12R，G12D，G13D）转染的人胰腺癌Bxpc-3细胞上的短期生长抑制试验，细胞存活率采用MTT法测定。*，p<0.05VS野生型组（WT），且存活率的变化率>20%，#，，p<0.05VS突变型组间，且存活率的变化率>20%。
图2多西紫杉醇（Doc）长期给药（14天）对不同K-ras基因型（vector，WT，G12D，G12V）的Bxpc-3细胞生长的影响。（A）细胞用吉姆萨染液染色后的照片；（B）根据吉姆萨染色的面积计算的细胞长期给药的存活率（survival）。
图3多西紫杉醇（Doc）在不同K-ras基因型（vector，WT，G12D，G12V）的Bxpc-3细胞上的促凋亡作用。（A）DAPI染色法检测不同K-ras基因型细胞上多西紫杉醇的促凋亡作用；（B）western blot法检测凋亡蛋白c-PARP在K-ras不同基因型Bxpc-3细胞上的表达。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。但并不意味着本发明仅限于此。
实施例1MTT法检测多西紫杉醇在不同K-ras基因型转染的人胰腺癌Bxpc-3细胞上的药效
实验材料：
人胰腺癌Bxpc-3细胞（中科院上海细胞库）于37℃，5%CO2条件下常规培养，培养基为含10%胎牛血清（Hyclone）的RPMI-1640（Gibco）。载体质粒pAcGFP1-C3购自美国Clontech公司。多西紫杉醇标准品购自中国药品生物制品检定所，母液10mM由DMSO配制。MTT购自Sigma（美国）。
实验方法：
1.合成的含有K-ras不同基因型的全基因序列采用pAcGFP1-C3质粒导入人胰腺癌Bxpc-3细胞，G418筛选2周后形成K-ras不同基因型稳定表达的细胞株；
2.上述稳定表达K-ras不同基因型的细胞经胰酶消化，悬浮于常规培养基中，并调节细胞密度为5×104细胞/ml。100μl/孔接种于96孔培养板中，于培养箱中培养过夜；
3.次日更换培养基，加入含有多西紫杉醇不同浓度的新鲜培养基（DMSO<0.5%）。
4.将给药后的细胞于37℃，5%CO2条件下培养48小时；
5.每孔加入10μl MTT(5mg/ml)溶液，继续在培养箱中培养4小时；
6.洗去培养基，加入100μl DMSO，置于摇床上37℃使充分溶解，以检测波长570nm测定吸光度的值；计算细胞的生长抑制率。N=4，实验平行三次；
7.药效学差异的判定标准：存活率的变化率>20%，且经统计学检验p<0.05。
实验结果：
选取代表性的实验结果如图1所示，在K-ras突变型基因稳定转染的人胰腺癌Bxpc-3细胞上，多西紫杉醇的药效降低，且不同的突变型之间也存在一定的差异。
实施例2多西紫杉醇对人胰腺癌Bxpc-3细胞的长期生长抑制试验
实验材料：
吉姆萨染液购自Sigma-Aldrich(071M4343)。其余材料同实施例1。
实验方法：
1.K-ras不同基因型（vector,WT,G12D,G12V）稳定转染的人胰腺癌Bxpc-3细胞经胰酶消化，以5000个细胞/孔的密度点于6孔板中，培养基为含10%FBS，不含双抗的RPMI1640；
2.4天后加药，分为对照组，加药组（0.01nM,0.1nM）；每4天换一次液并重新加药；
3.14天后弃去培养基，用吉姆萨染液染色半小时，用水漂洗晾干后拍照。根据各孔光密度值比例计算细胞存活率。
实验结果：
选取代表性的实验结果如图2所示，多西紫杉醇在野生型（WT）K-ras的Bxpc-3细胞上的抑制效果最强，细胞存活率仅为21.32%，而在G12D中抑制效果最弱，细胞存活率为48.02%。
实施例3多西紫杉醇对K-ras不同基因型（vector、WT、G12D、G12V）的Bxpc-3细胞的促凋亡作用
实验材料：
RIPA裂解液、PMSF、DAPI染液购自碧云天生物生物技术研究所（江苏）。抗c-PARP一抗购自epitomics，抗β-actin一抗、抗小鼠及抗兔二抗均购自Santa Cruze；其余材料同实施例1。
实验方法：
1.DAPI染色法
Vector与不同基因型（WT,G12D,G12V）的细胞以每孔1×106的密度点于6孔板中，24h后细胞加药，分为对照组与加药组。加药组加入10nM多西紫杉醇，孵育24h。每孔用2ml PBS洗三遍，每遍5min。加入1ml4%多聚甲醛固定10min，用PBS溶液洗三遍后，加入0.2%Triton X-100透化10min。用PBS洗三遍后，每孔加入100μl DAPI染液，染色5-10min后用荧光显微镜观察并拍照；
计数对照组及各给药组的凋亡细胞的量，计算细胞的凋亡百分率；
2.Western Blot法
K-ras不同基因型（vector，WT，G12D，G12V）的Bxpc-3细胞，加入100nM的多西紫杉醇24h后提蛋白；具体方法为：临用前将PMSF（100mM，1:100）及Protease InhibitorCocktail Set Ⅲ（1:200）加入RIPA裂解液；6孔板培养的细胞倒去培养基后，用PBS清洗一遍，加入150μl裂解液冰浴裂解20min；裂解后转移至EP管中，12000g离心5min；吸取上清进行定量，同时取部分上清，加入1/4体积的上样缓冲液（5×），90-95℃煮10min；变性后的蛋白保存于-80℃冰箱中；
Western Blot检测P-EGFR、p-STAT3、P-Akt、P-Erk的表达，具体方法为：
BCA蛋白定量药盒对各组提取的蛋白样品进行定量，校正后蛋白样品上样量为60μg；
电泳方法：60V恒压电泳50分钟进行样品的浓缩；120V电泳1小时进行样品的分离，根据marker判断电泳程度；
转膜：采用湿转，200mA，恒流转膜1小时；
抗体杂交：首先用5%的BSA（封闭液）在37℃摇床上封闭1小时；用封闭液将一抗按说明书稀释，将转好的膜在杂交袋中4℃杂交过夜；TBST洗膜四次（37℃摇床，每次5mL，5min）；用封闭液将二抗稀释，在杂交袋中37℃摇床杂交1小时；TBST洗膜四次后进行化学发光检测；
化学发光检测：采用增强型化学发光法（ECL法）进行目的蛋白的检测；
实验结果：
选取代表性的实验结果如图3所示，DAPI染色后观察不同K-ras基因型细胞上的凋亡程度，结果表明相同浓度的多西紫杉醇在WT的Bxpc-3细胞上的凋亡程度最强，而在G12V和G12D细胞上凋亡百分率明显下降；Western Blot检测c-PARP的表达，结果表明多西紫杉醇在K-ras突变型细胞上的凋亡程度降低。
Claims (9)
1.一种预测紫杉烷类化疗药物疗效的试剂盒，其特征在于，包含能特异性识别患者样品中K-ras基因的检测试剂。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的样品包括取自患者的体液或组织。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂包括测定K-ras基因序列的试剂。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的患者是肿瘤患者，肿瘤选自卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤或脑瘤。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂是：
（1）特异性的结合于K-ras蛋白的抗体或片段；
或者
（2）特异性干扰K-ras基因表达的siRNA。
6.权利要求1所述的试剂盒的应用，其特征在于，通过检测K-ras基因型来预测紫杉烷类化疗药物疗效，所述方法包括步骤：
（1）测定患者样品中K-ras基因型；和
（2）确定样品中K-ras基因型是否为野生型；
对K-ras野生型的肿瘤患者应用紫杉烷类化疗药物进行治疗，对K-ras野生型的肿瘤患者可采用其他化疗药物进行治疗。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的应用是测定K-ras基因型第12、13、61位密码子，包括以下步骤：
（1）检测患者的样品中K-ras基因第12、13、61位密码子是否存在突变；
（2）若检测的K-ras基因第12、13、61位密码子未突变，采用紫杉烷类药物进行治疗；
（3）若K-ras基因第12、13、61位密码子突变，采用不受K-ras基因突变影响的药物进行治疗。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的紫杉烷类化疗药物选自紫杉醇、多西紫杉醇或卡巴他赛中的一种或者几种。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤选自卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤或脑瘤。
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