CN104498379B - 一株海洋石油降解菌、发酵所得化合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株海洋石油降解菌、发酵所得化合物及其用途。命名为Alcanivorax dieselolei T6‑6，保藏编号为：CGMCC NO：9033。γ‑变形菌纲，海洋螺菌目，烷烃降解菌科，食烷菌属，柴油食烷菌种；该菌可用于石油烃的降解与清除，环境污染的治理，生产表面活性剂，降低水的表面张力等多种用途；该菌发酵后的次生代谢产物中分离得到一类化合物，其中一种为：dieseloleiT6‑6，2‑氨基‑6‑(N‑2‑羰基‑4‑十三烷基‑环丁烷)己酸，为一种赖氨酸脂。该化合物对不同有机物有乳化活性，对革兰氏阳性细菌及真菌有抗菌抑菌作用，有较好的细胞毒活性。

Description

一株海洋石油降解菌、发酵所得化合物及其用途
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其涉及一株海洋石油降解菌、发酵所得化合物及其用途。
背景技术
海洋微生物(marine microorganism)是海洋中个体微小，构造简单的低等生物的总称。包括细菌、真菌、放线菌、霉菌、酵母、病毒、衣原体、支原体、噬菌体和微型藻及微型原生动物等。90年代以前，关于海洋微生物次生代谢产物的化学研究报道很少，人们研究热点一直是陆生真菌资源；到了90年代以后，关于海洋微生物次生代谢产物的化学研究的报道显著增多；其中1998年和2000年发现的新化合物数目最多，海洋微生物来源的新化合物数目也在增加，许多化合物具有新的骨架，证明了海洋微生物具有独特的代谢和生理机制，是潜在的新化合物及药物先导化合物的丰富资源库。
食烷菌(Alcanivorax)是海洋石油污染环境中重要的烷烃降解菌。目前在世界范围内从表层海水到深海沉积物中均分离或检测到了该属细菌的存在。该属目前已报道有6个种，第一个种Alcanivorax borkumensis SK2是1998年由Yakimov等人分离获得的,产一种糖脂类表面活性剂,葡萄糖脂(一个葡萄糖残基连着四个3-OH脂肪酸)；从黄海表层海水分离的柴油食烷菌Alcanivorax dieselolei B-5，在以十六烷为唯一碳源的诱导培养基中均能将发酵液表面张力降低到30mN/m以下，经鉴定为脯氨酸酯(十六烷酸与脯氨酸脱水缩合形成的线性脂肽)。
生物表面活性剂一般是由微生物(尤其是一些细菌和真菌)在一定培养条件下产生的代谢产物，通常为糖脂、磷脂、多糖脂复合物、脂蛋白-脂多肽、羟基化合物和交联脂肪酸等。生物表面活性剂的非极性疏水基团一般是长链脂肪酸或是β-羟基脂肪酸、α-烷基-β-羟基脂肪酸；而极性的亲水集团则有多种形式如糖类、氨基酸类、环状肽类、磷酸盐、醇等，它们一般都具有良好的降低表面张力和界面张力的性能。
生物表面活性剂具有一些一般化学合成表面活性剂所没有的独特性能：一般具有较低的临界胶束浓度，用量少、高效；具有生物降解性，无毒，对环境友好；可应用于环保、化妆品、药物、食品添加剂；因其化合物性质稳定，故可应用于一些极端环境如高温、高盐、高pH值等；
生物表面活性剂可分为糖脂、脂肽、脂蛋白、磷脂、脂肪酸、聚合物表面活性剂、粒状物表面活性剂。脂肽类生物表面活性剂的亲水基团由短肽或氨基酸组成，疏水基团由脂肪酸组成，一种脂肽往往是多种异构单体组成的混合体。由于脂肽中的脂肪酸链长和支链数量以及氨基酸的组成具有多变性，致使脂肽表面活性剂的种类繁多。具有代表性的脂肽有surfactin,lichenysin,fengycin,iturin,mycosubtilin及bacillomycin等。目前发现的脂肽主要来自Bacillus属，如B.subitilis、B.circulans、B.cereus、B.polymyxa、B.mesentericus等。除了Bacillus产生脂肽外，其他一些种类的微生物也产脂肽。例如Mycobacterium fortuirum、Streptomyces canus、Pseudomonas fluorescens、Serratiamarcescens等。
表1几种重要的微生物表面活性剂的来源和性质表
脂肽 微生物 表面张力(mN/m) CMC 界面张力(mN/m)
Peptide-lipid B.licheniformis 27 12–20 0.1-0.3
Serrawettin S.marcescens 28–33 / /
Viscosin P.fluorescens 26.5 150 /
Surfactin B.subtilis 27–32 23-160 1
发明内容
本发明的目的在于提供一株海洋石油降解菌菌株A lcanivorax dieselolei T6-6，
为实现上述目的，本发明提供一株海洋石油降解菌Alcanivorax dieselolei T6-6，保藏编号为：CGMCC NO：9033。
所述海洋石油降解菌Alcanivorax dieselolei T6-6的制备方法，其步骤为：
取第20航次西南印度洋深海海水于三角瓶中,121℃,20min，加入预先高温高压灭菌的4.2g/dm3的原油和柴油混合物，按质量比1:1混合，优选加入量为50cm3深海海水中加入0.21g原油和柴油混合物；然后加入预先高温高压灭菌的终浓度为1g/dm3的NH4NO3，pH＝7.5,终浓度为1g/dm3的KH2PO4溶液和0.22μm滤膜过滤除菌的终浓度为0.4μg/dm3FeSO4溶液；取50cm3深海水样加入该三角瓶中,置于28℃,160r/min的摇床中避光培养；培养6d后,黑色油污状消失,从中取2cm3转接入相同的培养基中,共转接5次后，最后把富集物进行梯度稀释，涂布于2216L平板上；固体平板添加1.5％琼脂粉，分离单菌得到权利要求1的菌株。
本发明还保护所述菌株的用途。
所述菌株可用于石油烃的降解与清除，及其所述菌株用于石油烃的降解与清除的方法。
所述菌株可用于环境污染的治理，及其所述菌株用于治理环境污染的方法。
所述菌株可降低水的表面张力，及其所述菌株用于降低水表面张力的方法；
任选的，所述菌株可用于生产生物表面活性剂，及其所述菌株用于生产表面活性剂的用途。
所述菌株可用于革兰氏阳性细菌及真菌的抗菌抑菌，及其所述菌株用于革兰氏阳性细菌及真菌的抗菌抑菌的方法。
所述菌株发酵可生产一类化合物，其特征在于，这类化合物的结构式如下：
当n＝1时，分子式为C18H34N2O3，分子量为326，命名为2-氨基-6-(N-2-氧代-4-壬基-环丁烷)己酸；当n＝2时，分子式为C20H38N2O3，分子量为354，命名为2-氨基-6-(N-2-氧代-4-十一烷基-环丁烷)己酸；当n＝3时，分子式为C22H42N2O3，分子量为382，命名为2-氨基-6-(N-2-氧代-4-十三烷基-环丁烷)己酸，又叫赖氨酸脂dieseloleiT6-6；当n＝4时，分子式为C24H46N2O3，分子量为410，命名为2-氨基-6-(N-2-氧代-4-十五烷基-环丁烷)己酸。
所述的化合物赖氨酸脂dieseloleiT6-6，分子式为C22H42N2O3，是通过所述的菌株发酵制备得到，其结构式为:
所述的赖氨酸脂dieseloleiT6-6用于乳化有机物和革兰氏阳性细菌及真菌的抗菌抑菌的用途；及其所述赖氨酸脂dieseloleiT6-6用于乳化有机物和革兰氏阳性细菌及真菌的抗菌抑菌的方法。
菌株Alcanivorax dieselolei T6-6和菌株Alcanivorax dieselolei B-5(AY683537)都具有烷烃降解能力和降低液体表面张力的能力。菌株A.dieselolei B-5现已作为Alcanivorax属dieselolei种的模式菌株被鉴定,其在中国海洋微生物菌种保藏管理中心(Marine Culture Collection of China；MCCC)的保藏编号为1A00001。此菌株有非常好的柴油和烷烃降解效果，在以正十六烷为唯一碳源的MSM培养基中生长良好并能将发酵液的表面张力降至31mN m-1左右，是产生表面活性剂的菌株之一。方法步骤见文献(Liu Cand Shao Z.Alcanivorax dieselolei sp.nov.,a novel alkane-degradingbacteriumisolated from sea water and deep-sea sediment[J].Int J Syst EvolMicrobiol,2005,55,1181-1186)。
菌株Alcanivorax dieselolei T6-6为申请人从大洋调查第20航次西南印度洋深海沉积物样品中分离筛选到的烷烃降解菌，此菌株可降解柴油和烷烃，可用于石油烃的降解与清除。
菌株Alcanivorax dieselolei T6-6细胞疏水性高，与石油类物质的亲和性比对照菌株高。
菌株Alcanivorax dieselolei T6-6产生的主要表面活性剂化学组成为赖氨酸脂，是β-羟基-十六烷酸与赖氨酸反应生成的脂肽，赖氨酸脂结构简单，可以通过酯化反应等化学方法合成。
菌株Alcanivorax dieselolei T6-6产生的赖氨酸脂具有表面活性剂可将水的表面张力降低到26-28mN m-1左右，CMC值(32mg l-1)。
菌株Alcanivorax dieselolei T6-6产生的赖氨酸脂具有较好热、稳定性。
菌株Alcanivorax dieselolei T6-6产生的赖氨酸脂具有优异的表面活性。
菌株Alcanivorax dieselolei T6-6产生的赖氨酸脂具有优异的乳化能力。
菌株Alcanivorax dieselolei T6-6产生的赖氨酸脂对G+及真菌具有抗菌活性。
菌株Alcanivorax dieselolei T6-6可作为赖氨酸脂表面活性剂的生产菌株。
菌株Alcanivorax dieselolei T6-6是从第20航次西南印度洋深海沉积物样品中分离筛选得到。其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)的保藏编号为：CGMCC NO：9033，保藏日期是2014年04月09日。
对菌株Alcanivorax dieselolei T6-6的16S rDNA测序(上海英俊公司测序)，NCBI比对，发现与Alcanivorax dieselolei T6-6相似度最高的菌为Alcanivoraxdieselolei B-5(AY683537),相似性为99.866％。Alcanivorax dieselolei T6-6为γ-变形菌纲，海洋螺菌目，烷烃降解菌科，食烷菌属，柴油食烷菌种。
Alcanivorax dieselolei T6-6菌株的16S rDNA系统发育树如图1所示。
Alcanivorax dieselolei T6-6菌株的16S rRNA基因序列见SEQ ID NO:1,具体为
附图说明
图1是菌株Alcanivorax dieselolei T6-6的16S rDNA系统发育树图。
图2A和图2B是菌株Alcanivorax dieselolei T6-6的烷烃降解率GC-MS图谱。其中图2A是C16降解率GC-MS图谱，图2B是C14降解率GC-MS图谱。
图3是菌株Alcanivorax dieselolei T6-6的生长和表面张力的相互关系图。
图4A是菌株Alcanivorax dieselolei T6-6发酵后产生的活性物质TLC展层碘显色结果图，图4B是菌株Alcanivorax dieselolei T6-6发酵后产生的活性物质TLC展层茚三酮显色结果图。
图5A是化合物dieseloleiT6-6合并后跑HPLC图(210nm峰)，图5B是用来溶解化合物dieseloleiT6-6的甲醇HPLC跑对照图(210nm峰)(此处样品中无活性物质)。
图6是化合物dieseloleiT6-6高分辨质谱图。
图7是化合物dieseloleiT6-6纯品1H-NMR图谱图。
图8是化合物dieseloleiT6-6纯品13C-NMR图谱图。
图9是化合物dieseloleiT6-6纯品1H-1HCOSY图谱图。
图10是化合物dieseloleiT6-6纯品HMBC图谱图。
图11是化合物dieseloleiT6-6纯品HMQC图谱图。
图12是化合物dieseloleiT6-6和化学合成表面活性剂Tween 20和Triton X-100的乳化活性比较图。
图13是pH对化合物dieseloleiT6-6活性的影响图。
图14是温度对化合物dieseloleiT6-6活性的影响图。
图15是菌株A lcanivorax dieselolei T6-6产生的表面活性物质粗提过程图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：菌株的富集和分离培养
分离方法：取50cm3深海(第20航次西南印度洋深海)海水于250cm3的三角瓶中,121℃,20min，加入预先高温高压灭菌的的原油和柴油混合物(按质量比1:1混合)0.21g,然后加入预先高温高压灭菌的NH4NO3(终浓度1g/dm3)和KH2PO4溶液(pH＝7.5,终浓度1g/dm3)和0.22μm滤膜过滤除菌的FeSO4溶液(终浓度0.4μg/dm3)。取50cm3上述所得海水样加入该三角瓶中,置于28℃,160r/min的摇床中避光培养。培养6d后,黑色油污状消失,从中取2cm3转接入相同的培养基中,共转接5次后,最后把富集物进行梯度稀释,涂布于2216L平板上(2216L培养基:NaAc:1g,酵母粉:2g,胰蛋白胨:10g,柠檬钠:0.5g,溶于1dm3陈海水中,调pH至7.5。固体平板添加1.5％琼脂粉。)分离单菌。
最后分离得到一株真菌菌株，将该菌株命名为：T6-6，也即A lcanivoraxdieselolei T6-6。
菌株的鉴定
(一)形态
方法：将菌株接种到2216L平板上，20℃条件下黑暗培养10天，测量菌落直径并记录菌落颜色。A lcanivorax dieselolei T6-6为革兰氏阴性菌，氧化酶和接触酶阳性，能还原硝酸盐，不能还原亚硝酸盐。在2216L平板上生长时，形成特征的菌落：微小，乳白色，边缘半透明状，表面光滑，中央隆起，外型规则，边缘平整，无晕圈；在油镜下则呈短杆状。
(二)菌落PCR及16s rDNA序列
菌落PCR方法：菌株A lcanivorax dieselolei T6-6的DNA提取及16S rDNA的扩增按文献[L iu C,Shao Z.A lcanivorax dieselolei sp.nov.,a novel alkane2degradingbacterium isolated from sea water and deep2sea sedi2ment[J].In te rna tio nal Jo u rna l o f Sys tem a tic and Evo lu tio na ryM ic ro b io lo gy,2006,55:1 181～1 186]进行。16S rDNA用SEQ ID NO:2-3引物进行PCR扩增。
SEQ ID NO:1：
16SF:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’即SEQ ID NO:2；
16SR:5’-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3’即SEQ ID NO:3。
目的片段大小为1500bp左右。PCR所使用的引物由TaKaRa公司合成。PCR反应体系(总体积5.0mm3):10×Buffer 5.0mm3,dNTP(0.2mmol/dm3)4.0mm3,16SR(10pmol/dm3)1.0mm3,16SF(10pmol/dm3)1.0mm3,Taq酶(2U/mm3)0.4mm3,DNA模板(50ng～1μg)1.0mm3,去离子水37.4mm3,PCR扩增的条件:95℃5min,95℃1min,55℃1min,72℃2min,30个循环；72℃5min.以上PCR产物纯化、连接pMD19-T后,转化入E.coliDH5α感受态细胞中,由上海生工完成测序。测序结果在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)进行分析,再通过软件DNAMA(version 5.1)对扩增序列和GenBank中近缘种的序列进行比对,用MEGA3.1建系统发育树。
以柴油和石油为混合碳源经富集培养,从第20航次西南印度洋深海沉积物样品中，共分离到菌株A lcanivorax dieselolei T6-6具有明显的柴油降解能力，单菌验证时培养3d即可将4.2g/dm3的柴油乳化并降解其中大部分成分，仅残留表面一小部分乳化的油滴未降解，可能为一些柴油中的非烷烃成分，对此菌株进行了鉴定。本菌株已于2014年4月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏编号为：CGMCC NO：9033。
本实验扩增到的16S rDNA在Genebank上的注册号见图1系统发育树上所示。
对菌株A lcanivorax dieselolei T6-6的形态分析及16S rDNA测序分析，证明Alcanivorax dieselolei T6-6为γ-变形菌纲，海洋螺菌目，烷烃降解菌科，食烷菌属，柴油食烷菌种。16S rDNA系统发育树如图1。
实施例2：菌株A lcanivorax dieselolei T6-6的烷烃降解能力试验
烷烃降解率测试方法：将菌A lcanivorax dieselolei T6-6从新鲜的平板中刮取到加有MMC培养基(配方：NaCl 24g/l，MgSO4·7H2O 7.0g/l，NH4NO3 1.0g/l，KCl 0.7g/l，KH2PO42.0g/l，Na2HPO4 3.0g/l，PH7.4,蒸馏水1L，灭菌后补加适量经0.22um滤膜过滤除菌的微量元素混合液(CaCl2 2mg/l；FeCl3·6H2O,50mg/l；CuSO4,0.5mg/l；MnCl2·4H2O,0.5mg/l；ZnSO4·7H2O,10mg/l)的灭菌EP管中，混匀按一定的菌浓度平均分别加入装有50ml MMC培养基的150ml锥形瓶中(每种烷烃均设有两个平行对照)选取烷烃C12，C14，C16，C18按1％加入MMC液体培养基中培养观察。烷烃降解率(％)＝(1-发酵液中残留量/空白对照样中残留量)×100％，根据内参氯代十二烷2ul,1ul,0.5ul,0.25ul,0.125ul做出标准曲线，加了C12，C14，C16，C18但不加菌A lcanivorax dieselolei T6-6的为空白对照。用9ml正己烷加入到发酵瓶中，在摇床上180转/分钟，摇30min,静置分层，取下层正己烷相。用10ml容量瓶定容至10ml,取部分样品稀释到10-9，此样品用来做GC-MS。同时C12，C14，C16，C18也作出相应的标准曲线，求出各烷烃降解率结果见表2。
菌株A lcanivorax dieselolei T6-6能利用C 10-C36的直链烷烃，其中对C18及其以下的烷烃的降解效果较好。因此选取C12、C14、C16、C18四种烷烃测定A lcanivoraxdieselolei T6-6对这几种烷烃的降解率。GC-MS分析结果表明，C16的降解率最高，达到92.3％，对其余三种烷烃降解率相近，在50％左右，具体结果见表2和图2A和2B。
表2菌株A lcanivorax dieselolei T6-6对烷烃的降解率与菌体生长表
烷烃 降解率(％) OD600
正十二碳烷烃 57.46±2.5 1.62±0.06
正十四碳烷烃 50.28±0.6 1.55±0.05
正十六碳烷烃 92.03±0.5 2.69±0.02
正十八碳烷烃 46.62±0.9 1.53±0.05
“±”三次实验误差
菌株Alcanivorax dieseloleiB-5(AY683537)在相同试验条件下，具有烷烃降解能力。
实施例3：菌株A lcanivorax dieselolei T6-6细胞表面疏水性试验
将菌株A lcanivorax dieselolei T6-6的发酵液用磷酸盐缓冲液(pH 7.0)1：1体积洗涤，室温离心(12000rpm，3min)，收集菌体。重复冲洗三次，最后将细胞悬浮于4ml磷酸盐缓冲液中，调整紫外可见光分光光度计A600＝0.5左右，测定的具体值为A0。之后将测过A0的样品分六份分别加入疏水物质原油、对-二甲苯、正十六烷、正十八烷、矿物油、液体石蜡各1ml，放入振荡器上震荡2min，静止30min后分层，用注射针头插入下层吸取2ml液体，在分光光度计测定其A值记做A1。细胞表面疏水性的强弱可以用公式：H％＝(A0-A1)/A0×100来表示。H值越大,细胞表面疏水性越大。与已报道的一株Myroidessp.SM1的菌体表面疏水性的比较分析表明，菌株A lcanivorax dieselolei T6-6对多种有机物(液体石蜡除外)都能呈现良好的细胞表面疏水性，且比Myroides sp.SM1有着更强菌体表面疏水。本文件中菌株A lcanivorax dieselolei T6-6有时候简称T6-6，有时候简称A.dieselolei T6-6。
结果如下表3。
表3菌株A lcanivorax dieselolei T6-6的细胞表面疏水性的测定表(％)
疏水底物(烃类) Myroides sp.SM1 T6-6
原油 85.48 68.88±1.2
对-二甲苯 28.07 32.24±0.5
正十六烷 14.62 62.61±0.8
正十八烷 0.13 78.52±1.5
矿物油 3.78 72.45±1.2
液体石蜡 5.23 7.66±0.8
注：Myroidessp.SM1的数据来自Songklanakarin J.Sci.Technol.,2007,29(3):769-779
“±”三次实验误差
实施例4：菌株A lcanivorax dieselolei T6-6菌体生长与表面张力的关系分析试验
液体表面张力的测定方法：将A lcanivorax dieselolei T6-6单菌在超净工作台中接种于MSM培养基(2％的正十六烷为唯一碳源)中，于恒温空气浴震荡培养箱(28℃，200rpm/min)培养，直到有菌体明显生长(约3～5d)，期间每24h取10ml发酵液，用自动界面张力仪(厂家:承德精密试验机有限责任公司制造；型号：JZ-200A自动界面张力仪)测其表面张力值。取菌株A lcanivorax dieselolei T6-6的发酵菌液10mL置于测量杯中，擦干外壁，置于表面张力计的操作平台上，吊环事先用纯净水冲洗数遍，置于石油醚中漂洗，接着用丙酮漂洗，吹风使吊环表面附着的丙酮溶液迅速挥发，最后将吊环放置于操作平台上进行测量。测量之前注意环境的温度，一般保持在25℃左右。(若是冷冻离心后分层的上清和疏水层则要等到其恢复室温再测表面张力值，这样的结果才有可比性和可信性)。测量液体表面张力时，25℃的菌株A.dieselolei T6-6发酵液倒入称量杯中，体积10ml，将称量瓶放置于托盘的中心位置，按“▲”键，使铂金环深入至液体中5mm到7mm处，按“●”停止，此时若需要峰值保持则可按“峰值”键，再按“▼”，显示值将逐渐增大，最终保持在最大值，该最大值就是液体的实测表面张力值，然后按“●”停止，最大值被记录后按“复位“键。将表面张力值低于40mN m-1并且有明显排油活性的富集液经梯度稀释、HLB平板(NaCl 3％)分离，得到纯培养，并进行单菌表面活性分析。
以十六烷为唯一碳源的MSM培养基(配方：(NH4)2SO4＝1g；KCl＝0.11g；NaCl＝0.11g；FeSO4·7H2O＝2.8×10-5g；无水KH2PO4＝0.34g；K2HPO4·13H2O＝0.44g；MgSO4·7H2O＝0.05g；酵母膏＝0.05g；微量元素溶液0.5mL；正十六烷2mL,pH 7.4),28℃,150rpm/min,培养3-5天。
微量元素溶液(％)：ZnSO4·7H2O＝0.029g；CaCl2＝0.024g；CuSO4＝0.025g；MnSO4·H2O＝0.017g。
发酵菌株Alcanivorax dieselolei T6-6，在120h内每12h测定一次发酵液表面张力及OD600值。结果表明菌株Alcanivorax dieselolei T6-6发酵产物中的活性物质主要在菌体生长的对数期开始产生，并且在稳定期时达到表面张力最低值26.0mN m-1。结果见图3。
菌株Alcanivorax dieseloleiB-5(AY683537)在以正十六烷为唯一碳源的MSM培养基中生长良好并能将发酵液的表面张力降至31mN m-1左右，方法步骤同上。
实施例5：菌株Alcanivorax dieselolei T6-6发酵产物的分离纯化
菌株A lcanivorax dieselolei T6-6的MSM液体培养基(2％的正十六烷为唯一碳源，其他成分见实施例2)培养5天后,发酵液表面张力为27mNm-1左右。发酵液于12000rpm、4℃下离心20min后，由上至下分为三层：乳白色疏水层、上清和菌体沉淀。这三层的表面张力测定结果分别为：疏水层为27.2mNm-1；上清为31.3mNm-1；菌体为59.2mNm-1。由此判定，菌株Alcanivorax dieselolei T6-6产生的表面活性物质主要存在于疏水层和上清中，粗提的过程见附图15：
将菌株Alcanivorax dieselolei T6-6疏水层抽提后的有机相(27.8mNm-1)和菌株A lcanivorax dieselolei T6-6的上清酸沉淀冻干抽提后的有机相(28.1mNm-1)合并，跑TLC板后再用酸性茚三酮显色，与碘显色比较，大部分物质为脂肽类，然后HPLC测试活性物质的极性大小，根据HPLC结果和跑TLC板结果确定过正相硅胶柱的洗脱溶剂及其洗脱梯度。
目标活性物质后续的分离纯化的过程为先过正相硅胶柱，然后过反相硅胶柱，最后过凝胶柱进一步纯化制备分离好的样品。过正相柱洗脱剂的比例依次是100％氯仿，氯仿：甲醇＝50:1,氯仿：甲醇＝10:1,氯仿：甲醇＝4:1,100％甲醇。洗脱体积根据样品的量有所不同，一般是2-3个柱体积。正相柱过两遍基本可以把非脂肽类物质除去，将脂肽类组分用HPLC检测其极性大小及吸收峰范围。根据HPLC结果设定过反相柱的条件。过反相用的是AKTAPurifier10接反相柱，设210nm和254nm两个检测波长，设连续梯度洗脱(连续梯度0-100％甲醇，流速10ml/min)，到100％甲醇后继续冲30分钟，之后用纯乙腈冲40分钟，根据出峰顺序接了八个组分，其中第七个组分峰高为3.02AU，持续时间为4.5分钟左右，洗脱梯度为92％-93％的甲醇。第一个组分的峰高为4.5AU，持续时间为2.5分钟左右，洗脱梯度为5％左右的甲醇，测这两个峰较高的组分的表面张力，结果1号组分没有降低表面张力的作用，而7号组分的表面活性很好，在20mlDDW中加入300ul未浓缩的样品表面活性物质使水的表面张力有78.6降至32.3，拿7号成分进行HPLC纯化，结果显示很纯，因此没必要过凝胶柱。最终样品是否为纯品需多种不同极性的展层剂检测确定是否为同一个点，分别用100％氯仿，氯仿：甲醇＝3:1，氯仿：甲醇＝2:1，氯仿：甲醇＝1:1和100％甲醇作为展层剂展层，碘显结果均为一个单一的点，因此将物质蒸干进行核磁检测。分离的整个过程中均将化学显色和活性检测作为跟踪的指标，表面活性高的则进一步分离。菌株A lcanivorax dieseloleiT6-6发酵后产生的活性物质过完两次正向柱后所收集的组分点样后展层分别用碘蒸汽和茚三酮显色，结果见TLC展层碘显色结果(图4A)图和茚三酮显色结果(图4B)图，由显色结果来看，过完两次正向柱后的表面活性物质已经比较纯了，只有少部分极性更强的杂质跑到展层剂的边缘，为此将7号和8号两组合并，合并后的活性物质过HPLC，菌株A lcanivoraxdieselolei T6-6发酵液提取到表面活性物质的HPLC柱的图谱(检测波长为210nm)见附图3。图5A是T6-6合并后的活性物质跑HPLC图(210nm峰)，图5B是跑甲醇对照(210nm峰)。两图中5分钟之前出的是溶剂峰，活性物质在图5A的18分钟出峰。
实施例6：菌株A lcanivorax dieselolei T6-6发酵后所产表面活性物质的化学成分鉴定
(1)用FT-MS确定活性物质(实施例5所得)的分子量
傅立叶变换离子回旋共振质谱仪(FT-MS)结果显示主要的分子离子峰为[M+H]+:383.32765，[M+Na]+：405.30854、[M+Kcl]+：421.28506，其中，[M+H]+和[M+Na]+的理论值分别为383.3268和405.3088，实际测得的数值与理论值的误差分别为2.2ppm和0.6ppm,一般实验误差小于5ppm数据是可靠的。因此，菌株A lcanivorax dieselolei T6-6所产的脂肽的分子量理论值为382.32。
结合高分辨质谱分析仪比对结果，该物质只含有C、H、O、N四种元素，且根据质谱图6结果，分子量为382.32，经过比对，在<5ppm的误差范围内只有一种分子式可能即C22H42N2O3，这与NMR推出的分子式完全一致。分析结果见表4。
表4菌株A lcanivorax dieselolei T6-6产生的生物表面活性剂(十六烷为唯一碳源)的FT-MS结果分析表
脂肽 分子量
[M+H]+ 383.32765
[M+Na]+ 405.30854
[M+Kcl]+ 421.28506
(2)NMR图谱分析
核磁共振图谱(NMR图谱)分析的结果进一步验证了FT-MS对菌株A lcanivoraxdieselolei T6-6产生的脂肽的化学分子式为C22H42N2O3。其脂肪酸部分为β-羟基-十六烷酸，是带β-羟基的十六碳酸，氨基酸部分为赖氨酸。赖氨酸的氨基与十六碳酸的羧基脱水缩合形成酰胺键，赖氨酸的亚氨基与十六碳酸的β-羟基反应形成了一个含氮的β-内酰胺四元环。在已知的环状脂肽类表面活性剂中还没有单独的氨基酸与脂肪酸形成环的报道。
该物质带有酰胺键、氨基和羧基三个极性基团，亲水端极性较强。经过比对，该物质为新结构表面活性剂。
化合物dieseloleiT6-6纯品的1H-NMR图谱如图7所示，化合物dieseloleiT6-6纯品的13C-NMR图谱如图8所示。
化合物dieseloleiT6-6纯品的核磁共振氢谱数据：
1H NMR(600MHz,CD3OD-d4)δH
3.68(2H,m,H-8),3.55(1H,t,J＝6.0,Hz,H-2),3.35(1H,m,H-6a),3.10(1H,m,H-6b),3.01(1H,dd,J＝4.8,14.7Hz,H-9a),2.54(1H,dd,J＝1.2,14.7Hz,H-9b),1.91(1H,m,H-10a),1.47(1H,m,H-10b),1.91(1H,m,H-3a),1.84(1H,m,H-3b),1.63(2H,m,H-5),1.47(2H,m,H-4),1.38(2H,m,H-11),1.32(16H,m,H-12～19),1.32(2H,m,H-21),1.31(2H,m,H-20),0.92(3H,t,J＝6.9Hz,H-22)
化合物dieseloleiT6-6纯品的核磁共振碳谱数据：
13C NMR(151MHz,CD3OD-d4),δc
172.9(C-1),168.7(C-7),54.6(C-2),51.9(C-8),40.9(C-9),39.9(C-6),32.4(C-10),31.7(C-20),30.4(C-3),29.1～29.38(C-12～19),27.4(C-5),25.1(C-11),22.5(C-4),22.3(C-21),13.0(C-22)；ESIMS m/z 383.32765[M+Na]+
化合物dieseloleiT6-6纯品的1H-1HCOSY图谱如图9所示；化合物dieseloleiT6-6纯品的HMBC图谱如图10所示；化合物dieseloleiT6-6纯品的HMQC图谱如图11所示。
结合FT-MS和NMR的数据具体见附图7-11，推出菌株A lcanivorax dieseloleiT6-6发酵后所产的新化合物结构如下：
新化合物中文普通命名为：dieseloleiT6-6，中文系统命名为：2-氨基-6-(N-2-氧代-4-十三烷基-环丁烷)己酸,英文系统命名为：2-amino-6-(2-oxo-4-tridecyl-azetidine-1-yl)hexanoic acid，为一种赖氨酸脂。
利用上述相同的分离方法分离时，目标活性物质后续的分离纯化的过程为先过正相硅胶柱，然后过反相硅胶柱，最后过凝胶柱进一步纯化制备分离好的样品。过正相柱洗脱剂的比例依次是100％氯仿，氯仿：甲醇＝50:1,氯仿：甲醇＝10:1,氯仿：甲醇＝4:1,100％甲醇。洗脱体积根据样品的量有所不同，一般是2-3个柱体积。正相柱过两遍基本可以把非脂肽类物质除去，将脂肽类组分用HPLC检测其极性大小及吸收峰范围。根据HPLC结果设定过反相柱的条件。过反相柱用的是AKTA Purifier10接反相柱，设210nm和254nm两个检测波长，设连续梯度洗脱(连续梯度0-100％甲醇，流速10ml/min)，从0％甲醇开始极性强的物质先洗脱下来，极性弱的后洗脱下来，洗脱下来物质的顺序即下表中n＝1-4的顺序，到100％甲醇后继续冲30分钟，之后用纯乙腈冲40分钟。这一类化合物的结构式如下：
表9各化合物的洗脱条件表
实施例7：菌株Alcanivorax dieselolei T6-6所产的脂肽表面活性剂理化性质的测定
为了了解菌株A lcanivorax dieselolei T6-6发酵后所产表面活性剂(也即dieseloleiT6-6)的理化性质和功能，测定了纯化后的赖氨酸脂(也即dieseloleiT6-6)的CMC值、MAD值。同时还测试了赖氨酸脂在不同温度和pH下扩油圈的大小以验证该物质的稳定性，对不同有机物的乳化效率。
生物表面活性剂CMC值的测定方法：将待测的生物表面活性剂纯品，配成各种浓度的水溶液，用表面张力仪于室温下测定其表面张力。随着表面活性即浓度的增加，水溶液的表面张力会逐渐增加，当浓度增加到一定量时水溶液的表面张力便停止下降，这个临界的表面张力对应的表面活性剂的量即为其CMC值。结果见表5：
表5扩油实验比较几种表面活性剂的CMC值表
表面活性剂 CMC(mg/l)
菌株Alcanivorax dieselolei T6-6所产赖氨酸脂 32
鼠李糖脂 50
Surfactin 45
SDS 23
生物表面活性剂MAD(Minimum Active Dose)值测定方法：将待测的生物表面活性剂纯品配成各种浓度的水溶液，用扩油实验测定其扩油活性。随着浓度的降低，水溶液的扩油能力会越来越弱，当浓度降低到一定程度时扩油能力便彻底消失，这个扩油能力消失时的表面活性剂的量即为其MAD值。结果见表6。
表6扩油实验比较几种表面活性剂的MAD值表
“±”：三次实验误差
为了了解菌株Alcanivorax dieselolei T6-6所产赖氨酸脂的乳化活性，测定了菌株Alcanivorax dieselolei T6-6所产赖氨酸脂和化学表面活性剂Tween 20和TritonX-100对橄榄油、正己烷、二甲苯、十六烷、石油醚的乳化稳定值。生物表面活性剂乳化性能的测定方法：取一试管，加5ml市售零号柴油和5ml表面活性剂溶液(1％)，用超声波发生器于800W处理40s,在不同时间(0至24小时)测量乳化液和油相。乳化稳定值(Es％)＝乳化层高度(cm)/油相高度(cm)×100。具体结果见图12。菌株Alcanivorax dieselolei T6-6所产赖氨酸脂的乳化活性测试结果表明它与化学表面活性剂Tween 20和Triton X-100比较有更高的乳化活性。菌株Alcanivorax dieselolei T6-6所产赖氨酸脂对橄榄油有83±1％的良好乳化能力，而且在室温下持续稳定48h，对其他四种有机物的乳化活性也在75％以上。良好的乳化活性使得其在环境污染治理方面有巨大的应用价值。
对菌株A lcanivorax dieselolei T6-6所产赖氨酸脂在不同温度和pH下的活性测试(扩油实验)实验表明其有很好的热稳定性和酸碱耐受性，如图13和14所示。生物表面活性剂扩油活性测定方法：取一培养皿,加水,水面上加0.1ml正十六烷形成油膜。在油膜中心加摇瓶发酵液,中心油膜被挤向四周形成一圆圈,圆圈的直径与表面活性剂含量和活性成正比。圆圈直径大于3cm的菌株保留作进一步的研究。测试pH对菌株A lcanivoraxdieselolei T6-6所产赖氨酸脂的影响时，设置2到10的pH范围，菌株A lcanivoraxdieselolei T6-6所产赖氨酸脂的扩油直径在3.6～3.9cm之间变化，波动很小，具有很好的酸碱耐受性，且在pH＝8时处于最高活性。结合物质的结构可知该物质显碱性，同时跑TLC板时加入几滴氨水展层会使物质展开得更充分，这也证明物质显碱性。
将菌株A lcanivorax dieselolei T6-6所产赖氨酸脂纯品置于20℃，40℃，60℃，80℃和100℃处理1h，之后测定活性，发现其扩油直径在3.7～4.1cm，活性并无明显改变。不过样品在121℃高温下处理15min后扩油直径有轻微缩小，为3.5cm，说明活性有轻微降低。物质具有很好的热稳定性能使之应用在高温度领域成为可能。
实施例8：菌株A lcanivorax dieselolei T6-6所产赖氨酸脂抗菌活性和细胞毒活性测试
抗菌活性测试方法：用滤纸片法测试菌株A lcanivorax dieselolei T6-6发酵产生的表面活性剂是否有抗菌活性，指示菌为多株革兰氏阴性菌，阳性菌，茶树内生致病真菌，酵母菌。具体操作步骤为在培养平板中涂布摇好的指示菌，然后在划好的区域里分别贴上滤纸片，在滤纸片上在滴加表面活性剂-，对照为等量的溶剂甲醇。28℃恒温培养箱倒置培养一定时间(不同的指示菌的生长周期不一样，细菌长得很快，而茶树内生真菌则需要长3-5天)，观察结果，有无抑菌圈，有抑菌圈则要测量抑菌圈的大小。
抑菌实验结果表明，菌株A lcanivorax dieselolei T6-6所产的活性物质对6株芽孢杆菌等革兰氏阳性菌、2株植物病原真菌和1株酵母菌，均有较好的抗菌活性，而对E.coli.DH5α、嗜水气单胞菌、坎贝氏弧菌等革兰氏阴性菌无抑制效果。
具体结果见表7。
表7抑菌实验结果表
细胞毒活性测试方法：使用Cell Counting Kit-8简称CCK-8试剂盒(日本同仁化学研究所)，即人胆囊收缩素八肽酶联免疫吸附测定试剂盒测定细胞毒活性，其原理为，是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。
WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。对照为溶剂DMSO，实验组为用DMSO溶解的菌株A lcanivorax dieselolei T6-6所产赖氨酸脂纯品，细胞采用肝癌细胞7402和正常肝细胞7702(可购自中美合资博慧斯生物医药科技有限公司)，加药的浓度为100ug/ml,按照试剂盒步骤操作，每个做了三个重复，加药后细胞培养48h测定细胞液OD600。细胞毒实验结果见表8：
表8细胞毒实验结果表
药物对细胞的抑制率＝[阴性组(DMSO)-实验组(加药)]/阴性组(DMSO)，将表8中的数据代入公式后计算出菌株Alcanivorax dieselolei T6-6所产赖氨酸脂活性物质对肝癌细胞7402的抑制率为92.74％，对正常肝细胞7702的抑制率为67.32％。可以看出菌株Alcanivorax dieselolei T6-6所产赖氨酸脂活性物质有较好的细胞毒活性。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (9)

1.一株海洋石油降解菌柴油食烷菌(Alcanivorax dieselolei)T6-6，保藏编号为：CGMCC NO：9033。
2.权利要求1所述柴油食烷菌(Alcanivorax dieselolei)T6-6用于石油烃的降解与清除的用途。
3.权利要求1所述柴油食烷菌(Alcanivorax dieselolei)T6-6用于环境污染的治理的用途。
4.权利要求1所述柴油食烷菌(Alcanivorax dieselolei)T6-6用于降低水的表面张力的用途。
5.权利要求1所述柴油食烷菌(Alcanivorax dieselolei)T6-6用于生产生物表面活性剂的用途。
6.权利要求1所述柴油食烷菌(Alcanivorax dieselolei)T6-6用于制备革兰氏阳性细菌及真菌的抗菌抑菌的药物的用途。
7.一种由权利要求1所述柴油食烷菌(Alcanivorax dieselolei)T6-6发酵生产的一类化合物，其特征在于，这类化合物的结构式如下：
当n＝1时，分子式为C18H34N2O3，分子量为326，命名为2-氨基-6-(N-2-氧代-4-壬基-环丁烷)己酸；当n＝2时，分子式为C20H38N2O3，分子量为354，命名为2-氨基-6-(N-2-氧代-4-十一烷基-环丁烷)己酸；当n＝3时，分子式为C22H42N2O3，分子量为382，命名为2-氨基-6-(N-2-氧代-4-十三烷基-环丁烷)己酸，又叫赖氨酸脂dieseloleiT6-6；当n＝4时，分子式为C24H46N2O3，分子量为410，命名为2-氨基-6-(N-2-氧代-4-十五烷基-环丁烷)己酸。
8.权利要求7所述的一类化合物，其特征在于，所述赖氨酸脂dieseloleiT6-6，分子式为C22H42N2O3，是通过权利要求1所述的菌株发酵制备得到，其结构式为:
9.权利要求7所述的一类化合物中赖氨酸脂dieseloleiT6-6用于乳化有机物和制备革兰氏阳性细菌及真菌的抗菌抑菌的药物的用途。
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