CN104479043A - 一种鼠李糖乳杆菌的胞外多糖及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鼠李糖乳杆菌的胞外多糖及其制备方法和应用。该胞外多糖由质量分数比为45.13～47.80％的葡萄糖、35.26～36.17％的鼠李糖和16.94～18.70％的半乳糖组成，该胞外多糖由式I所示重复结构单元组成，
Description
本申请要求申请日为2013年12月27日的中国专利申请CN201310743058.0的优先权。本申请引用该中国专利申请的全文。
技术领域
本发明涉及一种鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)的胞外多糖及其制备方法和应用。
背景技术
乳酸菌(Lactic acid bacteria)是一类能利用可发酵性糖产生大量乳酸的细菌总称，目前在自然界已发现的这类细菌在分类学上至少有23个属。在食品、医药等领域应用较多的乳酸菌主要有乳杆菌属、链球菌属、肠球菌属、乳球菌属、片球菌属和明串珠菌属等。乳酸菌是益生菌最主要的来源，许多乳酸菌是人体肠道固有的益生菌，具有改善人体肠道菌群，调节机体免疫力，抑肿瘤，降低血清胆固醇，调节血压等重要的生理活性。
乳酸菌发挥主要功能特性的作用机理，除了定殖、通过主要代谢产物(乳酸等)改善肠道内环境等以外，一些次生代谢产物如细菌素、胞外多糖等也发挥着非常重要的作用。其中，具有理论和实际应用价值的乳酸菌胞外多糖引起了国内外许多学者的研究兴趣。
乳酸菌胞外多糖是乳酸菌产生并分泌到细胞外的一种多糖。乳酸菌胞外多糖具有重要的工艺学功能，对酸乳、干酪及绝大多数发酵乳制品的流变性质、质构、口感以及风味具有重要的影响。乳酸菌胞外多糖可以改善乳制品的流变学特性和质构特性。由于天然增稠作用，由产粘乳杆菌与非产粘球菌混合发酵形成的酸乳与非产粘菌株形成的酸乳相比口感滑润、粘度增加；产胞外多糖乳酸菌能够赋予酸乳更强的持水力，从而避免乳清析出；此外，由胞外多糖而产生的持水性增强有助于提高干酪等产品的得率。乳酸菌胞外多糖还具有良好的生理功能，如增强黏膜吸附作用、抗肿瘤、抗溃疡、免疫调节、降胆固醇、降血压，还可以作为益生元促进肠道内其他益生菌的生长，优化肠道微生态环境等。因此，开展产胞外多糖乳酸菌的研究，对于改善乳制品生产加工、开发具有特定功能性质的乳酸菌发酵乳制品，具有十分重要的研究意义和经济价值。开发具有益生功能的乳酸菌胞外多糖成为目前研究的热点。
20世纪60年代以来，多糖被认为是一种广谱的非特异性的免疫促进剂，可增强宿主细胞的细胞免疫和体液免疫功能，如激活巨噬细胞、T细胞、B细胞和NK细胞等，激活补体及诱导产生干扰素等，其作用将是激活人体的非特异性防御机能，在抗病毒、抗肿瘤、抗辐射等方面有很好的疗效。
然而，目前在本领域内，研究成熟的并且能够在实践中推广应用的乳酸菌胞外多糖的种类并不多，生产和科研上都存在对新的胞外多糖进行研究的需要，以丰富性能优良、用途广泛的乳酸菌胞外多糖的种类。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对目前乳酸菌胞外多糖种类和产品功能不够丰富的现状，而提供一种新的乳酸菌胞外多糖，具体为一种鼠李糖乳杆菌的胞外多糖，本发明还提供所述胞外多糖的制备方法和应用。本发明的胞外多糖被证明具有良好的有丝分裂原活性和免疫调节活性。
本发明所述的鼠李糖乳杆菌的胞外多糖最初发现由保藏编号为CGMCCNo.6430的鼠李糖乳杆菌所产生。所述的保藏编号为CGMCC No.6430的鼠李糖乳杆菌筛选自健康成年人的粪便，在发酵乳中能够产生胞外多糖。本发明人在研究中发现该菌株具有良好的耐酸耐胆盐性能，其具有潜在的益生功能，并且体外细胞实验发现其粗多糖可以提高小鼠T/B淋巴细胞的活性，其具有潜在的提高机体免疫力的功能。为了更好地了解其结构和功能，对其粗多糖进行分离纯化及其功能研究。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏，其保藏编号为CGMCC No.6430。在此基础上，本发明提供下述技术方案。
本发明提供的技术方案之一是：一种鼠李糖乳杆菌的胞外多糖，所述胞外多糖由质量分数比为45.13～47.80％的葡萄糖、35.26～36.17％的鼠李糖和16.94～18.70％的半乳糖组成，该胞外多糖由式I所示的重复结构单元组成，
→1)-α-D-葡萄糖(2→1)-α-L-鼠李糖(3→1)-α-L-鼠李糖(3→1)–(接下行)
α-L-鼠李糖(3→1)-β-D-葡萄糖(3→1)-β-D-半乳糖(3→
该胞外多糖的平均重量分子量为98万～147万道尔顿。
本发明中，所述的胞外多糖可以由保藏号为CGMCC NO.6430的鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)菌株产生，但不限于此，也可以由其它的可以产胞外多糖的菌株产生。较佳地，所述的胞外多糖由前述保藏号为CGMCC NO.6430的鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)菌株所产生。
本发明中，所述的胞外多糖具有由1,2-α-D-葡萄糖，1,3,4-α-L-鼠李糖，1,3-鼠李糖，1,2,3-α-L-鼠李糖，1,3-β-D-葡萄糖和1,3,6-β-D半乳糖按1:1:1:1:1:1比例构成的主链，在所述的1,3,6-β-D半乳糖的6位连接着丙酮酸盐。
本发明中，所述的胞外多糖的平均重量分子量较佳地为980,543～1,470,237道尔顿。
本发明提供的技术方案之二是：前述鼠李糖乳杆菌的胞外多糖的制备方法。
本发明中，所述的制备方法可以是将所述的鼠李糖乳杆菌按照现有技术内常规的培养方法培养得到发酵液，然后将发酵液采用常规的多糖分离方法分离得到胞外多糖。
较佳地，所述的制备方法包括如下步骤：
(1)将保藏编号为CGMCC No.6430的鼠李糖乳杆菌的种子液以体积比1.0～5.0％的接种量接种于无菌脱脂乳培养基，于28～36℃培养24～40小时得发酵液；
(2)将步骤(1)所得的发酵液在95～100℃加热10～30min，冷却至15～25℃后静置3～16小时，离心取上清并向所述上清中加入三氯乙酸溶液至终浓度为5～8％，静置8～16小时，离心获得发酵上清液；所述百分比为每100毫升中含有的三氯乙酸的克数，所述三氯乙酸溶液是质量百分数为75～85％的三氯乙酸溶液；
(3)向步骤(2)所得的发酵上清液中加入2～4倍体积的体积百分数为80～100％的乙醇，离心或过滤收集沉淀物并将沉淀物溶于水，用截留分子量为5000～14000道尔顿的透析袋在水中透析48～72小时，每8～12小时换水一次，在温度不超过105℃下干燥或者真空冷冻干燥，即得所述胞外多糖的粗品。
本发明步骤(1)中，所述的无菌脱脂乳培养基为本领域常规所述的无菌脱脂乳培养基，较佳地是将10～12重量份脱脂乳和0.8～1.2重量份葡萄糖溶解于85～90重量份的水中，于115～125℃灭菌15～20分钟，冷却至15～25℃所得的无菌脱脂乳培养基。所述的接种量较佳地是2.0～4.0％，更佳地是2.0～2.5％。其中，发酵的时间较佳地是24～36小时，更佳地是28～32小时。
本发明步骤(2)中，所述的加热较佳地为将步骤(1)所得的发酵液在95～100℃加热15～20min。所述的三氯乙酸的质量百分数较佳地为78～82％。
本发明步骤(3)中，所述的乙醇的体积百分数较佳地为82～90％。所述透析袋的截留分子量较佳地为12000～14000道尔顿。
本发明所述的制备方法更佳地还包括步骤(4)，即对步骤(3)所得的胞外多糖的粗品进行进一步的分离纯化的步骤；
所述的步骤(4)为：采用离子交换层析柱对步骤(3)所得的胞外多糖的粗品进行分离纯化，依次以45～55mM，pH 7.5～7.8的Tris-HCl缓冲液和含0.2～1.2M NaCl的45～55mM，pH 7.5～7.8的Tris-HCl缓冲液进行线性梯度洗脱，洗脱速度为2.5～3.5mL/min，合并收集第二个组分峰的洗脱产物，装入截留分子量为10000～15000道尔顿的透析袋在去离子水透析中48～72小时，每8～12小时换水一次，在温度不超过105℃下干燥或者真空冷冻干燥，即得所述胞外多糖。
本发明优选步骤(4)为：采用DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱对步骤(3)所得的胞外多糖的粗品进行分离纯化，所述离子交换层析柱的规格为D 2.6cm×30cm，依次以50mM，pH 7.6的Tris-HCl缓冲液和含0.5～1.0M NaCl的50mM，pH 7.6的Tris-HCl缓冲液进行线性梯度洗脱，洗脱速度为3mL/min，合并收集第二个组分峰的洗脱产物，装入截留分子量为14000道尔顿的透析袋在去离子水透析中72小时，每8小时换水一次，在温度不超过105℃下干燥或者真空冷冻干燥，即得所述胞外多糖。
本发明提供的技术方案之三是：前述鼠李糖乳杆菌的胞外多糖在食品、医药和相关领域的应用。
本发明所述的胞外多糖具有一定的免疫活性，在食品、医药和相关领域具有良好的应用前景。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明所述的胞外多糖为一种组成明确、具备一定免疫调节作用的新型多糖，其可作为添加剂应用于制药、临床等相关领域中，应用前景十分广阔。作为微生物产生的高分子物质，本发明的胞外多糖具有多种生物学效应，如免疫刺激和免疫抑制活性，其可以通过刺激特定免疫细胞的增殖，增强机体的免疫作用，在应用时对于剂量的确定及应用的范围也更为明确，具有显著的技术优势。
附图说明
图1为CGMCC No.6430胞外多糖粗品的凝胶层析洗脱曲线图。
图2为CGMCC No.6430胞外多糖单一组分S1凝胶柱层析洗脱曲线图。
图3为CGMCC No.6430胞外多糖单一组分S1的高效液相图谱。
图4为CGMCC No.6430胞外多糖单一组分S1单糖组成的离子色谱图。
图5为CGMCC No.6430胞外多糖单一组分S1对淋巴细胞增殖作用的结果图。
图6为CGMCC No.6430胞外多糖单一组分S1的600MHz 1H NMR谱图。
图7为CGMCC No.6430胞外多糖单一组分S1的600MHz 13C NMR谱图。
图8为CGMCC No.6430胞外多糖单一组分S1的600MHz DEPT 13CNMR谱图。
图9为CGMCC No.6430胞外多糖单一组分S1的HSQC谱图。
图10为CGMCC No.6430胞外多糖单一组分S1的COSY谱图。
图11为CGMCC No.6430胞外多糖单一组分S1的TOCSY谱图。
图12为CGMCC No.6430胞外多糖单一组分S1的NOESY谱图。
图13为CGMCC No.6430胞外多糖单一组分S1的HMBC谱图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明中所述的鼠李糖乳杆菌CGMCC No.6430筛选自健康成年人的粪便(其已经在专利CN 102994432A中公开)，其在MRS琼脂平板(MRS培养基，乳杆菌选择性培养基，Merck，Germany)上形成光滑、湿润、圆形的菌落，用接种环轻轻接触菌落表面，能形成很长的拉丝，具有良好的拉丝性能。
本发明利用鼠李糖乳杆菌CGMCC No.6430在发酵乳中产胞外多糖，提取粗多糖，并利用离子色谱层析和凝胶色谱层析对其分离纯化，制备得到单一多糖组分，并研究其多糖的部分物化性质以及生物活性。
本发明中所述的室温是指进行试验的操作间的温度，一般为20-25℃。
实施例1胞外多糖的制备
从37℃、厌氧培养48h的MRS琼脂平板上挑取新鲜培养的鼠李糖乳杆菌CGMCC No.6430菌落，转接到添加2％(w/v)葡萄糖的12％(w/w)的无菌脱脂乳培养基中，32℃培养20h，获得种子液。然后按1％体积比的接种量转接到上述无菌脱脂乳培养基中，36℃发酵40h，获得鼠李糖乳杆菌CGMCCNO.6430的发酵乳。发酵乳于95℃加热30min，待冷却至室温后，离心(4℃、14,000g、20min)除去菌体和凝结蛋白；于上清液中加入85％(w/w)的三氯乙酸至终浓度8.0％(w/v)静置过夜，离心(4℃、14,000g、20min)除去沉淀蛋白；取上清液加入4倍体积的80％乙醇，4℃静置过夜，离心(4℃、14,000g、20min)收集沉淀，溶解于去离子水中并装入截留分子量为8000道尔顿的透析袋内，用去离子水透析48h，每12h换水一次，在温度不超过105℃下干燥或者真空冷冻干燥，即得胞外多糖的粗品A。
采用DEAE-Sepharose Fast Flow(D 2.6cm×30cm)离子交换柱分离胞外多糖的粗品A，用45mM Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液平衡柱子。胞外多糖的粗品A用上述45mM Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液溶解后上样，依次用Tris-HCl缓冲液(45mM，pH 7.5)和含0.2-1.2M NaCl的Tris-HCl缓冲液(45mM，pH 7.5)线性梯度洗脱，洗脱速度为2.5mL/min，每管6mL分部收集。用硫酸-苯酚法检测多糖含量，合并收集第二个组分峰，装入截留分子量为8000道尔顿的透析袋内，用去离子水透析48h以去除缓冲盐，每8h换水一次，在温度不超过105℃下干燥或者真空冷冻干燥，得单一组分的多糖，即本发明所述的胞外多糖，称为S1-A。
实施例2胞外多糖的制备
从37℃、厌氧培养48h的MRS琼脂平板上挑取新鲜培养的鼠李糖乳杆菌CGMCC No.6430菌落，转接到无菌脱脂乳培养基中，32℃培养20h，获得种子液，所述的无菌脱脂乳培养基是将10重量份脱脂乳和0.8重量份葡萄糖溶解于8重量份的水中，于115℃灭菌20分钟，冷却至25℃所得的无菌脱脂乳培养基。然后按3％体积比的接种量转接到上述无菌脱脂乳培养基中，32℃发酵30h，获得鼠李糖乳杆菌CGMCC NO.6430的发酵乳。发酵乳于100℃加热10min，待冷却至室温后，离心(4℃、14,000g、20min)除去菌体和凝结蛋白；于上清液中加入80％(w/w)的三氯乙酸至终浓度7.0％(w/v)静置过夜，离心(4℃、14,000g、20min)除去沉淀蛋白；取上清液加入3倍体积的95％乙醇，4℃静置过夜，离心(4℃、14,000g、20min)收集沉淀，溶解于去离子水中并装入截留分子量为14000道尔顿的透析袋内，用去离子水透析72h，每12h换水一次，在温度不超过105℃下干燥或者真空冷冻干燥，即得胞外多糖的粗品B。
采用DEAE-Sepharose Fast Flow(D 2.6cm×30cm)离子交换柱分离胞外多糖的粗品B，用50mM Tris-HCl(pH 7.6)缓冲液平衡柱子。胞外多糖的粗品B用上述50mM Tris-HCl(pH 7.6)缓冲液溶解后上样，依次用Tris-HCl缓冲液(50mM，pH 7.6)和含0.2-1.2M NaCl的Tris-HCl缓冲液(50mM，pH 7.6)线性梯度洗脱，洗脱速度为3.0mL/min，每管6mL分部收集。用硫酸-苯酚法检测多糖含量，合并收集第二个组分峰(图1中100-150管，图1中横坐标为管的编号，纵坐标为光吸收值)，装入截留分子量为14000道尔顿的透析袋内，用去离子水透析72h以去除缓冲盐，每12h换水一次，在温度不超过105℃下干燥或者真空冷冻干燥，即得单一组分的多糖，即本发明所述的胞外多糖，称为S1-B。
实施例3胞外多糖的制备
从37℃、厌氧培养48h的MRS琼脂平板上挑取新鲜培养的鼠李糖乳杆菌CGMCC No.6430菌落，转接到无菌脱脂乳培养基中，32℃培养20h，获得种子液，所述的无菌脱脂乳培养基是将12重量份脱脂乳和1.2重量份葡萄糖溶解于90重量份的水中，于125℃灭菌15分钟，冷却至15℃所得的无菌脱脂乳培养基。然后按5％体积比的接种量转接到上述无菌脱脂乳培养基中，28℃发酵24h，获得鼠李糖乳杆菌CGMCC NO.6430的发酵乳。发酵乳于98℃加热20min，待冷却至室温后，离心(4℃、14,000g、20min)除去菌体和凝结蛋白；于上清液中加入75％(w/w)的三氯乙酸至终浓度5.0％(w/v)静置过夜，离心(4℃、14,000g、20min)除去沉淀蛋白；取上清液加入2倍体积的100％乙醇，4℃静置过夜，离心(4℃、14,000g、20min)收集沉淀，溶解于去离子水中并装入截留分子量为5000道尔顿的透析袋内，用去离子水透析56h，每10h换水一次，在温度不超过105℃下干燥或者真空冷冻干燥，即得胞外多糖的粗品C。
采用DEAE-Sepharose Fast Flow(D 2.6cm×30cm)离子交换柱分离胞外多糖的粗品C，用55mM Tris-HCl(pH 7.8)缓冲液平衡柱子。胞外多糖的粗品C用上述55mM Tris-HCl(pH 7.8)缓冲液溶解后上样，依次用Tris-HCl缓冲液(55mM，pH 7.8)和含0.2-1.2M NaCl的Tris-HCl缓冲液(55mM，pH 7.8)线性梯度洗脱，洗脱速度为3.5mL/min，每管6mL分部收集。用硫酸-苯酚法检测多糖含量，合并收集第二个组分峰，装入截留分子量为5000道尔顿的透析袋内，用去离子水透析56h以去除缓冲盐，每10h换水一次，在温度不超过105℃下干燥或者真空冷冻干燥，即得单一组分的多糖，即本发明所述的胞外多糖，称为S1-C。
实施例4胞外多糖单一性的验证
为验证本发明所述胞外多糖的单一性，将实施例1～3收集得到的多糖样品S1-A、S1-B和S1-C在Sepharose Cl-6B(D 1.6cm×100cm)凝胶层析柱上继续分离，用含0.15M NaCl的50mM Tris-HCl缓冲液平衡柱子和洗脱。洗脱速度为0.375mL/min，15min/管分部收集，用硫酸-苯酚法检测多糖含量。
结果表明，S1-A、S1-B和S1-C三个样品均只呈现单一的对称峰，表明本发明的胞外多糖为分子量相对均一的多糖。其中，样品S1-B的凝胶色谱柱纯化结果如图2所示，其中，横坐标为管的编号，纵坐标为光吸收值。
实施例5胞外多糖的分子量测定
将实施例1～3收集得到的三个单一组分的胞外多糖样品，即S1-A、S1-B、S1-C采用高效液相色谱HPLC法测定重均分子量(Mw)。将不同分子量(5,900，9,600，21,100，47,100，107,000，200,000，708,000和1,330,000Da)的标准普鲁蓝多糖(Pullulan polysaccharides calibration kit，Agilenttechnologies，USA)相继进样，记录保留时间TR，以TR为横坐标，LgMw为纵坐标绘制标准曲线，得出分子量与保留时间TR的回归方程。待测样品按下述步骤进样，根据所得TR，通过回归方程计算样品的相对分子量。
采用Waters 2690高效液相系统，配备Waters 2410示差折光检测器和紫外检测器；选用Waters UltrahydrogelTM Linear(ID 7.8×300mm，10μm)色谱柱两柱串连。流动相：0.1M NaNO3；柱温：45℃；流速：0.9mL/min；进样量：20μL。
其中，样品S1-B的高效液相图谱如图3所示，其呈现单一对称峰，进一步说明其是均一多糖，S1-B在HPLC上洗脱曲线的保留时间为15.49min，将保留时间代入到回归方程推算出S1-B重均分子量为1,225,119Da。以相同的方法推算出S1-A、S1-C的重均分子量分别为980,543Da、1,470,237Da。
结论：CGMCC No.6430胞外多糖S1的重均分子量为980,543-1,470,237Da。
实施例6胞外多糖的单糖组成测定
采用离子色谱法测定本发明胞外多糖S1的单糖组成。
(1)多糖的水解
吸取100μL浓度为4-5mg/mL的组分S1样品溶液于5mL的具塞刻度试管中，加入100μL的4M三氟乙酸(TFA)，充氮气封管，110℃烘箱中水解2h；冷却后打开盖，加200μL甲醇后用氮气吹干，如此重复加甲醇并用氮气吹3次，去除TFA，将其残渣用水溶解定容至5mL，用0.45μm微孔膜过滤后供进样分析。
(2)离子色谱条件
色谱柱：CarboPac PA20(ID 3×150mm)
流动相：A，H2O；B，250mmol/L NaOH；
梯度洗脱；流速：0.5mL/min；脉冲安培检测器(PAD)；
进样体积：20μL；柱温：30℃
将实施例1～3中所得的S1-A、S1-B、S1-C三个样品进行上述单糖组成测定，其中S1-B单糖组成的HPAEC的色谱图如图4所示，其中，横坐标为停留时间(min)，纵坐标为intensity值(nC)。结果显示：胞外多糖S1-B主要由鼠李糖(Rhm)、葡萄糖(Glc)和半乳糖(Gal)组成。S1-A、S1-B、S1-C三个单一组分样品中单糖的质量分数比见表1。
表1 S1的单糖组成
| 样品 | 葡萄糖 | 鼠李糖 | 半乳糖 |
| S1-A(按质量百分比计) | 47.80 | 35.26 | 16.94 |
| S1-B(按质量百分比计) | 46.95 | 35.46 | 17.59 |
| S1-C(按质量百分比计) | 45.13 | 36.17 | 18.70 |
结论：CGMCC No.6430胞外多糖单一组分S1由质量分数比为45.13～47.80％的葡萄糖、35.26～36.17％的鼠李糖和16.94～18.70％的半乳糖组成。
实施例7胞外多糖的红外光谱分析
将干燥多糖S1与KBr研磨压片，在4000～500cm-1区域内进行红外光谱扫描(Nicolet Nexus 470，NICOLET，USA)。
其中，S1-B的FT-IR(傅立叶红外光谱)图谱显示出多糖类物质的特征吸收峰。在3418cm-1附近的宽吸收峰是分子内和分子间的O-H伸缩振动引起的。C-H伸缩振动和弯曲振动所吸收的峰的位置由于受其他基团的影响或多或少都有些偏移，分别出现在2931cm-1和1401cm-1附近。在1611cm-1处的吸收峰是由结合水引起的。在1200-1000cm-1区域为各种多糖的特征吸收峰，在1132、1078和1044cm-1处的吸收峰是由C-OH伸缩振动和C-O-C的弯曲振动引起的，同时表明了是吡喃型的糖苷。在914cm-1处的吸收峰是由吡喃环的非对称伸缩振动引起的，而832cm-1处的吸收峰是α-端基差向异构的C-H变角振动引起的。由此可以推断本发明的胞外多糖是α-吡喃糖苷型多糖。
实施例8胞外多糖的免疫活性测定
无菌操作取出BALB/C小鼠(购自中科院上海实验动物中心)脾脏，制成脾细胞悬液。用淋巴细胞分离液(购自上海华美生物工程公司提供)分离淋巴细胞，PBS缓冲液(每升含0.144g KH2PO4，9.0g NaCl，0.795g Na2HPO47H2O，pH7.4)洗涤2次，用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液(Gibco，USA)调整细胞浓度至1×106/mL的脾淋巴细胞悬液。96孔培养板每孔加入150μL脾淋巴细胞悬液和50μL不同浓度(10、100和1000μg/mL)的多糖样品，用有丝分裂原刀豆蛋白A(ConA，5μg/mL，Sigma)诱导T淋巴细胞增殖，设阴性对照组(只含脾淋巴细胞悬液)和阳性对照组(添加有丝分裂原ConA)。每实验组设3孔重复，置37℃，5％CO2饱和湿度条件下培养72h。
采用3H-TdR掺入法测定淋巴细胞的增殖反应。培养结束8h，每孔内加入20μL，3H-TdR(370kBq/mL)。培养结束后将各管细胞收集在49型玻璃纤维滤纸上，将纸烘干并置于闪烁液内过夜，用液闪仪(Packard，USA)测出各管的CPM值。CPM(counts per minutes)值为每分钟细胞内3H-TdR的闪烁数，由于在细胞增殖周期中，3H-TdR是细胞合成DNA，RNA的主要原料之一，因此CPM值直接反映了细胞增殖情况。
3H-TdR方法是测定脾淋巴细胞增殖的经典方法，它是基于细胞增殖周期中DNA，RNA合成增加，3H-TdR能被作为原料摄入细胞，测定细胞内3H-TdR放射量，反映了细胞增殖情况。
ConA作为T淋巴细胞有丝分裂原，促进T淋巴细胞的增殖。因此，选用ConA作为阳性对照组。本发明的胞外多糖(实施例2中的S1-B)对脾脏淋巴细胞增殖作用的结果如图5所示，其中，横坐标为胞外多糖的浓度值，单位为μg/mL，纵坐标为CPM值。与对照组ConA相比，本发明的胞外多糖能够明显地促进脾脏淋巴细胞增殖(P<0.05)，并且具有剂依赖关系。结果显示本发明的胞外多糖显示出良好的有丝分裂原活性，有潜在的免疫调节活性。
实施例9胞外多糖的甲基化分析
将多糖S1充分溶解在DMSO-NaOH体系中，与碘甲烷进行甲基化反应。经二氯甲烷萃取得到甲基化产物，再经TFA水解、还原和乙酰化反应，得到糖醇乙酰酯衍生物(PMAA)。PMAA经GC-MS分析，得到主要的离子片段。
甲基化分析结果表明：S1主要由1,3,4-α-L-鼠李糖，1,3-α-L-鼠李糖，1,2-α-D-葡萄糖，1,3-β-D-葡萄糖，1,2,3-α-L-鼠李糖和1,3,6-β-半乳糖组成，还含有少量的T-Gal和T-Glc。通过峰面积计算得到的其含量摩尔比约为1:1:1:1:1:1，Rha、Glc和Gal各单糖含量摩尔比约为2.9:1.69:1，与S1的单糖组成分析的结果基本一致。
实施例10胞外多糖的NMR分析
(一)1H NMR分析
多糖在1H NMR谱中的质子信号处于一个很狭窄的范围内，除异头碳上的质子信号在通常δ4.8～5.5易解析外，其他质子信号集中在δ4.0～4.8，信号重叠交叉严重，难以解析。S1的1H NMR谱图如图6所示。在δ4.5～5.5内，可看到有6个异头质子的信号，表明S1是由6种类型的单糖组成，这与甲基化的结果一致。在高场区δ1.29、δ1.33和δ1.35处信号峰为Rha残基的甲基质子信号，表明Rha残基有3种不同的糖苷键连接方式，这与甲基化分析结果相符。由L.rhamnosus RW-9595M的胞外多糖中丙酮酸盐(Pyruvate)的氢谱中质子信号峰可知，在δ1.46处的信号为丙酮酸盐的甲基质子的信号。
(二)13C NMR分析
多糖S1的13C NMR谱图如图7所示，从13C NMR图谱可知，在高场区，δ19.66、δ19.51和δ19.40为Rha的6位甲基碳的信号，说明糖单元中含有3种鼠李糖糖残基，在δ28.07为丙酮酸盐中甲基碳的信号峰；在低场区，δ178.98的信号为丙酮酸盐羰基(C＝O)碳的特征信号，而在δ90～110共振信号区δ103.50为丙酮酸盐中2位碳的信号。在δ90～110的共振区出现的信号是异头碳的信号，从图上可以看出有6个异头碳信号，说明糖单元由6个糖残基组成，从左至右分别标记A-F。135°DEPT 13C NMR谱图可以区分CH3、CH2，从多糖S1的135°DEPT 13C NMR谱图(图8)上可以看出在δ62.71、63.12、63.89和67.77处的信号峰为CH2的信号峰。
(三)2D NMR分析
COSY谱反映了同一糖环中相邻氢核之间的耦合关系，可以用来归属直接相连的氢。而HSQC谱则是反映的直接相连的碳、氢之间的耦合关系，可以用来归属直接相连的碳氢。S1的HSQC谱和COSY45谱图如图9、图10所示。
首先，在HSQC谱图上从异头碳端开始标记，6个异头碳分别标记A1、B1、C1、D1、E1和F1，从而找到对应的异头氢。然后，在COSY图谱上做交叉峰就可以找到H2、H3、H4等。对于难找的H5和H6，可以先综合分析TOCSY谱(图11)和NOESY(Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy Y)(图12)，然后再通过在HSQC谱中找到相连的C2-C6等信号来确定H5和H6的质子峰，这样所有碳氢的信号都得到了归属。最后，在S1的HMBC谱图(图13)上找相关联的C和H，分析不同糖单元间的连接次序。
综合以上谱图分析，结合S1甲基化的结果，S1糖残基的1H和13C NMR的化学位移归属结果见表2和表3。
表2 EPS S1糖残基的1H NMR的化学位移(D2O,25℃)
表3 EPS S1糖残基的13C NMR的化学位移(D2O,25℃)
实施例11多糖S1的一级结构表征
综合以上S1的1D和2D NMR谱图分析结果，再结合单糖组成、红外光谱、甲基化分析，推断S1具有的结构特征为：
1)S1含有1,2-α-D-Glc，1,3,4-α-L-Rha，1,3-Rha，1,2,3-α-L-Rha，1,3-β-D-Glc和1,3,6-β-D Gal按1:1:1:1:1:1比例构成的主链。
2)在1,3,6-β-D-Gal的6位有分支，在6位连接着丙酮酸盐。
3)在1,3,4-α-L-Rha的4位和1,2,3-α-L-Rha的2位在谱图未显示有相关的连接信号。在DEPT谱中有一个很弱的亚甲基信号，可能是端基碳的亚甲基信号，同时在甲基化分析中含有T-Gal和T-Glc的信号，但在谱图上未有相关的峰。同时含有大量的丙酮酸根，可能与端基糖反应或者与1,3,4-α-L-Rha的4位和1,2,3-α-L-Rha的2位形成酯。
综合前述可知，本发明所述的鼠李糖乳杆菌的胞外多糖，由质量分数比为45.13～47.80％的葡萄糖、35.26～36.17％的鼠李糖和16.94～18.70％的半乳糖组成，该胞外多糖包含如式I所示的结构单元，
→1)-α-D-葡萄糖(2→1)-α-L-鼠李糖(3→1)-α-L-鼠李糖(3→1)–(接下行)
α-L-鼠李糖(3→1)-β-D-葡萄糖(3→1)-β-D-半乳糖(3→
该胞外多糖的平均重量分子量为98万～147万道尔顿。
所述的胞外多糖包含由1,2-α-D-葡萄糖，1,3,4-α-L-鼠李糖，1,3-鼠李糖，1,2,3-α-L-鼠李糖，1,3-β-D-葡萄糖和1,3,6-β-D半乳糖按1:1:1:1:1:1比例构成的主链，在所述的1,3,6-β-D半乳糖的6位连接着丙酮酸盐。
对比例1本发明的胞外多糖与该胞外多糖的粗品的免疫活性的比较
根据实施例8所述的方法，测定添加ConA、胞外多糖的粗品B和单一组分的胞外多糖S1-B为样品与脾淋巴细胞反应管内的CPM值，并以ConA为对照，计算本发明的胞外多糖与该胞外多糖的粗品对脾淋巴细胞的增强百分比。增强百分比(％)表示为(CPM样品-CPM对照)/CPM对照×100。
测定了三种浓度(10μg/mL、100μg/mL和1000μg/mL)下对T淋巴细胞增殖促进作用的百分率。结果如下表所示：
由上表的结果可以看出，与成分复杂的胞外多糖粗品相比，单一组分的胞外多糖S1-B对脾淋巴细胞的促增殖作用比更强，效果更显著。
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种鼠李糖乳杆菌的胞外多糖，其特征在于，所述胞外多糖由质量分数比为45.13～47.80％的葡萄糖、35.26～36.17％的鼠李糖和16.94～18.70％的半乳糖组成，该胞外多糖由式I所示的重复结构单元组成，
该胞外多糖的平均重量分子量为98万～147万道尔顿。
2.如权利要求1所述的胞外多糖，其特征在于，所述的胞外多糖由保藏号为CGMCC NO.6430的鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)菌株所产生。
3.一种如权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌的胞外多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将保藏编号为CGMCC No.6430的鼠李糖乳杆菌的种子液以体积比1.0～5.0％的接种量接种于无菌脱脂乳培养基，于28～36℃培养24～40小时得发酵液；
(2)将步骤(1)所得的发酵液在95～100℃加热10～30min，冷却至15～25℃后静置3～16小时，离心取上清并向所述上清中加入三氯乙酸溶液至终浓度为5～8％，静置8～16小时，离心获得发酵上清液；所述百分比为每100毫升中含有的三氯乙酸的克数，所述三氯乙酸溶液是质量百分数为75～85％的三氯乙酸溶液；
(3)向步骤(2)所得的发酵上清液中加入2～4倍体积的体积百分数为80～100％的乙醇，离心或过滤收集沉淀物并将沉淀物溶于水，用截留分子量为5000～14000道尔顿的透析袋在水中透析48～72小时，每8～12小时换水一次，在温度不超过105℃下干燥或者真空冷冻干燥，即得所述胞外多糖的粗品。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的无菌脱脂乳培养基是将10～12重量份脱脂乳和0.8～1.2重量份葡萄糖溶解于85～90重量份的水中，于115～125℃灭菌15～20分钟，冷却至15～25℃所得的无菌脱脂乳培养基；所述的接种量是2.0～4.0％，发酵的时间是24～36小时。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的接种量是2.0～2.5％，发酵的时间是28～32小时。
6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的加热为将步骤(1)所得的发酵液在95～100℃加热15～20min；所述的三氯乙酸的质量百分数为78～82％。
7.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的乙醇的体积百分数为82～90％；所述透析袋的截留分子量为12000～14000道尔顿。
8.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，其还包括步骤(4)：所述的步骤(4)为：采用离子交换层析柱对步骤(3)所得的胞外多糖的粗品进行分离纯化，依次以45～55mM，pH 7.5～7.8的Tris-HCl缓冲液和含0.2～1.2M NaCl的45～55mM，pH 7.5～7.8的Tris-HCl缓冲液进行线性梯度洗脱，洗脱速度为2.5～3.5mL/min，合并收集第二个组分峰的洗脱产物，装入截留分子量为10000～15000道尔顿的透析袋在去离子水透析中48～72小时，每8～12小时换水一次，在温度不超过105℃下干燥或者真空冷冻干燥，即得所述胞外多糖。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(4)为：采用DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱对步骤(3)所得的胞外多糖的粗品进行分离纯化，所述离子交换层析柱的规格为D 2.6cm×30cm，依次以50mM，pH 7.6的Tris-HCl缓冲液和含0.5～1.0M NaCl的50mM，pH 7.6的Tris-HCl缓冲液进行线性梯度洗脱，洗脱速度为3mL/min，合并收集第二个组分峰的洗脱产物，装入截留分子量为14000道尔顿的透析袋在去离子水透析中72小时，每8小时换水一次，在温度不超过105℃下干燥或者真空冷冻干燥，即得所述胞外多糖。
10.如权利要求1所述的胞外多糖在食品、医药和相关领域的应用。
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