CN104475756A

CN104475756A - 一种利用悬浮蛋白MrpC制备纳米银的方法

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Publication number: CN104475756A
Application number: CN201510003093.8A
Authority: CN
Inventors: 章军; 刘默; 秦灵靓; 牛洋洋; 于昌平; 周丛照; 郑天凌; 徐虹
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2015-01-06
Filing date: 2015-01-06
Publication date: 2015-04-01

Abstract

一种利用悬浮蛋白MrpC制备纳米银的方法，涉及一种藻细胞分泌蛋白。提供利用具有分散功能的蛋白替代传统的化学分散剂，成本低、稳定性高、绿色环保的一种利用悬浮蛋白MrpC制备纳米银的方法。将铜绿微囊藻接种于BG-11培养基培养，再提取悬浮蛋白MrpC；将MrpC与AgNO₃溶液混合后再加入到NaBH₄溶液中反应后，即得纳米银。以MrpC蛋白为分散剂替代传统的化学分散剂，利用化学还原法合成分散稳定性良好的纳米银颗粒。MrpC蛋白无污染，去除简单，蛋白酶处理可使其有效降解，对需要避免外物干扰的反应具有独特优势。MrpC为新型悬浮剂和分散剂的开发提供选择。

Description

一种利用悬浮蛋白MrpC制备纳米银的方法

技术领域

本发明涉及一种藻细胞分泌蛋白，尤其是涉及一种利用悬浮蛋白MrpC制备纳米银的方法。

背景技术

纳米材料是一种迅速发展的新兴材料，由于其特有的性质，在很多领域都有非常广泛的应用，而其中又以纳米银的研究最为热门，如何简单快速，绿色低成本的制备出合格的纳米银材料，已经引起相关学者的密切关注。

纳米银是指粒径为1-100nm的金属银单质，是一种新兴的功能材料。由于其独特的热、光、电、磁等特性和很大的表面积以及表面活性，它在电、光、热、磁学、催化、生物和医药方面均有广泛的应用和前景。

目前纳米银的制备方法主要有化学法、物理法和生物还原法。物理法制备质量高，产品杂质少，主要可分为蒸发凝聚法、离子溅射法、机械研磨法以及光照法,优点是原理简单，产品杂质少，质量高。缺点是对仪器设备要求比较高，生产代价高昂。

化学法操作简单，易控制，获得的纳米银具有较好的分散性，形貌比较均匀，缺点是产品表明容易产生杂质，粒径分布宽，并且制备过程往往用到外部还原剂和有机溶剂，还需添加分散剂以防止银单质聚团。化学还原法是制备纳米银的常用方法，利用化学还原法将Ag从银盐中还原出来，从而制备出纳米银粒子。

微生物法主要有酶催化法和非酶还原法，前者通过微生物体所产生的酶起催化作用，作为电子传递体将氢气、甲基酸盐等还原性物质的电子传递给银离子，使之被还原；后者通过微生物细胞表面的某些含氧基团经物理化学作用使溶液的银离子被还原，反应过程不依赖于微生物的生物活性。优点是原料廉价易得，反应条件温和、毒副产物少，不易团聚，缺点是缺乏高效菌株，引入细菌导致产品纯度不高。

聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone)简称PVP，作为一种合成水溶性高分子化合物，具有水溶性高分子化合物的一般性质：胶体保护作用、成膜性、粘结性、吸湿性、增溶或凝聚作用。在纳米银的化学还原法制备过程中，PVP经常作为分散剂以防止银颗粒聚集沉降。

铜绿微囊藻是中国湖泊、水库等淡水系统中形成水华的主要优势藻类。本发明人发现铜绿微囊藻胞外分泌蛋白MrpC具有良好的悬浮功能，其显著影响着细胞的悬浮状况，被认为是重要的浮力影响因子。

MrpC具有悬浮特性，一定浓度下可克服重力阻止蓝藻细胞，大肠杆菌及琼脂糖等多种固体颗粒的下沉。而且其悬浮作用没有特异性，通过研究表明其悬浮性并不通过与细胞结合或粘度来实现。其在溶液中呈纤维状聚集，长度可达几十至几百微米，一定浓度下形成网状结构，具备一定的承托力将固体颗粒承托，限制其沉降运动，使其保持一定的悬浮状态。

发明内容

本发明的目的在于提供利用具有分散功能的蛋白替代传统的化学分散剂，成本低廉、稳定性高、绿色环保的一种利用悬浮蛋白MrpC制备纳米银的方法。

本发明包括以下步骤：

1)将铜绿微囊藻接种于BG-11培养基培养，再提取悬浮蛋白MrpC；

在步骤1)中，所述将铜绿微囊藻接种于BG-11培养基培养可将铜绿微囊藻按1∶50接种于BG-11培养基培养，所述培养可在28℃持续光照摇床培养1个月；所述提取可采用硫酸铵沉淀法提取；

所述悬浮蛋白MrpC的理化特性如下：

MrpC纯品呈白色，易溶于水和PBS，不溶于乙醇、甲醇、丙酮等有机溶剂。重金属盐：硝酸银，碘化镉，硝酸铅，硫酸锰，硝酸钴等都会使MrpC变性；

mrpC基因序列如下：

1 ATGAAGGCCT CTAATTACCA AGAAATCGCC AGAGGAGCTA TTCTAGCCGG TGGTCTCGCC

61 GCTGCGGGTG TATTATCCGT TGGCGAAGGG GCCCAAGCCC AATTTATCGG TACAGCATCC

121 CAATCCCGAG TGTCCGCTGC CACCACTAGC ATTCTCACCG ACGGCAACAC TGCAGCCACC

181 AATAGCTTTG CCGTTGAGCA GGTTTTGCCT GCTGCTGACT ATGTTTTCAG TTCTCCTATT

241 TCAGTACAAA TAAGTTACGA TACCCTTACC CTAGCTAAGG ACAAAAACTT CGTTGCTATT

301 ACGGGCGCAG TATTGACCGC TACGGTGGAG GTAAACTCAG GTACGCAACT AACAGTTGAG

361 CGTGCCACTG CTGATGCTAT TTCGCAGGCT GCTGCTGCCA GTCAGTTTGG GGATGTGTCT

421 GGTATCGTCC GGGCTTGGAC TGCTGGTACT TCCGTCTTAG ATTAG

MrpC氨基酸序列如下：

1 MKASNYQEIA RGAILAGGLA AAGVLSVGEG AQAQFIGTAS QSRVSAATTS ILTDGNTAAT

61 NSFAVEQVLP AADYVFSSPI SVQISYDTLT LAKDKNFVAI TGAVLTATVE VNSGTQLTVE

121 RATADAISQA AAASQFGDVS GIVRAWTAGT SVLD

所述mrpC基因序列，基因全长465bp，起始密码子为ATG(下划线)，终止子是TAG(下划线)；蛋白质的一级结构就是蛋白质多肽链中氨基酸残基的排列顺序，由基因上遗传密码的排列顺序所决定的；利用DNAman分析获得MrpC氨基酸序列全长154aa，与文献预测序列一致；MrpC为胞外分泌蛋白，N末端包含33aa信号肽(下划线)，第34位aa谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸(Zilliges,Kehr et al.2008)。

2)将MrpC与AgNO₃溶液混合后再加入到NaBH₄溶液中反应后，即得纳米银。

在步骤2)中，所述反应的条件可在常温下磁力搅拌10min，反应式如下：

2AgNO₃+2NaBH₄+6H₂O＝2Ag+2NaNO₃+2B(OH)₃+7H₂

所制得的纳米银可采用以下方法表征：

所述化学还原法制备纳米银的过程中常需加入分散剂如：PVP，PVA，以限制纳米银颗粒的聚集和沉降，得到纳米级数的银颗粒。MrpC具有良好的悬浮和分散特性，为了探究MrpC对纳米粒子的悬浮效果，以MrpC对比传统的PVP作分散剂进行化学还原法制备纳米银的实验作比较。整个反应于常温进行，将一定量的PVP或MrpC与AgNO₃溶液混合缓慢滴加到NaBH₄溶液，磁力搅拌10min。

透射电镜(TEM)：取数滴纳米银颗粒溶液滴加于铜网网格上，然后晾干待测。直接观察纳米银颗粒的形貌、分散情况，估测平均粒度大小。

所述纳米银溶液稳定性观察是将所得纳米银溶液样品正置在4℃冰箱，隔1，3，5，7天后分别观察样品的颜色变化和沉降情况，以此判断溶液稳定性。

所述纳米银溶液抑菌活性实验是将制备获得的纳米银溶液样品与PBS稀释过的大肠杆菌与金黄色葡萄球菌等体积混合，作用30min后，取200μl混合后的菌液涂布到LB培养基上，37℃培养14～18h后计菌落数得抑菌率。

抑菌率计算：X＝(A-B)/A×100％

其中：X——抑菌率，A——对照样品中的平均菌落数，B——被试样品的平均菌落数。

本发明首次以MrpC蛋白为分散剂替代传统的化学分散剂，利用化学还原法成功合成了分散稳定性良好的纳米银颗粒。纳米银材料在电子、光学、抗菌和催化等方面具有十分优异的性能，具有广阔的应用前景。MrpC蛋白无污染，去除简单，蛋白酶处理可以使其有效降解，对于一些需要避免外物干扰的反应具有独特优势。MrpC为新型悬浮剂和分散剂的开发提供一定的选择，可应用于需要用到化学分散剂的食品、医药、农药和纳米材料等行业。

本发明将MrpC蛋白应用于纳米银的制备，通过对比MrpC与传统分散剂PVP对纳米银制备效果(电镜表征颗粒大小与均一度，溶液稳定性等)以及抗菌活性效果分析，为纳米银等纳米材料的制备提供了新的方法。

本发明使用的MrpC蛋白完全有可能在化学还原法制备纳米银的过程中替代传统的化学分散剂PVP等，可以作为新的分散剂存在，其在颗粒大小和均一度上可以媲美传统的制备方法，而且制备的纳米银具有良好的抑菌活性；另外由于MrpC蛋白自身稳定悬浮特性等原因，所得纳米银溶液的稳定性要高于传统方法制备所得。

悬浮蛋白MrpC是新发现的一种(类)具有天然悬浮功能的蛋白质，它来源于微藻培养基，是微藻自身分泌的蛋白质，在溶液中呈网络化结构，从而使溶液中的细胞或微颗粒呈悬浮状态，阻止溶液中的细胞或微颗粒下沉或上浮。该(类)蛋白具有悬浮性好，无毒害，易于生物降解，以及良好的广谱悬浮特性，可替代传统的化学分散剂用于但不限于制备纳米银，可应用于制药、农药生产、蛋白质和细胞分离以及纳米材料的合成等方面。

附图说明

图1为提取的分泌蛋白的SDS-PAGE分析和anti-MrpC-IgG特异性检测。在图1中，M：marker；1：提取的M.aeruginosa PCC7806分泌的蛋白组分；2：对去藻长时间培养物的westernblotting检测。

图2为M.aeruginosa PCC7806分泌蛋白MALDI-TOF-MS肽指纹图谱。

图3为纳米银合成溶液。a:无分散剂(银离子浓度为0.7mM)；b:MrpC 10mg/L，银离子浓度0.7mM；c:MrpC 10mg/L，银离子浓度0.1mM；d:MrpC 100mg/L，银离子浓度0.1mM。

图4为MrpC作为分散剂时不同浓度条件下纳米银颗粒的TEM以及粒径分布图比较。

图5为PVP(左图)和MrpC(右图)作分散剂制备的纳米银溶液一周内变化情况。

从上到下分别为第1，3，5，7天的纳米银水溶液，从左至右分别为:

(A，E)Ag+0.2mM,不添加分散剂 (B)Ag+0.2mM,PVP 5mg/mL

(C)Ag+0.2mM,PVP 10mg/mL；(D)Ag+0.2mM,PVP 20mg/mL

(F)Ag+0.2mM,MrpC 1mg/L (G)Ag+0.2mM,MrpC 10mg/L

(H)Ag+0.2mM,MrpC 20mg/L (I)Ag+0.2mM,MrpC 40mg/L

具体实施方式

下面由实施例对本发明作进一步的说明。

步骤一 MrpC悬浮蛋白的分离提纯

1.藻细胞的培养

将铜绿微囊藻Microcystis aeruginosa PCC 7806按1∶50接种于新鲜配制BG-11培养基，28℃持续光照摇床培养。

2.硫酸铵盐析法沉淀蛋白

(1)取培养时间大于两个月藻液高速离心去藻；

(2)得到的去藻培养物再过滤一次；

(3)滤液中定量缓慢加入研磨成细粉状并干燥无水的硫酸铵，并不停搅拌，可用磁力搅拌，直到有蛋白沉淀析出；

(4)12000g离心蛋白沉淀，上清继续加入硫酸铵沉淀蛋白，分批获得蛋白，方法同上，直至溶液中硫酸铵的溶解度为100％。

(5)蛋白沉淀用一定体积的PBS溶解，再高速离心一次，弃去沉淀杂质，上清即为蛋白溶液。

硫酸铵盐析法沉淀去藻培养基中的蛋白，在加入硫酸铵的量约为其溶解度的5％时得到的蛋白沉淀对抑制藻沉底效果显著，该蛋白沉淀用PBS溶解，-20℃保存。通过SDS-PAGE检测只有一条带，说明得到蛋白质较纯，经MALDI-TOF-MS鉴定只有1077.461m/z和949.434m/z两个峰，在matrix数据库中搜索的结果得分较低，但与已经发现的M.aeruginosa PCC 7806的一个分泌蛋白质MrpC的MALDI-TOF-MS峰谱一致，证明该提取蛋白为Mrp C。

提取的分泌蛋白的SDS-PAGE分析和anti-MrpC-IgG特异性检测参见图1。M.aeruginosaPCC7806分泌蛋白MALDI-TOF-MS肽指纹图谱参见图2。

步骤二 MrpC应用于纳米银颗粒的制备(化学还原法)和制备效果分析

(一)化学还原法制备纳米银

将一定量的NaBH₄溶液加入MrpC溶液中，室温下置于磁力搅拌器上搅拌均匀。室温下缓慢加入AgNO3溶液(1滴每秒)后，700rpm磁力搅拌10min，反应结束后将溶液4℃存储备用。

紫外可见吸收光谱(UV-Vis)分析：找到最大吸收波长位置，分析纳米银胶体的外观颜色与平均粒度和最大吸收波长的关系。测量模式：波长扫描；扫描速度：600nm/min；狭缝宽度：1nm。

透射电镜(TEM)：取数滴纳米银颗粒溶液滴加于铜网网格上，然后晾干待测。直接观察纳米银颗粒的形貌、分散情况，估测平均粒度大小。加速电压：100KV

实验合成方法于常温下进行，合成反应速度快，10min即可完成反应。实验中使用的硝酸银、硼氢化钠、MrpC溶液都为无色液体。

当银浓度为0.7mM时，不加任何分散剂的对照组溶液很快变成黑色，TEM显示银颗粒团聚现象较为严重。而添加MrpC(10mg/L)的溶液则变为黄棕色，TEM结果显示溶液中合成了分散度良好，平均直径约50nm的银颗粒，说明MrpC对所制备的银纳米颗粒起保护作用，能有效阻止银颗粒间的团聚，将银粒子尺寸控制为纳米级。实验中合成的纳米银溶液悬浮性良好，4°保存一个月以上未生成沉淀物。不同的纳米银溶液颜色有所差异，d溶液颜色最浅，纳米粒子粒径尺寸的不同会导致颜色的差异。

当银浓度一定(0.2mM)，MrpC浓度由1mg/L增大至40mg/L，纳米银粒径尺寸分布范围有变小趋势，主要在5-15nm之间，平均直径约为10nm，说明MrpC能有效控制纳米粒子的尺寸，在一定的范围内高浓度的MrpC有利于获得粒径较小的纳米银粒子。

制备过程中添加MrpC对银胶起到了保护作用，防止了颗粒的长大和粒子间的团聚，从而粒子具有更窄的粒径和更好的分散性，并在其周围形成的稳定的环境。当银离子过多时会使得反应体系中形成的纳米银微粒数量增加，使得微粒之间的碰撞频率增加，抵消了MrpC对形成粒子的保护作用，从而导致颗粒之间发生聚集形成大尺寸的纳米颗粒。改变银离子的量或MrpC浓度都可以改变纳米银颗粒的尺寸。

纳米银合成溶液参见图3。

MrpC作为分散剂时不同浓度条件下纳米银颗粒的TEM以及粒径分布图比较参见图4。

(二)纳米银溶液稳定性比较

由PVP和MrpC分别作为分散剂制备的纳米银水溶液一周内颜色变化和沉降情况(图5)可知，不添加分散剂的溶液立即显灰黑色，并颜色逐渐加深，在第五天时溶液变为黑色，第七天就有沉淀产生。PVP作分散剂的纳米银溶液，在反应结束后呈金黄色，但是随着时间的延长，溶液颜色有加深的现象，而且PVP添加量少的颜色变化越快，如银浓度为0.2mM,PVP浓度为5mg/mL的溶液在第三天逐渐变为酒红色，另外PVP浓度为10mg/mL和20mg/mL的纳米银溶液颜色也在逐渐加深。但是MrpC作分散剂制备的溶液随着时间的变化并不明显，仅MrpC浓度为1mg/L的溶液颜色有轻微加深。

从上述的纳米银溶液颜色变化情况来看，影响纳米银稳定性的可能原因有以下两点：第一，纳米银颗粒的粒径大小可能对纳米银的稳定性有影响，平均粒径越大的纳米银溶液稳定性越低，纳米银颗粒越大的溶液聚团导致溶液颜色变化和产生沉淀；第二，不同的分散剂种类可能对纳米银的稳定性有影响，通过上述结果，可以看出MrpC作分散剂制备的纳米银水溶液在稳定性上明显高于PVP。

(三)纳米银抑菌活性实验

表1.不同分散剂制备的纳米银溶液对大肠杆菌的抑菌效果

表2.不同分散剂制备的纳米银溶液对金黄葡萄球菌的抑菌效果

抑菌实验结果(表1，2)表明，纳米银颗粒溶液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有很强的抑菌性。经不添加分散剂所得的纳米银颗粒溶液处理过后的大肠杆菌抑菌率为67.41％；经过PVP或MrpC作分散剂得到的纳米银颗粒溶液处理过后的大肠杆菌，几乎没有菌落生长，抗菌率极高，而且MrpC作分散剂所得的纳米银颗粒溶液的抑菌效果并不弱于甚至还稍强于PVP(前者抑菌率为96.92％，后者为95.57％)，这说明在抑菌活性上MrpC并没有对纳米银颗粒产生不良影响。值得注意的是，经不添加分散剂所得的纳米银颗粒溶液处理过后的金黄色葡萄球菌的抑菌率达72.59％；经过PVP或MrpC作分散剂得到的纳米银颗粒溶液处理过后的金黄色葡萄菌，完全没有菌落生长的迹象，抑菌率为100％。根据以上抑菌实验结果，纳米银的抑菌作用明显，并且纳米银溶液对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的抑菌效果要好于革兰氏阴性菌大肠杆菌，与相关文献报道的情况相符。而且，对比MrpC和PVP作分散剂所得溶液的抑菌效果，两者并无差别，MrpC完全可取代PVP成为新的纳米银制备的分散剂。

Claims

1.一种利用悬浮蛋白MrpC制备纳米银的方法，其特征在于包括以下步骤：

2.如权利要求1所述一种利用悬浮蛋白MrpC制备纳米银的方法，其特征在于在步骤1)中，所述将铜绿微囊藻接种于BG-11培养基培养是将铜绿微囊藻按1∶50接种于BG-11培养基培养。

3.如权利要求1所述一种利用悬浮蛋白MrpC制备纳米银的方法，其特征在于在步骤1)中，所述培养是在28℃持续光照摇床培养1个月。

4.如权利要求1所述一种利用悬浮蛋白MrpC制备纳米银的方法，其特征在于在步骤1)中，所述提取采用硫酸铵沉淀法提取。

5.如权利要求1所述一种利用悬浮蛋白MrpC制备纳米银的方法，其特征在于在步骤1)中，mrpC的基因序列如下：

6.如权利要求1所述一种利用悬浮蛋白MrpC制备纳米银的方法，其特征在于在步骤1)中，MrpC的氨基酸序列如下：

7.如权利要求1所述一种利用悬浮蛋白MrpC制备纳米银的方法，其特征在于在步骤2)中，所述反应的条件是在常温下磁力搅拌10min。